專利名稱：一種測定倍他米松的直接競爭酶聯(lián)免疫測定試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，為食品安全，藥物檢測試劑。具體而言，本
發(fā)明利用免疫反應(yīng)的高靈敏性和特異性，以及酶促反應(yīng)的放大效應(yīng)和易檢測性，建立起來 的一種檢測倍他米松的酶聯(lián)免疫測定試劑盒。
技術(shù)背景倍他米松(Betamethasone, Bet)是糖皮質(zhì)激素可的松類的衍生物，也 是地塞米松的同分異構(gòu)體.是醫(yī)學(xué)臨床運用最廣泛的強效皮質(zhì)激素之一?？傻乃深惣に赝?常用來治療過敏性和嚴(yán)重感染性疾病，具抗炎和抗過敏的作用。這類激素尚有剌激食欲，增 加肝糖原合成，升高血糖等作用。但這類激素在食物中殘留，對人有潛在的危害，故歐盟等 國都禁止倍他米松，氟美松等作為牲畜的促生長劑，在畜牧業(yè)中使用。 歐盟禁用并且建立最大殘留限量(maximum residulimits，MRLs)，對倍他米松為 肝臟2 ii g/kg ;肌肉0. 75 ii g/kg ;牛奶0. 3 ii g/L。 糖皮質(zhì)激素類常用的檢測方法有薄層色譜、免疫分析法、液相色譜、氣相色譜、質(zhì) 譜或串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)等。 薄層色譜靈敏度低，僅可檢測出微克g)級以上的樣品。不能滿足食品中殘留 倍他米松的檢測要求。 氣相色譜法(GC):由于糖皮質(zhì)激素中含有多個極性基團(tuán)、不揮發(fā)、熱穩(wěn)定性差，因 此不適于直接進(jìn)行GC分析。必須對糖皮質(zhì)激素結(jié)構(gòu)中基團(tuán)進(jìn)行的衍生化處理后，包括硅烷 化、酰化等，才能測定。 液相色譜法(LC):液相色譜對糖皮質(zhì)激素的檢測通常用配有紫外檢測器的液相 色譜，包括反相色譜和正相色譜，用來檢測血漿中的倍他米松。此外，也有用反相和正相色 譜，同時檢測多種糖皮質(zhì)激素。最低檢出限一般可達(dá)10ug/kg。雖然該方法的靈敏度基本可 以達(dá)到獸藥殘留檢測要求，但僅適用于部分化合物，同時不能進(jìn)行定性確認(rèn)。
氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS):在激素的殘留檢測確認(rèn)技術(shù)中，氣相色譜(GC)與質(zhì) 譜(MS)的串聯(lián)技術(shù)是最常選用的技術(shù)。從上世紀(jì)90年代以后，絕大多數(shù)歐盟參考實驗室 都引入了 GC-MS方法，用于監(jiān)控畜禽產(chǎn)品中類固醇激素殘留。該技術(shù)集中了氣相色譜高的 色譜分辨率和質(zhì)譜技術(shù)的特異性、選擇性。由于激素類物質(zhì)的揮發(fā)性不夠，因此，在選擇用 GC-MS分析激素類物質(zhì)時，也必須進(jìn)行衍生化處理。 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS):液相色譜_質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)，或多級聯(lián)用技術(shù) (LC-MS-MS)其檢測靈敏度高，能對各糖皮質(zhì)激素微量殘留進(jìn)行檢測，是目前檢測食品中糖 皮質(zhì)激素殘留確證檢測的最佳方法之一。氣相色譜和氣相色譜-質(zhì)譜技術(shù)都要求對樣品進(jìn) 行衍生化處理，樣品的前處理相對比較麻煩，而液相色譜技術(shù)對化合物的定性確認(rèn)又比較 困難，液相色譜_質(zhì)譜技術(shù)，不需要樣品衍生化，而且能夠定性確認(rèn)，這已經(jīng)成為分析糖皮 質(zhì)激素的主要手段。