專利名稱：：促甲狀腺激素檢測微粒、其制備及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及促甲狀腺激素的診斷試劑，具體涉及基于光激化學發(fā)光原理的促甲狀腺激素檢測微粒、其制備及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：甲狀腺疾病是一組較常見的內(nèi)分泌疾病，包括缺碘性甲狀腺腫、其他原因引起的甲狀腺腫、甲亢、甲狀腺瘤、甲狀腺炎、甲狀腺功能減退等。甲狀腺病的發(fā)生率比較高。甲亢也就是甲狀腺功能亢進癥，它是一種臨床上十分常見的內(nèi)分泌疾病。是指由各種原因?qū)е录谞钕俟δ茉鰪?，甲狀腺激素分泌過多或因甲腺原氨酸(TSH)在血液中水平增高所導致的機體神經(jīng)系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)心血管系統(tǒng)等多系統(tǒng)的一系列高代謝癥候群以及高興奮癥狀和眼部癥狀。甲狀腺機能減退癥系甲狀腺激素TSH合成與分泌不足，或甲狀腺激素生理效應(yīng)不好、生物效應(yīng)不足而致的全身性疾病。臨床上可分為呆小病、幼年甲低、成人甲低。若功能減退始于胎兒或新生兒期，稱為克汀病；始于性發(fā)育前兒童稱幼年型甲減；始于成人稱成年型甲減。甲狀腺瘤是臨床常見病，其中絕大多數(shù)為良性病變，少數(shù)為癌，肉瘤、惡性淋巴瘤等。該病女性發(fā)病率明顯高于男性，男女發(fā)病比例約1:23。甲狀腺炎是以炎癥為主要表現(xiàn)的甲狀腺疾病，包括感染性和非感染性。不少見。臨床權(quán)威上所說的急性、亞急性及已經(jīng)慢性甲狀腺炎，只表明青年疾病過程的長短，它們之間無內(nèi)在聯(lián)系，也不互相轉(zhuǎn)變，每種具有發(fā)表不同的病因、有著臨床特點、病理過程及固有的結(jié)局。促甲狀腺激素(thyroid-stimulatinghormone,縮寫為TSH)，由垂體前葉分泌，促使甲狀腺產(chǎn)生并釋放T4和T3。它是一種分子量約為28000道爾頓的糖蛋白，由兩種不同的亞單位a、13組成。雖然人血中的TSH水平極低，但對保證正常的甲狀腺機能是至關(guān)重要的，TSH的釋放受下丘腦分泌的TSH釋放激素(TRH)所調(diào)節(jié)。TSH和TRH與甲狀腺激素的水平成反比。當血中有高水平的甲狀腺素時，下丘腦釋及TRH減少，因此垂體釋放TSH減少，如血中甲狀腺激素下降，則產(chǎn)生相反的結(jié)果。這種過程稱為負反饋，由此保持這些激素在血中的正常水平。TSH和垂體糖蛋白、黃體生成素(LH)、卵泡剌激素(FSH)和人絨毛膜促性腺激素(hCG)具有相同的a鏈，而|3鏈則不同，具有特有的氨基序列。檢測血清TSH對于甲狀腺功能亢進、甲狀腺功能減低及甲狀腺腫瘤的診斷或鑒別診斷，對甲狀腺功能相關(guān)疾病的發(fā)展過程、療效及預(yù)后評估中具有十分重要的意義。免疫學檢測是基于抗原和抗體的特異性反應(yīng)進行檢測的一種手段，由于其可以利用同位素、酶、化學發(fā)光物質(zhì)等對被檢測信號進行放大和顯示，因此常被用于檢測蛋白質(zhì)，激素等微量生物活性物質(zhì)。我國免疫學檢測基本經(jīng)歷了放射免疫檢測(興起于20世紀70年代，現(xiàn)仍普遍使用于縣級以上醫(yī)院)；酶聯(lián)免疫檢測(興起于20世紀80年代，各臨床機構(gòu)普遍使用)；以化學發(fā)光為代表的光生物學標記及免疫檢測技術(shù)(20世紀90年代開始推廣使用，產(chǎn)品步入成長期)三個階段。