專利名稱：一種檢測(cè)去甲睪酮(諾龍)的直接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫測(cè)定試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，藥物檢測(cè)，食品安全檢測(cè)試劑。具體而言，
本發(fā)明利用免疫反應(yīng)的高靈敏性和特異性，以及酶促反應(yīng)的放大效應(yīng)和易檢測(cè)性，建立起 來(lái)的一種檢測(cè)去甲睪酮(諾龍)的直接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫測(cè)定試劑盒 背景技術(shù)"19-去甲睪酮"，又稱諾龍(19-Nortestosterone)是雄性激素睪酮的 衍生物，為一種蛋白質(zhì)同化類激素.此類激素及其類似物曾經(jīng)是應(yīng)用最為廣泛、效果最顯 著的一類生長(zhǎng)促進(jìn)劑。這類激素，主要是通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體代謝，影響蛋白質(zhì)和脂肪代謝，而起 到促進(jìn)生長(zhǎng)，增加胴體蛋白質(zhì)含量，降低脂肪含量，剌激骨髓造血，加速骨生長(zhǎng)，降低飼料消 耗等作用，是養(yǎng)殖業(yè)中最常用的動(dòng)物生長(zhǎng)促進(jìn)劑。在競(jìng)技運(yùn)動(dòng)中，為提高運(yùn)動(dòng)成績(jī).增強(qiáng)骨 骼和肌肉.也有運(yùn)動(dòng)員非法使用。諾龍?jiān)趧?dòng)物體內(nèi)殘留，若長(zhǎng)期攝入有這類化合物殘留的 食品，有引起性功能紊亂，肝腎功能損害，甚至于誘發(fā)腫瘤等潛在性危害。故歐盟各國(guó)和我 國(guó)已明文禁止在飼料中添加該類物質(zhì)，(作為A類殘留監(jiān)測(cè)藥物)。體育運(yùn)動(dòng)競(jìng)賽時(shí)的興奮 劑監(jiān)測(cè)中，這類激素占同化類激素陽(yáng)性樣品的60 %以上.也是必檢項(xiàng)目。
由于要求去甲睪酮在食品中不得檢出。檢測(cè)限在0.5ng/g(ml)或者更低，故要求 高靈敏度的檢測(cè)方法和手段，這對(duì)分析檢測(cè)是一個(gè)挑戰(zhàn)。現(xiàn)今有關(guān)去甲睪酮的檢測(cè)方法， 多采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)或多級(jí)聯(lián)用技術(shù)如 LC-MS-MS，其設(shè)備要求高，技術(shù)難度大，對(duì)技術(shù)人員要求也高。本發(fā)明試劑盒利用酶聯(lián)免疫 測(cè)定原理，定量檢測(cè)動(dòng)物組織，糞便，膽汁.尿液中的去甲睪酮?dú)埩簦且环N不需要昂貴的 儀器投入，一般中等文化水平的人員，經(jīng)過(guò)短期培訓(xùn)，就可掌握的檢測(cè)方法。該試劑盒檢測(cè) 多種樣品中的去甲睪酮，其線性范圍為0. 05ng/ml 4ng/ml， IC5。為0. 7ng/ml左右，靈敏度 為O. 05ng/ml。為食品中去甲睪酮?dú)埩艉腕w育運(yùn)動(dòng)中興奮劑監(jiān)測(cè)，提供了一種高效，快速，特 異的檢測(cè)方法。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供一種快速檢測(cè)去甲睪酮的酶聯(lián)免疫試劑盒。其制備的去甲 睪酮試劑盒，線性范圍為0. 05ng/ml 4ng/ml， IC5。為0. 7ng/ml左右，靈敏度為0. 05ng/ml 。 