其檢測限也可過0.5ug/L。 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)，液相色譜_質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)或多級聯(lián)用技術(shù)如 LC-MS-MS，其設(shè)備要求高，技術(shù)難度大，對技術(shù)人員要求高。本發(fā)明試劑盒利用酶聯(lián)免疫測 定原理，定量檢測動物組織，血液，膽汁，尿液中的倍他米松殘留，不需要昂貴的儀器投入， 一般中等文化水平的人員，經(jīng)過短期培訓(xùn)，就可掌握此檢測方法。該試劑盒檢測多種樣品中的倍他米松，其線性范圍為0. lng/ml 20ng/ml，最低檢測限可達(dá)0. lng/ml。可滿足食品 中倍他米松殘留的監(jiān)測。 為食品中倍他米松殘留，提供了一種高效，快速，特異的檢測方法
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供一種快速檢測倍他米松的酶聯(lián)免疫試劑盒。其生產(chǎn)的倍他 米松試劑盒，線性范圍為0. lng/ml 20ng/ml， IC5。為3ng/ml左右，靈敏度為0. lng/ml。穩(wěn) 定期在6個月以上(4t:冰箱保存)。該發(fā)明包括免疫原的合成，動物的免疫，特異性抗體的 制備，試劑盒的裝配和調(diào)試，試劑盒各種參數(shù)的確定及樣品的處理和測定。
倍他米松，化學(xué)名9a-氟-lie ，17a ，21-三羥基-16|3-甲基孕甾-1，4-二烯-3， 20- 二酮。英文Betamethasone,縮寫為Bet，分子量392. 45，為小分子物質(zhì)，不具有免疫原 性而僅具有免疫反應(yīng)性，要生產(chǎn)倍他米松的酶聯(lián)免疫測定試劑盒，必須要制備對倍他米松 有高度特異性的抗體。要獲得對倍他米松有高度特異性的抗體，首要條件是要有一個能激 發(fā)動物產(chǎn)生抗體的抗原。因此，免疫原的制備最為重要。其解決的方案是倍他米松共價連 接上一個大分子物質(zhì)，通常是與一種蛋白質(zhì)交聯(lián)。常用的有牛血清白蛋白，卵清蛋白，甲狀 腺球蛋白，大鑰匙孔狀槭血藍(lán)蛋白等，本發(fā)明公開一種制備倍他米松免疫原的方法。首先用 一羥胺化合物，羧甲基羥胺，修飾倍他米松，生成倍他米松_3-羧甲基肟，Bet-3-CM0，后者 與N-羥基丁二酰亞胺相聯(lián)，用二環(huán)己碳二亞胺(DCC)或水溶性碳二亞胺{1-乙基_3-(3-二 甲氨丙基)_碳二亞胺，EDAC ; 1-環(huán)己-3- (2-瑪啉-4-乙基)碳二亞胺對甲基苯亞磺酸鹽， CMEC}催化，使之活化，然后與載體蛋白分子中游離胺基相連，生成免疫原?；蛘弑端姿?21位琥珀酸化后，與載體蛋白相聯(lián)為免疫原(見后)。 有了免疫原，第二步就是用免疫原免疫動物，本發(fā)明是免疫1.5 2kg大小的新西 蘭雌性家兔，獲得對倍他米松有特異性反應(yīng)的多克隆抗體。本發(fā)明提供一種能產(chǎn)生高滴度 抗體的免疫方案。 為了檢測特異性抗體，建立直接競爭競爭酶聯(lián)免疫測定，必須合成倍他米松與一 種酶交聯(lián)的抗原_酶交聯(lián)物(酶標(biāo)抗原)，交聯(lián)的酶包括辣_根過氧化物酶，堿性磷酸酶， P _半乳糖苷酶等。本發(fā)明公開一種合成倍他米松與酶交聯(lián)的方法，首先倍他米松在21位 上琥珀酰化生成倍他米松-21-琥珀酸半酯，然后用混合酸酐法生成一個混合酸酐，再與酶 交聯(lián)，以制備酶標(biāo)抗原?；虮端姿缮葿et-3-CM0后，與與酶相聯(lián)，為酶標(biāo)抗原(如上)。