這一衍變過程主要是基于對檢測方法的敏感性、準確性、以及操作簡捷性的需求的不斷提高而決定的?；瘜W發(fā)光免疫分析(ChemiluminescenceImmunoassay)是近十年來在世界范圍內(nèi)發(fā)展非常迅速的非放射性免疫分析技術(shù)。檢測原理是以發(fā)光物質(zhì)作為信號放大系統(tǒng)并籍助其發(fā)光強度直接測定免疫結(jié)合。由于其高靈敏度，檢測范圍寬等優(yōu)點，已成為放射性免疫分析與普通酶免疫分析的取代者，是免疫學檢測重要的發(fā)展方向。但目前國內(nèi)自行研制的化學發(fā)光檢測試劑，大多為非均相反應(yīng)，采用化學底物直接標記，通過化學反應(yīng)激發(fā)。其分析過程與傳統(tǒng)酶標檢測類似，需反復(fù)清洗與分離，檢測耗時長，自動化程度不高。國外廠家檢測試劑隨發(fā)光基質(zhì)與檢測形式而各不相同。以Abbott，Bayer與Chiron等公司為代表的化學激發(fā)，即以化學發(fā)光底物直接標記抗原或抗體進行免疫測定。最常用的為吖啶酯，在堿性環(huán)境中可被過氧化氫氧化而發(fā)光。BD則以AKP，金鋼脘為基質(zhì)采用酶促化學發(fā)光。Roche則采用電化學發(fā)光(electrochemiluminescence，ECL)，發(fā)光底物二價的三聯(lián)吡啶釕及反應(yīng)參與物三丙胺在電極表面失去電子而被氧化。氧化的三丙胺失去一個H+而成為強還原劑，將氧化型的三價釕還原為激發(fā)態(tài)的二價釕，隨即釋放光子而恢復(fù)為基態(tài)的發(fā)光底物。這一過程在電極表面周而復(fù)始地進行，不斷地發(fā)出光子而常保持底物濃度的恒定。因反應(yīng)過程中牽涉到分離清洗，自動化設(shè)計復(fù)雜，儀器相當昂貴。此外，發(fā)光基質(zhì)的穩(wěn)定性也是一大問題。光激化學發(fā)光法通過引入激光技術(shù)與納米微球技術(shù)，成功地解決了上述不足。因反應(yīng)在均相中進行，既加快了反應(yīng)速度，又避免了反復(fù)分離與清洗步驟，能有效降低檢測背景值，減少反應(yīng)時間，并可實現(xiàn)自動化操作。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種可用于定量檢測血清中促甲狀腺激素的檢測微粒，其制備、檢測條件及應(yīng)用。本發(fā)明的技術(shù)原理本發(fā)明的促甲狀腺激素檢測試劑及試劑盒與光激化學發(fā)光檢測技術(shù)相關(guān)，光激化學發(fā)光免疫技術(shù)是一種利用化學發(fā)光物質(zhì)發(fā)射的光波進行免疫測定的方法。該技術(shù)主要整合了高分子微粒技術(shù)，有機合成，蛋白質(zhì)化學與臨床檢測相關(guān)領(lǐng)域的研究。本發(fā)明之所以能檢測血清中的促甲狀腺激素的水平，是由于在均相條件下，將內(nèi)部帶有染料的感光微粒(納米級)以及包被有抗促甲狀腺激素抗體(TSHAb)并且內(nèi)部帶有發(fā)光化合物的發(fā)光微粒(納米級)的混合物作為試劑和檢測樣品混合。此時納米感光微粒和包被有表面抗體的納米發(fā)光微?？