穩(wěn)定期在6個(gè)月以上(4t:冰箱保存)。 本發(fā)明公開(kāi)免疫原的合成，動(dòng)物的免疫，特異性抗體的制備，試劑盒的調(diào)試和裝 配，試劑盒各種參數(shù)的確定及樣品的前處理和測(cè)定方法。 去甲睪酮，化學(xué)名17P-羥-19-去甲基-雄甾-4-烯-3_酮?？s寫為19-NT，分 子量274.4，為小分子物質(zhì)，不具有免疫原性而僅具有免疫反應(yīng)性，生產(chǎn)去甲睪酮的酶聯(lián)免 疫測(cè)定試劑盒，必須要制備對(duì)去甲睪酮有高度特異性的抗體。要獲得對(duì)去甲睪酮有高度特 異性的抗體，首要條件是要有一個(gè)能激發(fā)動(dòng)物產(chǎn)生抗體的抗原。因此，免疫原的制備最為重 要。其解決的方案是去甲睪酮共價(jià)連接上一個(gè)大分子物質(zhì)，通常是與一種蛋白質(zhì)交聯(lián)。常 用的有牛血清白蛋白，卵清蛋白，甲狀腺球蛋白，大鑰匙孔狀槭血藍(lán)蛋白等，本發(fā)明公開(kāi)一 種制備去甲睪酮免疫原的方法。首先用一羥胺化合物，羧甲基羥胺，修飾19-NT，生成去甲睪 酮-3-羧甲基肟(19-NT-3-CM0)，后者與N-羥基丁二酰亞胺反應(yīng)，用二環(huán)己碳二亞胺(DCC) 或水溶性碳二亞胺{1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)-碳二亞胺，N-Ethyl-N' -(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide， EDAC ;l-環(huán)己_3_(2-瑪啉-4-乙基)碳二亞胺對(duì)甲基苯亞磺 酸鹽N_Cyclohexyl_N'_ (2-morpholinoethyl) carbodiimidemetho_p_toluenesulfonate，， CMEC}催化，使之活化，然后與載體蛋白分子中游離胺基相連，生成去甲睪酮免疫原。
有了免疫原，第二步就是用免疫原免疫動(dòng)物，本發(fā)明是免疫1.5 2kg大小的新西 蘭雌性家兔，獲得對(duì)去甲睪酮有特異性反應(yīng)的多克隆抗體。本發(fā)明提供一種能產(chǎn)生高滴度 抗體的免疫方案。 為了檢測(cè)特異性抗體，建立直接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫測(cè)定，必須合成去甲睪酮與一種酶 交聯(lián)的抗原-酶交聯(lián)物(酶標(biāo)抗原)，交聯(lián)的酶包括辣-根過(guò)氧化物酶，堿性磷酸酶，P-半 乳糖苷酶等。本發(fā)明公開(kāi)一種合成去甲睪酮與酶交聯(lián)的方法，以制備酶標(biāo)抗原，這是建立直 接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫測(cè)定方法的關(guān)鍵技術(shù)。 在以上基礎(chǔ)上，組裝檢測(cè)試劑盒。用聚苯乙烯96孔或48孔酶標(biāo)板，包被二抗。 (選用羊抗兔抗體，有商品供給。 一般選用效價(jià)高，效價(jià)在l : 1000 2000、穩(wěn)定性好的二
抗。)。 優(yōu)化包被濃度，抗體濃度，酶標(biāo)抗原濃度，使之達(dá)到檢測(cè)要求。