在以上基礎(chǔ)上，組裝檢測試劑盒。用聚苯乙烯96孔或48孔酶標(biāo)板，包被二抗。(選 用羊抗兔抗體，有商品供給。選用效價高，一般在l : 1000 2000，穩(wěn)定性好的二抗)。
優(yōu)化包被濃度，抗體濃度，酶標(biāo)抗原濃度，使之達(dá)到檢測要求。
本發(fā)明提供組成試劑盒相關(guān)試劑及組裝流程 (1)用選購的二抗包被酶標(biāo)板。(2)孵育后洗滌去未吸附上的多余二抗。(3)用 另一種蛋白封閉板上未吸附二抗的多余位點，以減少測定時的非特異性吸附。(4)提供倍 他米松抗體和酶標(biāo)抗原濃縮液。(5)提供抗體和酶標(biāo)抗原應(yīng)用稀釋液。(6)提供濃縮洗滌 液(7)提供倍他米松的標(biāo)準(zhǔn)液，用樣品制備液配7個標(biāo)準(zhǔn)0ng/m1，0. lng/m1，0. 5ng/ml， 1. 0ng/ml，5. 0ng/ml， 10. 0ng/ml，20. Ong/ml (8)提供酶顯色緩沖溶液和酶反應(yīng)底物液，本試 劑盒所用的酶反應(yīng)底物為H202和四甲基聯(lián)苯胺(TMP) ， H202配于顯色緩沖溶液中，四甲基聯(lián) 苯胺(TMP)單獨配制。(8)提供酶反應(yīng)終止液，終止液為2M硫酸。(9)提供樣品制備液。用 以配制倍他米松標(biāo)準(zhǔn)溶液和測定時樣品的制備。
以上試劑均放4 °C冰箱保存。
應(yīng)用本試劑盒檢測倍他米松的檢測步驟 (1)按照測定樣品數(shù)和制作標(biāo)準(zhǔn)曲線所需孔數(shù)(每樣品和標(biāo)準(zhǔn)均作二個孔)，從冰 箱取出所需用的孔條，放置使溫度平衡至室溫(25°C )。 (2)將倍他米松抗體濃縮液用抗體稀釋液按1 : 100稀釋后，每孔加100 iU，加 蓋，室溫放置30分鐘。 (3)將濃縮洗滌液用雙蒸餾水按1 : 9稀釋后，作為洗滌液，倒去孔中抗體液，用洗 滌液洗滌3次，每孔，每次250iU，每次加洗滌液后，靜置3分鐘，倒掉，甩干，再進(jìn)行下一次 洗滌。最后一次洗滌，盡量將液體甩掉。 (4)各孔加入標(biāo)準(zhǔn)或樣品，各標(biāo)準(zhǔn)和樣品各加2孔，每孔加50 iU。將酶標(biāo)抗原濃
縮液，用抗體稀釋液按i : 100稀釋后，每孔加50ia，另取2孔，加o標(biāo)準(zhǔn)50ia和抗體稀
釋液50 iU作為空白孔，稍平行振蕩酶標(biāo)板，混勻各孔中液體。加蓋，室溫放置30分鐘。
(5)同(3)洗滌各孔，最后甩干。 (6)各孔加顯色液100 ii 1，顯色液由顯色緩沖液與TMB液組成，以10 : 1配制，即
1000 iil顯色緩沖液加100 iil TWB液。加入后，加蓋，室溫暗處避光放置15分鐘。 (7)每孔加終止液50 ii 1，混勻，于30分鐘內(nèi)，用酶標(biāo)儀，在波長450nm下，測定其
光密度。 用各孔的0D45。減去空白孔的0D45。，得各孔的實際測定值。求出二平行孔的平均值， 得各標(biāo)準(zhǔn)或樣品的測定值。按照下式求出各標(biāo)準(zhǔn)和樣品的抑制率
各標(biāo)準(zhǔn)或樣品的抑制率％ =(各標(biāo)準(zhǔn)或樣品的測定值/0標(biāo)準(zhǔn)的測定值)X 100% 用各標(biāo)準(zhǔn)濃度的對數(shù)值為X，其相應(yīng)的抑制率為Y，在坐標(biāo)軸上作圖，得倍他米松 濃度的半對數(shù)坐標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上，找出樣品抑制率相對應(yīng)的X軸上的點，就可計 算出樣品中倍他米松的濃度?；蚶肊LISA計算的相關(guān)軟件，只需輸入測定值，立即就可得 出結(jié)果。 本試劑盒所用的檢測方法，屬不均一的直接競爭酶聯(lián)免疫測定方法。