裳杆儆行У夭蹲酱偌谞钕偌に?TSH)，在近距離內(nèi)，三者形成免疫夾心復(fù)合物。激發(fā)光照射后，納米感光微粒中的染料被誘導激活，并釋放高能態(tài)的活性氧離子(單線態(tài)氧)。該高能態(tài)的活性氧離子被近距離的納米發(fā)光微粒俘獲，從而傳遞能量以激活所述發(fā)光微粒中的發(fā)光化合物。數(shù)微秒后，發(fā)光微粒中的發(fā)光化合物將釋放出高能級紅光。用光子計數(shù)器測定這些高能級光子，并通過電腦將光子數(shù)換算為目標分子濃度，光子數(shù)的多少即精確地反映了目標分子的濃度。而當樣本不含促甲狀腺激素(TSH)時，無法在近距離形成免疫夾心復(fù)合物，活性氧離子也無法傳遞至發(fā)光微粒表面?；钚匝蹼x子在液相中迅速衰減，檢測時則無高能級紅光產(chǎn)生。具體原理參見圖1及圖2?；谏鲜鲈?，本發(fā)明第一方面提供了一種用于檢測促甲狀腺激素(TSH)的檢測微粒，為抗促甲狀腺激素抗體(TSHAb)包被的發(fā)光微粒。本發(fā)明第二方面提供了一種促甲狀腺激素(TSH)的檢測試劑盒，包括上述抗促甲狀腺激素抗體(TSHAb)包被的發(fā)光微粒。試劑盒中還可包括生物素標記的抗促甲狀腺激素抗體(TSHAb)和/或親和素包被的感光微粒。在試劑盒中，上述抗促甲狀腺激素抗體(TSHAb)包被的發(fā)光微粒、生物素標記的抗促甲狀腺激素抗體(TSHAb)和親和素包被的感光微粒分別獨立包裝，且均為混懸液。上述含有抗促甲狀腺激素抗體(TSHAb)包被的發(fā)光微粒、生物素標記的抗促甲狀腺激素抗體(TSHAb)或親和素包被的感光微粒的溶液的溶劑可以是常規(guī)的適合抗原抗體反應(yīng)的溶劑體系，如HEPES緩沖體系、Tris緩沖體系。抗促甲狀腺激素抗體(TSHAb)包被的發(fā)光微粒的溶劑優(yōu)選PH8.0的成分為HEPES、NaCl和EDTA-Na_2H20的HEPES緩沖液，生物素標記的抗促甲狀腺激素抗體(TSHAb)的溶劑優(yōu)選pH8.0的成分為Tris、NaCl和EDTA-Na_2H20的Tris緩沖液，親和素包被的感光微粒的溶劑優(yōu)選HEPES、NaCl和EDTA-Na_2H20的HEPES緩沖液，上述各種溶劑中還可添加起封閉和蛋白保護作用的物質(zhì)如BSA以及防止微粒聚集的穩(wěn)定試劑如Tween20，出于對試劑防腐以及長期儲存的考慮還可在溶劑中添加防腐劑，防腐劑優(yōu)選100U/ml慶大霉素和質(zhì)量百分比為萬分之五的Proclin300作為防腐劑。試劑盒中還可包括陽性對照、陰性對照以及參考樣品。參考樣品為含有促甲狀腺激素的溶液，其促甲狀腺激素的濃度為促甲狀腺激素臨床cutoff點對應(yīng)的濃度。在用于定量檢測促甲狀腺激素(TSH)時，試劑盒中可包括含有多種已知促甲狀腺激素(TSH)濃度的溶液。上述不同促甲狀腺激素(TSH)濃度的溶液分別獨立包裝。上述發(fā)光微粒是指填充有發(fā)光化合物和鑭系元素化合物的高分子微粒。發(fā)光化合物可以是Dioxene(二氧雜環(huán)己烯)或thioxene(二甲基噻吩)的衍生物等，鑭系元素化合物可以是Eu(TTA)3/TOPO或Eu(TTA)3/Phen等，該微?？捎墒袌錾腺彽?。研究發(fā)現(xiàn)，由于最終的檢測反應(yīng)是均相反應(yīng)，發(fā)光微粒的粒徑(微粒的平均直徑)太大(>400nm)會自然沉降，影響檢測效果，微粒的粒徑太小(<lOOnm)，會使制備過程中的清洗工作比較困難，對抗體連接工作不利，因此發(fā)光微粒的粒徑范圍應(yīng)在100-400nm之間，較好為150-300nm之間，優(yōu)選250nm。