本發(fā)明提供組成試劑盒相關(guān)試劑的配制及組裝流程 (1)用選購(gòu)的二抗包被酶標(biāo)板。(2)孵育后洗滌去未吸附上的多余二抗。(3)用另 一種蛋白封閉板上未吸附二抗的多余位點(diǎn)，以減少測(cè)定時(shí)的非特異性吸附。(4)提供去甲 睪酮抗體和去甲睪酮-酶交聯(lián)物(酶標(biāo)抗原)濃縮液。(5)提供抗體和酶標(biāo)抗原應(yīng)用稀釋 液。(6)提供濃縮洗滌液(7)提供去甲睪酮的標(biāo)準(zhǔn)液，用樣品制備液配制7個(gè)標(biāo)準(zhǔn)Ong/ml， 0. 05ng/ml，0. lng/ml，0. 5ng/ml， 1. 0ng/ml，2. Ong/ml ，4. Ong/ml (8)提供酶顯色緩沖溶液和 酶反應(yīng)底物液，本試劑盒所用的酶反應(yīng)底物為H202和四甲基聯(lián)苯胺(TMP) ， H202配于顯色緩 沖溶液中，四甲基聯(lián)苯胺(TMP)單獨(dú)配制。(8)提供酶反應(yīng)終止液，終止液為2M硫酸。(9) 提供樣品制備液。為配制去甲睪酮標(biāo)準(zhǔn)液和測(cè)定時(shí)樣品的制備。
以上試劑均放4 °C冰箱保存。
應(yīng)用本試劑盒檢測(cè)去甲睪酮的檢測(cè)步驟 (1)按照測(cè)定樣品數(shù)和制作標(biāo)準(zhǔn)曲線所需孔數(shù)(每樣品和標(biāo)準(zhǔn)均作二個(gè)孔)，從冰 箱取出所需用的孔條，放置使溫度平衡至室溫(25°C )。 (2)將去甲睪酮抗體濃縮液用抗體稀釋液按1 : IOO稀釋后，每孔加lOOiU，加 蓋，室溫放置30分鐘。 (3)將濃縮洗滌液用雙蒸餾水按1 : 9稀釋后，作為洗滌液，倒去孔中抗體液，用洗 滌液洗滌3次，每孔，每次250iU，每次加洗滌液后，靜置3分鐘，倒掉，甩干，再進(jìn)行下一次 洗滌。最后一次洗滌，盡量將液體甩掉。 (4)各孔加入標(biāo)準(zhǔn)或樣品，各標(biāo)準(zhǔn)和樣品各加2孔，每孔加50 iU。將酶標(biāo)抗原濃 縮液，用抗體稀釋液按l : 100稀釋后，每孔加50iU。另取2孔，加0標(biāo)準(zhǔn)50iU和抗體稀 釋液50 iU作為空白孔，稍平行振蕩酶標(biāo)板，混勻各孔中液體。加蓋，室溫放置30分鐘。
(5)同(3)洗滌各孔，最后甩干。 (6)各孔加顯色液100 ii 1，顯色液由顯色緩沖液與TMB液組成，臨用時(shí)以10 : 1 配制(即1000 ii 1顯色緩沖液加100 ill TMB液)。加入后，加蓋，室溫暗處避光放置15分 鐘。
(7)每孔加終止液50iil，混勻，于30分鐘內(nèi)，用酶標(biāo)儀，在波長(zhǎng)450nm下，測(cè)定其
光密度。 用各孔的0D45。減去空白孔的0D45。，得各孔的實(shí)際測(cè)定值。求出二平行孔的平均值， 得各標(biāo)準(zhǔn)或樣品的測(cè)定值。按照下式求出各標(biāo)準(zhǔn)和樣品的抑制率
各標(biāo)準(zhǔn)或樣品的抑制率％ =(各標(biāo)準(zhǔn)或樣品的測(cè)定值/0標(biāo)準(zhǔn)的測(cè)定值)X 100% 用各標(biāo)準(zhǔn)濃度的對(duì)數(shù)值為X，其相應(yīng)的抑制率為Y，在坐標(biāo)軸上作圖，得去甲睪酮 濃度的半對(duì)數(shù)坐標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上，找出樣品抑制率相對(duì)應(yīng)的X軸上的點(diǎn)，就可計(jì) 算出樣品中去甲睪酮的濃度?，F(xiàn)已有ELISA計(jì)算的相關(guān)軟件，利用這些軟件，只要輸入測(cè)定 值，立即就可得出結(jié)果。 本試劑盒所用的檢測(cè)方法，屬直接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫測(cè)定方法。96孔酶標(biāo)板已預(yù)先包 被了二抗，加入去甲睪酮的特異性抗體，此抗體與二抗結(jié)合后，固定在酶標(biāo)板上。然后，加入 標(biāo)準(zhǔn)抗原或含有去甲睪酮的樣品，和酶標(biāo)-去甲睪酮，標(biāo)準(zhǔn)或樣品中去甲睪酮與酶標(biāo)-去甲 睪酮，共同競(jìng)爭(zhēng)與去甲睪酮抗體結(jié)合，經(jīng)孵育后，洗滌去未結(jié)合的酶標(biāo)_去甲睪酮，顯色測(cè) 定。測(cè)定值與標(biāo)準(zhǔn)或樣品中去甲睪酮量的對(duì)數(shù)值呈反比，以此達(dá)到定量測(cè)定去甲睪酮的目 的。