96孔酶標(biāo) 板已預(yù)先包被了二抗，加入倍他米松的特異性抗體，此抗體與二抗結(jié)合后，固定在酶標(biāo)板 上。然后，加入標(biāo)準(zhǔn)抗原(Bet)或含有倍他米松的樣品，和酶標(biāo)-倍他米松，標(biāo)準(zhǔn)或樣品中 倍他米松與酶標(biāo)-倍他米松，共同競爭與倍他米松抗體結(jié)合，經(jīng)孵育后，洗滌去未結(jié)合的酶 標(biāo)-倍他米松，顯色測定。測定值與標(biāo)準(zhǔn)或樣品中倍他米松量的對數(shù)值呈反比，以此達(dá)到定 量測定倍他米松的目的。所謂不均一，則是指免疫原和酶標(biāo)抗原，二者是用不同的方法合 成。如此可增加反應(yīng)的靈敏度。這是本試劑盒的一大特點。
圖例說明

圖1載體蛋白BSA，免疫原倍他米松_BSA，倍他米松
三者紫外掃描圖。 圖2用制備的試劑盒測定，所得的倍他米松標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。 以下具體實施實例，可進(jìn)一步了解本發(fā)明。此處僅提供一種優(yōu)選方法，但對本發(fā)明
的內(nèi)容和權(quán)利要求不構(gòu)成任何限制。 實施例1主要試劑和主要儀器
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1. 1試劑倍他米松(購自Sigma)，羧甲基羥胺(Sigma)，吡啶；N-羥基丁二酰亞胺(NHS) ;N，
N-二甲基甲酰胺(DMF);四氫呋喃；二環(huán)己碳二亞胺(DCC);三正丁胺，氯甲酸異丁酯(均購 自國藥上?；瘜W(xué)試劑公司)，牛血清白蛋白(BSA);卵清蛋白(OVA);四甲基聯(lián)苯胺(TMP); (購自華美生物工程公司，進(jìn)口分裝產(chǎn)品)。辣根過氧化物酶R. Z > 3 (上海麗珠東風(fēng)生物
技術(shù)有限公司).羊抗兔多抗(上?？党缮锟萍脊举彽?.S印hadex G-25 (Sigma)，其余
均為分析純試劑.
1. 2主要儀器 精密分析天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司，Sartorius， BS124s， d = O.OOOlg);帶掃描PC紫外-可見分光光度計(上海欣茂儀器有限公司)；高速臺式離心機 (上海安亭實驗儀器廠)；酶標(biāo)儀，P型可調(diào)移液器一套(熱電上海公司)；SZ_97自動三重 水純水蒸餾(上海本波儀器有限公司)以及其他實驗室常用儀器.
實施例2倍他米松免疫原和酶標(biāo)抗原的合成
2. 1倍他米松-3-羧甲基肟，Bet-3-CM0，的合成 稱取Bet 118mg(0. 3薩o1)溶于2ml無水妣啶，攪拌下，加入45mg(0. 45,1)羧 甲基羥胺，室溫攪拌24小時，最后，減壓抽干吡啶，得黃色油狀物。加2ml乙酸乙酯溶解，用 蒸餾水洗三次，用分離出有機相，無水硫酸鈉干燥。加熱減壓去乙酸乙酯近干，加3ml乙醚， 置冰箱，得白色沉淀。此為倍他米松-3-羧甲基肟，得約53mg。取少量，溶解于O. lml DMF， 用TLC鑒定。薄層層析中，Bet-3-CM0的Rf為0. 2左右，接近原點。Bet則離開原點，隨層 析液前移.Rf約為0. 85 2. 2免疫原的制備倍他米松_牛血清白蛋白的合成 取上制備的倍他米松-3-羧甲基肟40mg，溶于DMF液2. 5ml，加入25mgDCC(約 0. 23mmol)，4。C攪拌下，加入NHS 18mg(約0. 15mmo1)，避光4。C攪拌過夜.次日，離心去沉 淀.取上清為活化的Bet-CMO. 稱取300mg牛血清白蛋白，加7ml pH8 9的蒸餾水和5ml DMF溶解，4。C攪拌下， 加入上活化的Bet-CMO 1. 8ml. 4。C攪拌過夜.次日，取出用O. 01M PBS(pH7. 5)透析3日.每 天換2次透析液.