發(fā)光微粒的表面官能團可以是任何能聯(lián)接蛋白質(zhì)的基團，但最常用的主要有羧基和醛基表面官能團的微粒。使用不同的微粒表面官能團，連接抗體的反應(yīng)方式和條件也不相同。鑒于獲得更好的抗促甲狀腺激素抗體(TSHAb)的連接效率，試劑穩(wěn)定性和連接重復(fù)性，在采用之后記載的改進方法作為抗體的連接方法時優(yōu)選羧基表面官能團的微粒。發(fā)光微粒的發(fā)光量會直接影響最終檢測的發(fā)光效果。市場提供的發(fā)光微粒發(fā)光量一般會在150，000-350，000光子數(shù)/100yg發(fā)光微粒范圍內(nèi)，優(yōu)選中等強度偏上的水平(>250，000光子數(shù)/100ug)發(fā)光微粒。上述生物素標記的抗體(TSHAb)中，生物素與抗體的分子比例較佳為(20-40):1，優(yōu)選30:i。上述感光微粒是填充有感光化合物的高分子微粒。在670-690nm光激發(fā)下，可以產(chǎn)生單線態(tài)氧離子，當其與發(fā)光微粒距離足夠近的情況下，單線氧離子傳遞到發(fā)光微粒，與發(fā)光微粒中的發(fā)光化合物反應(yīng)，產(chǎn)生紫外光，紫外光再進一步激發(fā)鑭系元素化合物，產(chǎn)生520-620nm波長光子。感光化合物可以是酞菁染料等，該微粒也可由市場上購得。上述親和素包被的感光微粒中，親和素與感光微粒的質(zhì)量比例無特殊限制，較佳為1:(3-10)，優(yōu)選1:5。市售感光微粒均適用于本發(fā)明，微粒粒徑較佳為180-260nm，優(yōu)選220nm。抗促甲狀腺激素抗體(TSHAb)包被的發(fā)光微粒采用NaBH3CN的還原胺化反應(yīng)法制備，反應(yīng)步驟如下1)混合將發(fā)光微粒與抗促甲狀腺激素抗體(TSHAb)按質(zhì)量比例為10:(1_3)混合于緩沖液中；2)反應(yīng)加入緩沖液配制的NaBH3CN溶液混合并反應(yīng)；3)封閉加入緩沖液配制的Gly及NaBH3CN溶液，混勻反應(yīng)后，再加入BSA溶液封閉；4)清洗產(chǎn)物，獲得抗促甲狀腺激素抗體(TSHAb)包被的發(fā)光微粒。其中，混合步驟中，發(fā)光微粒與抗促甲狀腺激素抗體(TSHAb)的質(zhì)量比例為10:(1-3)，優(yōu)選10:2。反應(yīng)緩沖液可為MES緩沖液、磷酸緩沖液，優(yōu)選MES緩沖液，濃度優(yōu)選0.05M，反應(yīng)步驟中，反應(yīng)溶液中發(fā)光微粒的濃度可為10-40mg/ml，優(yōu)選20mg/ml。改進的，抗促甲狀腺激素抗體(TSHAb)包被的發(fā)光微?？刹捎孟率龇椒ㄖ频?)混合將發(fā)光微粒與抗促甲狀腺激素抗體(TSHAb)混合于緩沖液中。較佳的，緩沖液為MES緩沖液，發(fā)光微粒與抗促甲狀腺激素抗體(TSHAb)的質(zhì)量比例為(8-15):1，優(yōu)選12.5:1。2)反應(yīng)加入緩沖液配制的EDAC(l-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽)溶液混合并反應(yīng)。