圖1為合成去甲睪酮衍生物-"去甲睪酮-3-羧甲基肟"的
硅膠薄層層析(TLC)圖。 從上到下樣品為月虧化24小時(shí)的去甲睪酮，后化12小時(shí)的去甲
睪酮，及去甲睪酮 圖2為合成免疫原去甲睪酮_牛血清白蛋白(19-NT-BSA)紫外掃描圖
用19-NT， 19-NT-BSA， BSA進(jìn)行紫外掃描結(jié)果。
圖3為用此試劑盒測(cè)定所作的19-NT標(biāo)準(zhǔn)曲線。
根據(jù)實(shí)施5. 2測(cè)定數(shù)據(jù)所作的標(biāo)準(zhǔn)曲線。 以下具體實(shí)施方式
，可進(jìn)一步了解本發(fā)明。此處僅提供一種優(yōu)選方法，但對(duì)本發(fā)明 的內(nèi)容和權(quán)利要求不構(gòu)成任何限制。
實(shí)施例1主要試劑和主要儀器
1. 1試齊[J 去甲睪酮(購(gòu)自Sigma)，羧甲基羥胺(Sigma)，吡啶；N-羥基丁二酰亞胺(NHS) ;N， N-二甲基甲酰胺(DMF) ;二環(huán)己碳二亞胺(DCC);(均購(gòu)自國(guó)藥上?；瘜W(xué)試劑公司)，牛血清 白蛋白(BSA);卵清蛋白(OVA);四甲基聯(lián)苯胺(TMP);(購(gòu)自華美生物工程公司，進(jìn)口分裝 產(chǎn)品)。辣根過(guò)氧化物酶(R. Z > 3)(上海麗珠東風(fēng)生物技術(shù)有限公司).羊抗兔多抗(上 海康成生物科技公司).S印hadex G-25 (Sigma)，其余均為分析純?cè)噭?
1. 2主要儀器 精密分析天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司，Sartorius， BS124s， d = O.OOOlg);帶掃描PC紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海欣茂儀器有限公司)；高速臺(tái)式離心機(jī) (上海安亭實(shí)驗(yàn)儀器廠)；酶標(biāo)儀，P型可調(diào)移液器一套(熱電上海公司)；SZ_97自動(dòng)三重 水純水蒸餾(上海本波儀器有限公司)以及其他實(shí)驗(yàn)室常用儀器.
實(shí)施例2去甲睪酮免疫原和酶標(biāo)抗原的合成
2. 1去甲睪酮_3-羧甲基肟(19-NT-3-CM0)，的合成 稱取去甲睪酮83mg(0. 3mmmo1)溶于lml無(wú)水吡啶，攪拌下，加入45mg(0. 45mmol) 羧甲基羥胺，室溫?cái)嚢?4小時(shí)后(中途12小時(shí)時(shí)取樣，硅膠薄層層析鑒定)，減壓抽干吡 啶，得黃色油狀物。加2ml乙酸乙酯溶解，用蒸餾水洗三次，分離出有機(jī)相。加熱減壓去乙 酸乙酯近干，加3ml乙醚，置冰箱，得白色沉淀。離心，將沉淀干燥，此為去甲睪酮-3-羧甲 基肟，得約40mg。溶解于lml匿F，用硅膠薄層層析(TLC)鑒定。薄層層析結(jié)果見(jiàn)圖1. TLC 圖中，19-NT-3-CM0留在原點(diǎn)，12小時(shí)取樣時(shí)，肟化尚未完全.可見(jiàn)二點(diǎn)。24小時(shí)后，肟化基 本完全.僅見(jiàn)一個(gè)點(diǎn)。19-NT則離開(kāi)原點(diǎn)，隨層析液前移.