透析后，定蛋白濃度，并用uv掃描鑒定，計算交聯(lián)率.其交聯(lián)率一般在 12 18左右.此為倍他米松-牛血清白蛋白(Bet-BSA)，作為免疫原。圖1為牛血清白蛋 白，倍他米松-BSA和倍他米松紫外掃描圖。 2. 3酶標(biāo)抗原的合成倍他米松_辣根過氧化物酶的合成 倍他米松-21-琥珀酸半酯的合成稱取40mg倍他米松(0. lmml)和15mg琥珀 酸酐(0. 15mmol)，加入4mL無水吡啶，混合物在65t:下加熱攪拌12h，將反應(yīng)物轉(zhuǎn)入pH 2 3(用鹽酸調(diào))的冰水中.置冰箱過夜.次日，白色沉淀析出，離心去上清，沉淀用去離子水 洗數(shù)次，離心，沉淀置干燥箱干燥，得倍他米松-21-琥珀酸半酯。 稱20mg倍他米松_21_琥珀酸半酯，加四氫呋喃lml溶解，4"C攪拌下，加入20 y 1 三正丁胺，10yl氯甲酸異丁酯，4t:攪拌l小時，生合成混合酸酐.為倍他米松-2i-琥珀酸 半酯的活化形式. 稱取HRP 10mg力B500ii1 pH 8 9的蒸餾水和500 yl DMF溶解，4"C攪拌下，加入 上合成的混合酸酐液200 ii 1. 4t:攪拌過夜.次日，取出用0. 01MPBS(pH7. 5)透析3日.每天換2次透析液.透析后，過S印hadex G 25柱，收集有色峰.為Bet-HRP.
實施例3倍他米松多克隆抗體的生產(chǎn) 用3只新西蘭長耳雌兔，每只免4次.首次用Bet-BSA配成lmg/ml濃度，取3ml ， 加3ml弗氏完全佐劑，充分乳化后.每只兔用2ml(即lmg免疫原)背部，多點皮下注射為首 次免疫.以后分別在第21天，51天，91天再免疫3次.第21天，51天，用3ml lmg/ml濃度 的免疫原，加3ml弗氏不完全佐劑乳化，每只兔用lml，于臀部肌肉二側(cè)注射.第51天免疫 后10天，采血檢查抗體產(chǎn)生情況.第91天，免疫原用0. 9%氯化鈉液配成0. 5mg/ml溶液， 每只免從耳靜脈注射lml免疫原.此次后，第IO天，就可從兔耳靜脈或心臟收獲血液.收 集血液讓其自然凝結(jié).離心收集血清，此為抗Bet的抗血清.
按照此免疫方案，一般都能收獲高滴度的抗血清. 用二抗包被酶標(biāo)板，利用合成的Bet-HRP，測定抗血清效價.下為測定結(jié)果
稀釋倍 數(shù)1 ! 40001 : 80001 : 160001 : 320001 : 640001 : 1280001 : 2360001 : 472000
抗血清 0D4503. 3803. 0842. 8152. 3231. 931. 0870. 6200. 413
陰性血
清 0D4500. 1530. 1180. 0620. 0330. 0220. 0150. 0020. 001 可見，生產(chǎn)抗血清效價達(dá)40萬.用則可按l : 25000 1 : 50000稀釋用. 實施例4優(yōu)化試劑盒組成，確定各試劑最終濃度 用方陣法確定包被二抗，Bet多抗，Bet-HRP三者的最佳濃度。 4. 1包被酶標(biāo)板二抗配成2mg/ml濃度，用0. 01M碳酸鹽緩沖溶液(pH 9. 6)按
i : iooo (iooo iii緩沖液加iyi 二抗)稀釋后，每孔加100iii，加蓋，放入4t:冰箱過夜。
次日用洗滌液洗3次，最后一次甩干后，每孔加200 ii 1封閉液，封閉液為含2%卵清蛋白的 O.OIM碳酸鹽緩沖溶液(PH9.6)。加入后，加蓋，放入4t:冰箱過夜。次日用洗滌液洗3次， 最后一次甩干后，將酶標(biāo)板放入37t:烘箱30分鐘，烘干。取出后用鋁箔真空包裝。
4. 2配抗體濃縮液以制備Bet-多抗，1 : 2500稀釋(用抗體保存液)。測定時
用抗體稀釋液按i : ioo稀釋應(yīng)用。 4. 3配Bet-HRP濃縮液合成的Bet-HRP，用酶保存液，按1 : 10稀釋。測定時用 抗體稀釋液按l : ioo稀釋應(yīng)用。 4. 4配濃縮洗滌液0. 5M PBS液(pH7. 2) +0. 5%體積的Tween-20為洗滌液。用時