較佳的，緩沖液為MES緩沖液，混合溶液中，發(fā)光微粒與EDAC的質(zhì)量比為(15-40):l混合，優(yōu)選質(zhì)量比為25:1。反應(yīng)條件為37t:旋轉(zhuǎn)反應(yīng)。一般約48小時反應(yīng)充分。3)往步驟2獲得的反應(yīng)液中加入緩沖液配制的牛血清白蛋白(Bovineserumalbumin,縮寫為BSA)溶液混勻并反應(yīng)。較佳的，緩沖液為MES緩沖液。BSA溶液與步驟2獲得的反應(yīng)液體積比較佳為i:i-i:2。反應(yīng)條件為37t:旋轉(zhuǎn)反應(yīng)。一般約16小時反應(yīng)充分。4)清洗產(chǎn)物，獲得抗促甲狀腺激素抗體(TSHAb)包被的發(fā)光微粒。清洗的方式可以為離心法清洗或透析法清洗。透析法清洗步驟采用反應(yīng)緩沖液透析，每次4-5小時，更換緩沖液4次。透析清洗操作時間較長，且微粒損失較多，造成收率降低。離心法清洗步驟包括離心去上清，加入反應(yīng)緩沖液洗滌，超聲處理打開沉淀，如此反復(fù)3-5次。離心法清洗時離心力會使發(fā)光微粒暫時聚集在一起，但經(jīng)過超聲處理可以很容易再次分散打開，此法操作時間短，且收率較高。因此優(yōu)選采用此種清洗方式。上述改進的制備方法與NaBH3CN的還原胺化反應(yīng)法的主要差別在于主要反應(yīng)試劑NaBH3CN替換成了EDAC，該試劑的替換，不僅使得反應(yīng)時間與NaBH3CN的還原胺化反應(yīng)法相比縮短了4個多小時，而且發(fā)光微粒與抗促甲狀腺激素抗體(TSHAb)的交聯(lián)效率獲得了提高，節(jié)省了抗體用量，此外，試驗表明，該方法制得的檢測微粒與NaBH3CN的還原胺化反應(yīng)法制得的檢測微粒相比，在相同條件下反應(yīng)信號更強，靈敏度更高，檢測范圍也更廣。親和素包被的感光微粒可采用NaBH3CN的還原胺化反應(yīng)法制備。本發(fā)明第三方面，公開了上述試劑盒的使用方法，包括下列步驟將待測樣品與試劑盒中用于檢測促甲狀腺激素(TSH)的檢測微粒、生物素標記的抗促甲狀腺激素抗體(TSHAb)和親和素包被的感光微?；旌戏磻?yīng)，而后用激發(fā)光照射反應(yīng)孔，測量每個反應(yīng)孔發(fā)光光子量獲得光信號值。上述激發(fā)光光源波長范圍為600-700nm，優(yōu)選640_680nm;反應(yīng)孔發(fā)光的發(fā)射光光源波長范圍為600-680nm，優(yōu)選610_620nm;發(fā)射光延遲時間范圍為lOOms-lOOOms;激發(fā)光光源的功率范圍為5-100mw，優(yōu)選40-60w。較佳的，上述試劑盒的使用方法具體為1)在反應(yīng)孔中加入樣品、試劑盒中用于檢測促甲狀腺激素(TSH)的檢測微粒和生物素標記的抗促甲狀腺激素抗體(TSHAb)，獲得初始反應(yīng)溶液，混合反應(yīng)；2)再加入親和素包被的感光微粒獲得最終反應(yīng)溶液進行反應(yīng)；3)激發(fā)光照射反應(yīng)孔，測量每個反應(yīng)孔發(fā)光光子量獲得光信號值。上述步驟1的反應(yīng)條件為37t:溫育10-30分鐘，優(yōu)選20分鐘，步驟2的反應(yīng)條件也為37。C溫育10-30分鐘，優(yōu)選15分鐘。步驟1中，抗促甲狀腺激素抗體(TSHAb)包被的發(fā)光微粒為試劑混懸液，抗促甲狀腺激素抗體(TSHAb)包被的發(fā)光微粒在混懸液試劑中的濃度無特殊限制，可以為30-90iig/ml，優(yōu)選50iig/ml。