2. 2去甲睪酮_3-羧甲基肟的活化 上制備的去甲睪酮-3-羧甲基肟DMF液，加入25mg DCC(約0. 23mmo1) ，4。C攪拌 下，加入NHS 18mg(約0. 15mmol)，避光4。C攪拌過(guò)夜.次日，離心去沉淀.上清為活化的去 甲睪酮-3-羧甲基肟. 2. 3免疫原去甲睪酮_牛血清白蛋白(19-NT-BSA)的合成 稱取BSA 50mg加2000 yl PH8 9的蒸餾水和2000 y 1 DMF溶解，4。C攪拌下，加 入活化的19-NT-CM0 500 y 1. 4。C攪拌過(guò)夜.次日，取出用0. 01M PBS(pH7. 5透析3日.每 天換2次透析液.透析后，定蛋白濃度，并用uv掃描鑒定，計(jì)算交聯(lián)率.此法交聯(lián)率一般在 15 20左右.此掃描圖與BSA，19-NT掃描圖對(duì)照.其結(jié)果見(jiàn)圖2.如此合成的免疫原，為 去甲睪酮-牛血清白蛋白(19-NT-BSA) 2. 4酶標(biāo)抗原去甲睪酮_辣根過(guò)氧化物酶(19-NT-HRP)的合成稱取HRP 10mg加500 yl PH8 9的蒸餾水和500 y 1 DMF溶解，4。C攪拌下，加
入活化的19-NT-CM0 100 ii 1. 4。C攪拌過(guò)夜.次日，取出用0. 01MPBS(pH7. 5)透析3日.每
天換2次透析液.透析后，過(guò)S印hadex G 25柱，收集有色峰.為合成的酶標(biāo)抗原去甲睪
酮_辣根過(guò)氧化物酶(19-NT-HRP). 實(shí)施例3去甲睪酮多克隆抗體的生產(chǎn) 用3只新西蘭長(zhǎng)耳雌兔，每只兔免疫4次.首次用免疫原19-NT-BSA配成lmg/ml 濃度，取3ml，加3ml弗氏完全佐齊U，充分乳化后.每只兔用2ml (即lmg免疫原)于兔背部， 多點(diǎn)皮下注射為首次免疫.以后分別在第21天，51天，91天再免疫3次.第21天，51天， 用3ml lmg/ml濃度的免疫原，加3ml弗氏不完全佐劑乳化，每只兔用lml，于臀部肌肉二側(cè)注 射.第51天免疫后10天，采血檢查抗體產(chǎn)生情況.第91天，免疫原用0. 9%氯化鈉液配成 0. 5mg/ml溶液，每只免從耳靜脈注射lml免疫原.此次后，第10天，就可從兔耳靜脈或心臟收 獲血液.收集血液讓其自然凝結(jié).離心收集血清，此為抗去甲睪酮(19-NT)的多克隆抗體。
按照此免疫方案， 一般都能收獲高滴度的多克隆抗體。 用二抗包被酶標(biāo)板，利用合成的酶標(biāo)抗原(19-NT-HRP)，測(cè)定多克隆抗體效價(jià).
下為測(cè)定結(jié)果 稀釋倍數(shù)1 : 3200 1 : 6400 1 : 12800 1 : 25600 1 : 51200 1 : 102400 1 : 204800抗血清0D值2. 868 2. 792 2. 322 1. 664 1. 13 0. 587 0. 3240. 陰性對(duì)照0.231 0.218 0.116 0.054 0.012 0.007 0.002 可見(jiàn)，生產(chǎn)抗血清效價(jià)達(dá)IO萬(wàn)以上.用可按l : 10000 1 : 20000稀釋用.