用蒸餾水或去離子水按i:9稀釋用。 4. 5配抗體稀釋液為0. 1M PBS(pH 7. 2)加0. 1%明膠。 4. 6配樣品配制液為0. 1MPBS(pH 7. 2)力Q 0. 1%水楊酸鈉加0. 05%吐溫-20。
4. 7配制Bet標(biāo)準(zhǔn)用樣品配制液配。共配制7個標(biāo)準(zhǔn)Ong/ml，0. lng/ml，0. 5ng/
8ml，1. 0ng/ml， 5. Ong/ml，10. Ong/ml， 20. Ong/ml。 4. 8配制顯色液顯色液由二部份組成，一是"顯色緩沖液"，另一是"TMB"液。顯 色緩沖液:Na2HP04 1. 84g+檸檬酸0. 47g+H20 100ml+30% H202 50 ii 1， TMB液用95%的乙 醇或用二甲亞砜配成lmg/ml濃度。 4.9配終止液2M硫酸。濃硫酸按l : 8用水稀釋則可。
4. 10試劑盒組成 (1)已包被二抗的96孔或48孔酶標(biāo)板(真空鋁箔包裝) (2)倍他米松(Bet)標(biāo)準(zhǔn)(共7個)Ong/ml，0. lng/ml，0. 5ng/ml， 1. Ong/ml ， 5.Ong/ml，10. Ong/ml，20. Ong/ml (3) Bet抗體濃縮液(用時按1 : 100稀釋應(yīng)用) (4)Bet-HRP濃縮液(用時按1 : 100稀釋應(yīng)用) (5)抗體稀釋液 (6)顯色緩沖液 (7) TMB液 (8)終止液。 (9)10X洗滌液 (10)樣品制備液。 實施5樣品處理和測定 5. l測定樣品的處理 尿樣2ml新鮮尿液加2ml 0. 1M醋酸鹽緩沖溶液(pH4. 8)，加40 蝸牛酶液，6ml 蒸餾水，37t:保溫4小時。酶解。然后，沸水浴加熱5分鐘。離心，取上清lml加4ml預(yù)先用 水平衡的三氯甲烷，旋轉(zhuǎn)混合抽提10分鐘。離心，取下有機相2ml， N2氣吹干，殘渣加200 y 1 樣品制備液，旋轉(zhuǎn)混合。室溫平衡30分鐘，作樣品測定液。 脂肪，腎脂肪樣品:10g腎脂肪，在微波爐中加熱熔化(低火360W，2 3分鐘)。 取lg于玻璃勻漿器中，加5. Oml三氯甲烷，旋轉(zhuǎn)混合，抽提5分鐘。離心，取下層lml三氯 甲烷液，通風(fēng)櫥中，用N2吹干，加200 樣品制備液，旋轉(zhuǎn)混合，抽提15分鐘，為測定樣品 液。 肌肉，香腸10g加10ml含0. 1%水楊酸鈉的0. 15M，氯化鈉液，勻漿，取1/10體積， 加5ml三氯甲烷，旋轉(zhuǎn)混合，抽提5分鐘。離心，取下層三氯烷lml，用N2吹干，加200 樣 品制備液，旋轉(zhuǎn)混合抽提15分鐘，為測定樣品液。 飼料10g加lOml含O. 1%水楊酸鈉的0. 15M氯化鈉液，勻漿，取1/10體積，加5ml 三氯甲烷，旋轉(zhuǎn)混合，抽提5分鐘。離心取下層三氯甲烷lml，用N2吹干，加200 樣品制 備液，旋轉(zhuǎn)混合抽提15分鐘，為測定樣品液。 [OO89] 飲料(包括牛奶，茶，咖啡等) 取lml飲料，加5ml三氯甲烷，旋轉(zhuǎn)混合，抽提5分鐘。離心取下層三氯甲烷lml， 用N2吹干，加200 1樣品制備液，旋轉(zhuǎn)混合抽提15分鐘，為測定樣品液。
尿樣品稀釋系數(shù)均為2。其余為1。 5. 2樣品和標(biāo)準(zhǔn)液的測定按照說明書第6，7頁所述的檢測步驟，用組裝好的試劑 盒進(jìn)行測定。測定所得標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)椐如下
9
標(biāo)準(zhǔn) (pg/ml) 0 100 500 1000 5000
20000 空白A4502. 2251.914 1. 527 1. 356 0. 788