步驟1中，生物素標記的抗促甲狀腺激素抗體(TSHAb)也為試劑混懸液，生物素標記的抗促甲狀腺激素抗體(TSHAb)在混懸液試劑中的濃度無特殊限制，可以為l-5i!g/ml，tt^4yg/ml。步驟2中，親和素包被的感光微粒為試劑混懸液，親和素包被的感光微粒在混懸液試劑中的濃度一般控制在30-50iig/ml，優(yōu)選40ug/ml。上述方法中，初始反應(yīng)溶液的體積無特殊限制，可以為30-75iU，優(yōu)選75ul;最終反應(yīng)溶液的體積也無特殊限制，可以為100-250iU，優(yōu)選250ul。上述樣品包括血清、血槳和全血。當本發(fā)明的檢測微粒及檢測試劑盒用于定量檢測促甲狀腺激素(TSH)時，還需根據(jù)標準曲線計算待測樣品TSH的含量。本發(fā)明是采用光激化學發(fā)光檢測技術(shù)，定量測定人血清樣品中促甲狀腺激素(TSH)的體外診斷試劑盒，可以與其它血清和臨床信息聯(lián)合用于甲狀腺疾病的輔助診斷及病人治療效果的監(jiān)測。本發(fā)明與檢測對象相近的促甲狀腺激素(TSH)酶免法試劑盒在方法學上比較，酶免法以O(shè)D值體現(xiàn)樣本檢測值，OD值可檢測范圍窄，僅可做定性檢測，且靈敏度低。本發(fā)明的試劑盒采用光激化學發(fā)光法測定標本中的TSH，具有靈敏度高、檢測范圍寬等特點，在方法學上較酶免法能達到更高的靈敏度和更優(yōu)的檢測范圍。圖1:光激化學發(fā)光免疫技術(shù)原理圖微粒結(jié)合形成二聚體，產(chǎn)生光子信號圖2:光激化學發(fā)光免疫技術(shù)原理圖未結(jié)合微粒，無光子信號產(chǎn)生圖3:單線態(tài)氧隨微粒間距離衰減，在大概600nm的距離，基本沒有單線氧的存在，因此也不發(fā)光FGBEAD:發(fā)光微粒，內(nèi)含發(fā)光分子；GGBEAD:感光微粒，內(nèi)含感光分子；SingletOxygen:單線態(tài)氧，活性氧離子；A/B:兩者可直接或間接特異結(jié)合的活性分子。如在雙抗夾心檢測中，A，B為針對靶分子C不同的表位的單克隆抗體圖4:比較試驗測試結(jié)果示意圖具體實施例方式下面結(jié)合實施例進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法及未說明配方的試劑均為按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆試驗手冊(NewYork:CoIdSpringHarborLaboratoryPress，1989)中所述的條件或者制造商建議的條件進行或配置。實驗中儀器原料來源及試劑配方原料及試劑廠家Biotin-X-X-NHSSigmaTLC>95%BSAEquitech/proteasefreeGlySigma>95%HEPES經(jīng)科宏達Tris國藥NaBH3CNAcrosAvidinPierceEDACSigma抗-TSH抗體Medix感光微粒美國PentaTek公司發(fā)光微粒美國PentaTek公司儀器型號廠家光激化學發(fā)光分析儀HT上海博陽醫(yī)療儀器公司紫外分光光度計752P上海光譜公司高速冷凍離心機CR21GHITACHI分析天平ALC-2100.2ACCULAB分析天平AG285METTLERPH計DELTA320