實(shí)施例4優(yōu)化試劑盒組成，確定各試劑最終濃度 用方陣法確定包被二抗，19-NT多抗，19-NT-HRP三者的最佳濃度。4. 1包被酶標(biāo) 板二抗配成2mg/ml濃度，用0. 01M碳酸鹽緩沖溶液(pH9. 6)按1 : 1000 (1000 y 1緩沖液 加lyl 二抗)稀釋后，每孔加100ia，加蓋，放入4t:冰箱過(guò)夜。次日用洗滌液洗3次，最 后一次甩干后，每孔加200 ill封閉液，封閉液為含2%卵清蛋白的0. OIM碳酸鹽緩沖溶液 (pH9. 6)。加入后，加蓋，放入4t:冰箱過(guò)夜。次日用洗滌液洗3次，最后一次甩干后，將酶標(biāo) 板放入37t:烘箱30分鐘，烘干。取出后用鋁箔真空包裝。 4. 2配抗體濃縮液以制備19-NT多抗，1 : 2000稀釋(用抗體保存液)。測(cè)定時(shí)
用抗體稀釋液按i : ioo稀釋應(yīng)用。 4. 3配19-NT-HRP濃縮液合成的19_NT_HRP，用酶保存液，按1 : 8稀釋。測(cè)定時(shí) 用抗體稀釋液按l : IOO稀釋應(yīng)用。 4. 4配濃縮洗滌液0. 5M PBS液(pH7. 2) +0. 5%體積的Tween-20為洗滌液。用時(shí)
用蒸餾水或去離子水按i:9稀釋用。 4. 5配抗體稀釋液為0. 1M PBS (pH7. 2)加0. 1 %明膠。 4. 6配樣品配制液為0. 1M PBS(pH7. 2)力Q 0. 1%水楊酸鈉加0. 05%吐溫-20。
4. 7配制19-NT標(biāo)準(zhǔn)用樣品配制液配。共配制7個(gè)標(biāo)準(zhǔn)0ng/m1，0. 05ng/ml， 0. lng/ml， 0. 5ng/ml，1. Ong/ml， 2. Ong/ml， 4. Ong/ml。 4. 8配制顯色液顯色液由二部份組成，一是"顯色緩沖液"，另一是"TMB"液。顯 色緩沖液:Na2HP04 1. 84g+檸檬酸0. 47g+H20 100ml+30% H202 50 ii 1， TMB液用95%的乙 醇或用二甲亞砜配成lmg/ml濃度。 4.9配終止液2M硫酸。濃硫酸按1 : 8用水稀釋則可。
4. 10試劑盒組成 (1)已包被二抗的96孔或48孔酶標(biāo)板(真空鋁箔包裝) (2)19-NT標(biāo)準(zhǔn)7個(gè)標(biāo)準(zhǔn)Ong/ml，0. 05ng/ml，0. lng/ml，0. 5ng/ml，1. Ong/ml， 2. Ong/ml ，4. Ong/ml (3) 19-NT抗體濃縮液(用時(shí)按1 : 100稀釋應(yīng)用) (4) 19-NT-HRP濃縮液(用時(shí)按1 : 100稀釋應(yīng)用) (5)抗體稀釋液 (6)顯色緩沖液 (7) TMB液 (8)終止液。
(9) 10X洗滌液 (10)樣品制備液。 實(shí)施5樣品處理和測(cè)定 5. l測(cè)定樣品的處理 尿樣2ml新鮮尿液加2ml 0. 1M醋酸鹽緩沖溶液(pH4. 8)，加40 蝸牛酶液，6ml 蒸餾水，37t:保溫4小時(shí)，酶解。然后，沸水浴加熱5分鐘。離心，取上清1ml加4ml預(yù)先用 水平衡的三氯甲烷，旋轉(zhuǎn)混合抽提10分鐘。離心，取下有機(jī)相2ml， N2氣吹干，殘?jiān)?00 y 1 樣品制備液，旋轉(zhuǎn)混合。室溫平衡30分鐘，作樣品測(cè)定液。
組織樣品lg組織樣品加4ml勻槳液(0. 9%氯化鈉+0. 1 %水楊酸鈉)，勻漿。然
后，沸水浴加熱5分鐘。勻漿液定容為5ml。離心，取上清lml加4ml預(yù)先用水平衡的三氯
甲烷，旋轉(zhuǎn)混合抽提10分鐘。離心，取下有機(jī)相2ml，N2氣吹干，殘?jiān)?00 iil樣品制備液，