0.315 0.01 2.1871.954 1.538 1.331 0.812
0.308 0.01平均值2. 2061.934 1. 53251. 3435 0.8
0.3115 0.01測定值2. 1961.924 1. 52251. 3335 0. 79
0. 3015抑制率 0.8761384 0.6933060.60724040. 359745
0.1372951 100 87.61384 69.3306 6072404 35.9745
13. 72951 所繪的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示< 實施6試劑盒各參數(shù)的測定 試劑盒的特異性及交叉反應(yīng) 倍他米松 100% 地塞米松 氟美松 20% 孕酮
氫化可的松<1%
用lng/ml標(biāo)準(zhǔn)做24個孔，重復(fù)測定。計算"板內(nèi)變異"CV = 4. 0% "板間變異"< 15%。"靈敏度"為0. lng/ml。
精確度用肝組織做添加試驗，分別添加0. lng/ml，0. 5ng/ml， lng/ml， 其回收率分別是75%，85%，及92% 試劑盒穩(wěn)定性
10000
0. 505
0. 576
0.5405
0.5305
24. 15756
















半年以上
IC5。 = 1. 785ng/ml
40% < 2%
標(biāo)準(zhǔn)
(pg/ml) 0
37t:第l周
37t:第2周 37t:第3周
0 100 500 1000 5000 10000 20000
2.225 1.914 1.527 1.356 0.788 0.505 0.315
2.204 1.891 1.489 1.312 0.7 0.489 0.3
1.982 1.681 1.318 1.044 0.587 0.405 0.257
1.758 1.403 1.025 0.877 0.388 0.214 0.165
熱穩(wěn)定性試驗，37度3周保存，相當(dāng)于4度保存7. 4個月?？梢娫噭┖械姆€(wěn)定期在
10
權(quán)利要求
本發(fā)明公開一種測定倍他米松的直接競爭酶聯(lián)免疫測定試劑盒。其特征包括免疫原的制備，酶標(biāo)抗原的制備，抗體制備和試劑盒各組份的配制及酶標(biāo)板的包被。
2. 根據(jù)權(quán)利l所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于，合成倍他米松免疫原的方法。用 倍他米松溶于無水吡啶，攪拌下，加入羧甲基羥胺，倍他米松與羧甲基羥胺的摩爾比為1 : 1.5左右，室溫攪拌24小時后，減壓抽干吡啶，得黃色油狀物。加乙酸乙酯溶解，用蒸 餾水洗三次，分離出有機相。加熱減壓去乙酸乙酯近干，加乙醚，置冰箱，得白色沉淀。為倍 他米松-3-羧甲基肟，再與N-羥基丁二酰亞胺反應(yīng)，用二環(huán)己碳二亞胺或水溶性碳二亞胺 {1-乙基-3- (3- 二甲氨丙基)-碳二亞胺；1-環(huán)己-3- (2-瑪啉-4-乙基)碳二亞胺-對甲 基苯亞磺酸鹽}催化，生成倍他米松-3-羧甲基肟活化物，該活化物與載體蛋白在堿性條件 下，與載體蛋白上氨基相聯(lián)，為倍他米松的免疫原。載體蛋白如牛血清白蛋白，卵清蛋白， 甲狀腺球蛋白，大鑰匙孔狀槭血藍(lán)蛋白。
3. 根據(jù)權(quán)利1所述，其特征在于，合成一種酶標(biāo)抗原的方法首先合成倍他米松-21-琥珀酸半酯倍他米松(0. lmml)和琥珀酸酐(0. 15mmo1)，加入無水吡啶，混合物在 65t:下加熱攪拌12h，將反應(yīng)物轉(zhuǎn)入pH 2 3(用鹽酸調(diào))的冰水中.置冰箱過夜，得白色 沉淀，沉淀用去離子水洗數(shù)次，離心，干燥，得倍他米松-21-琥珀酸半酯。倍他米松-21-琥珀酸半酯，用四氫呋喃或二甲基甲酰胺為溶劑，4t:攪拌下，加入三正丁胺，氯甲酸異丁酯，生合成混合酸酐.為倍他米松-21-琥珀酸半酯的活化形式.此活化形式，在堿性條件下與 酶相聯(lián)，其酶可為辣根過氧化物酶，堿性磷酸酶，P-半乳糖苷酶。合成酶標(biāo)抗原。
4. 根椐權(quán)利l-3所述，制備的倍他米松試劑盒，其特征在于免疫原和酶標(biāo)抗原用不同 的合成方法。免疫原中，其載體蛋白是在倍他米松第3位上與之交聯(lián)；而酶標(biāo)抗原中，酶是 在倍他米松第21位上與之相聯(lián)，或免疫原在倍他米松21位上聯(lián)接，酶標(biāo)抗原在倍他米松3 位上聯(lián)接，如此組成一個不均一系統(tǒng)，增加了檢測的靈敏度。組成一種不均一的直接競爭酶 聯(lián)免疫測定試劑盒。
5. 根據(jù)權(quán)利1所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品的配制，是用含 0. 1% 0. 5%水楊酸鈉和0. 05% 0. 1%吐溫_20的0. 1 0. OIM的磷酸鹽緩沖溶液?？?體稀釋液是用含0. 1 0. 5%明膠的0. 1 0. OIM磷酸鹽緩沖溶液。顯色液為二組份，其 中，一組份為顯色緩沖液，由磷酸氫二鈉和檸檬酸組成，每毫升含O. 2 0. 5iU30%H202 ;另 一組份為四甲基聯(lián)苯胺(TMB)液。TMB液用95%乙醇或二甲亞砜配制成lmg/ml濃度。
6. 根據(jù)權(quán)利l所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于，采用羊抗兔抗體(二抗)包被96 或48孔酶標(biāo)板。用2%卵清蛋白液封閉孔中未吸附二抗的部位。
7. —種用不均一性的直接競爭酶聯(lián)免疫測定方法，測定各種樣品中倍他米松的方法。 其特征在于(1) 樣品的前處理方法。用溶劑抽提方法，大大簡化了測定過程。(2) 用權(quán)利l-6所述工藝組裝的試劑盒測定，檢測過程為用包被有羊抗兔抗體的酶標(biāo)板，加入倍他米松抗體，孵育后洗滌甩干，加入標(biāo)準(zhǔn)或樣品 溶液和酶標(biāo)抗原(倍他米松_辣根過氧化物酶)，孵育后洗滌甩干，加顯色劑顯色，終止，測 定。標(biāo)準(zhǔn)或樣品中倍他米松濃度的對數(shù)值與OD，值呈反比。以此達(dá)到定量測定倍他米松 的目的。此不均一的直接競爭酶聯(lián)免疫測定試劑盒，檢測范圍為0. 1 20ng/ml，靈敏度可達(dá)0. lng/ml， IC501 2ng/ml。
全文摘要
本發(fā)明屬生物醫(yī)藥領(lǐng)域。公開一種測定倍他米松的直接競爭酶聯(lián)免疫測定試劑盒。本發(fā)明提供倍他米松抗原合成方案，用倍他米松合成倍他米松-3-羧甲基肟，后者在碳二亞胺催化下，用N-羥基丁二酰亞胺活化，與載體蛋白結(jié)合，合成免疫原；用倍他米松與琥珀酸酐反應(yīng)生成倍他米松-21-半琥珀酸酯，后者通過混合酸酐法與酶結(jié)合，合成酶標(biāo)抗原。用免疫原，免疫新西蘭大白兔，獲得地塞米松多抗。測定時，用羊抗兔多抗(二抗)包被酶標(biāo)板，二抗與倍他米松多抗結(jié)合，洗滌后加入樣品或標(biāo)準(zhǔn)和酶標(biāo)抗原，顯色測定，就可得出結(jié)果。本發(fā)明試劑盒組成一個不均一的直接競爭酶聯(lián)免疫測定系統(tǒng)。為食品安全，藥物檢測中，倍他米松的檢測，提供一個快速，特異，靈敏的檢測方法。
文檔編號G01N33/543GK101769920SQ200810204938
公開日2010年7月7日 申請日期2008年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月30日
發(fā)明者徐基芳, 王文卓, 王武康 申請人:王武康