旋轉(zhuǎn)混合。室溫平衡30分鐘，作樣品測(cè)定液。 尿樣品的稀釋系數(shù)和組織樣品稀釋系數(shù)均為2。 5. 2樣品和標(biāo)準(zhǔn)液的測(cè)定 按照說(shuō)明書第4， 5頁(yè)所述的檢測(cè)步驟，用組裝好的試劑盒進(jìn)行測(cè)定。 測(cè)定所得標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)椐如下
標(biāo)準(zhǔn)濃度 (pg/ml)050100500100020004000空白
0D4502. 2952. 1931.9141. 2970. 9560. 6050. 3580. 052
2. 3122. 0892.0131. 2650. 9610. 6150. 2240. 081
平均值2. 30352. 1411. 96351.2810. 95850.610. 2910. 0665
測(cè)定值2. 2372. 07451.8971.21450.8920. 54350. 2245
抑制率％10092. 7384.854. 2939. 8727.2910. 03 所繪的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖3所示。IC5。 = 0. 723ng/ml 實(shí)施6試劑盒的各參數(shù) 試劑盒的特異性及交叉反應(yīng) 17H9-NT 100% 17a-19-NT 60% 19-甲基睪酮 10% 甲羥孕酮 <0. 2% 氯地孕酮 <0. 2% 孕酮 <0. 2% 氫化可的松 <0. 2% 準(zhǔn)確度用0. 5ng/ml標(biāo)準(zhǔn)做24個(gè)孔，重復(fù)測(cè)定。計(jì)算"板內(nèi)變異"CV = 4. 3%"板 間變異"< 15%。靈敏度為0. 05ng/ml。 精確度用尿做回收試驗(yàn)，分別添加0. lng/m1，0. 5ng/ml， lng/ml其回收率分別 是73%，86%，及84% 試劑盒穩(wěn)定性S(pg/ml)01005001000200002. 2951. 9141. 2970. 9560. 60537度一周2. 2351. 8071. 2130. 9010. 56937度二周1. 9831. 6571. 0340. 710. 38737度三周1. 7211. 5210. 8320. 6550. 286 熱穩(wěn)定性試驗(yàn)，37度3周，相當(dāng)于4度保存7. 4個(gè)月?？梢?jiàn)試劑盒的穩(wěn)定期在半年 以上。
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權(quán)利要求
本發(fā)明公開(kāi)一種測(cè)定去甲睪酮(諾龍)的直接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫試劑盒。其特征包括免疫原的制備，酶標(biāo)抗原的制備，抗體制備和試劑盒各組份的配制及酶標(biāo)板的包被。
2. 根據(jù)權(quán)利l所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于，合成去甲睪酮免疫原的方法。用 去甲睪酮溶于無(wú)水吡啶，攪拌下，加入羧甲基羥胺，去甲睪酮與羧甲基羥胺的摩爾比為1 : 1.5左右，室溫?cái)嚢?4小時(shí)后，減壓抽干吡啶，得黃色油狀物。加乙酸乙酯溶解，用蒸餾 水洗三次，分離出有機(jī)相。加熱減壓去乙酸乙酯近干，加3ml乙醚，置冰箱，得白色沉淀。為 去甲睪酮-3-羧甲基肟，再與N-羥基丁二酰亞胺反應(yīng)，用二環(huán)己碳二亞胺(DCC)或水溶性 碳二亞胺{1-乙基_3- (3- 二甲氨丙基)-碳二亞胺；1-環(huán)己-3- (2-瑪啉-4-乙基)碳二 亞胺_對(duì)甲基苯亞磺酸鹽}催化，得去甲睪酮_3-羧甲基肟活化物，該活化物與載體蛋白在 堿性條件下，與載體蛋白上氨基相聯(lián)，為去甲睪酮的免疫原。載體蛋白如牛血清白蛋白，卵 清蛋白，甲狀腺球蛋白，大鑰匙孔狀槭血藍(lán)蛋白。
3. 根據(jù)權(quán)利1-2所述，其特在于，合成一種酶標(biāo)抗原的方法用去甲睪酮_3-羧甲基肟活化物，在堿性條件下與酶相聯(lián)，其酶可為辣根過(guò)氧化物酶，堿性磷酸酶，P-半乳糖苷酶。
4. 根據(jù)權(quán)利1所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于，試劑盒溶液的優(yōu)化配制。標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品的配制，是用含O. 1% 0. 5%水楊酸鈉和0. 05% 0. 1%吐溫-20的0. 1 0. 01M的磷酸鹽緩沖溶液?？贵w稀釋液用含0. 1 0. 5%明膠的0. 1 0. 01M磷酸鹽緩沖溶液。 顯色液為二組份，其中， 一組份為顯色緩沖液，由磷酸氫二鈉和檸檬酸組成，每毫升含0. 2 0. 5iU 30% H202 ;另一組份為四甲基聯(lián)苯胺(TMB)液。TMB液用95%乙醇或二甲亞砜配制成lmg/ml濃度。
5. 根據(jù)權(quán)利l所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于，用采用羊抗兔抗體(二抗)包被 96或48孔酶標(biāo)板。用2%卵清蛋白液封閉孔中未吸附二抗的部位。
6. —種用直接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫測(cè)定方法，測(cè)定各種樣品中去甲睪酮(諾龍)的方法。其 特征在于(1) 樣品的前處理方法。用溶劑抽提方法，大大簡(jiǎn)化了測(cè)定過(guò)程。(2) 用權(quán)利l-5所述工藝組裝的試劑盒測(cè)定，檢測(cè)過(guò)程為用包被有羊抗兔抗體的酶標(biāo)板，加入去甲睪酮抗體，孵育后洗滌甩干，加入標(biāo)準(zhǔn)或樣品 溶液和酶標(biāo)抗原(去甲睪酮_辣根過(guò)氧化物酶)，孵育后洗滌甩干，加顯色劑顯色，終止，測(cè) 定。標(biāo)準(zhǔn)或樣品去甲睪酮濃度的對(duì)數(shù)值與0045。值呈反比。以此達(dá)到定量測(cè)定去甲睪酮的 目的。此直接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫測(cè)定試劑盒，檢測(cè)范圍為0. 05 4ng/ml，靈敏度可達(dá)0. 05ng/ ml。
全文摘要
本發(fā)明屬生物醫(yī)藥領(lǐng)域。公開(kāi)一種檢測(cè)去甲睪酮(諾龍)的直接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫測(cè)定試劑盒。本發(fā)明提供去甲睪酮抗原合成方案，首先用去甲睪酮合成去甲睪酮-3-羧甲基肟，后者在碳二亞胺催化下，用N-羥基丁二酰亞胺活化，與牛血清白蛋白結(jié)合，合成免疫原；與辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合，合成酶標(biāo)抗原。用免疫原，免疫新西蘭大白兔，獲得去甲睪酮多抗。測(cè)定時(shí)，用羊抗兔多抗(二抗)包被酶標(biāo)板，二抗與去甲睪酮多抗結(jié)合，洗滌后加入樣品或標(biāo)準(zhǔn)和酶標(biāo)抗原，顯色測(cè)定，就可得出結(jié)果。本發(fā)明試劑盒中配制的各試劑，使用方便。這為食品安全，藥物，及體育運(yùn)動(dòng)興奮劑檢測(cè)中，去甲睪酮的檢測(cè)，提供一個(gè)快速，特異，靈敏和準(zhǔn)確的檢測(cè)方法。
文檔編號(hào)G01N33/543GK101769921SQ200810204939
公開(kāi)日2010年7月7日 申請(qǐng)日期2008年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月30日
發(fā)明者徐基芳, 王文卓, 王武康 申請(qǐng)人:王武康