METTLER粒徑儀Model370Nicomp酶標儀MultiS薩MK3labsystem超聲波清洗器KQ5200E昆山超聲儀器公司漩渦混合器QL--901其林貝爾[OO96]磁力攪拌器(79-1)2003-03國華實施例ITSHAb包被的發(fā)光微粒的制備抗體與發(fā)光微粒制備方法1)發(fā)光微粒混懸液處理吸取一定量的羧基發(fā)光微粒于高速冷凍離心機中離心，棄去上清，加入一定量MES緩沖液，超聲破碎至微粒重新懸浮，加入MES緩沖液調(diào)節(jié)發(fā)光微粒濃度至100mg/ml。2)抗體處理TSH抗體于0.05Mp朋.0的MES緩沖液(以下簡稱MES緩沖液)透析，透析完成后測定濃度，并調(diào)節(jié)濃度至8mg/ml。3)MES緩沖液、100mg/ml的發(fā)光微?；鞈乙?MES緩沖液)和8mg/ml的抗-TSH(MES緩沖液)以及，以l:1:1的體積比進行混合，迅速混勻，得到反應(yīng)液。4)用MES緩沖液配制40mg/ml的EDAC溶液，按照與發(fā)光微粒100mg/100uLEDAC的比加入，迅速混勻，37°C旋轉(zhuǎn)反應(yīng)48小時。5)加入200mg/ml的BSA溶液(MES緩沖液)，其與反應(yīng)液體積比為5:8，迅速混勻，37t:旋轉(zhuǎn)反應(yīng)16小時。6)用MES緩沖液離心清洗四次，最后用發(fā)光試劑緩沖液進行懸浮，測定粒徑和固含量，調(diào)節(jié)濃度至10mg/ml。將上述方法與采用NaBH3CN的還原胺化反應(yīng)法制得的檢測微粒進行比較。NaBH^N還原胺化反應(yīng)法的制備方法1)發(fā)光微粒混懸液處理吸取一定量的發(fā)光微粒于高速冷凍離心機中離心，棄去上清，加入一定量Mes緩沖液，超聲破碎至微粒重新懸浮，加入磷酸緩沖液調(diào)節(jié)發(fā)光微粒濃度至100mg/ml。2)抗體處理TSH抗體于0.02MpH7.0的Mes緩沖液透析，透析完成后測定濃度，并調(diào)節(jié)濃度至8mg/ml。3)Mes緩沖液、100mg/ml的發(fā)光微?；鞈乙?Mes緩沖液)和8mg/ml的TSH抗體(Mes緩沖液)以及，以l:2:5的體積比進行混合，迅速混勻，得到反應(yīng)液。4)用Mes緩沖液配制25mg/ml的NaBH3CN溶液，按照與反應(yīng)液l:25的體積比加入，迅速混勻，37°C旋轉(zhuǎn)反應(yīng)48小時。5)Mes緩沖液配制75mg/ml的Gly溶液以及25mg/ml的NaBH3CN溶液，按照與反應(yīng)液2:1:10的體積比加入上述溶液中，混勻，37t:旋轉(zhuǎn)反應(yīng)2小時。再加入200mg/ml的BSA溶液(Mes緩沖液)，其與反應(yīng)液體積比為5:8，迅速混勻，37。C旋轉(zhuǎn)反應(yīng)16小時。6)用PB緩沖液離心清洗四次，最后用發(fā)光試劑緩沖液進行懸浮，測定粒徑和固含量，調(diào)節(jié)濃度至10mg/ml。兩者制備結(jié)果的比較1.節(jié)省了制備時間原有制備工藝新制備工藝制備lOOmg交聯(lián)抗體的發(fā)光微粒72h68h2.提高了抗體交聯(lián)效率，節(jié)省了抗體用量<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>參照上述的制備方法制備TSHAb包被的發(fā)光微粒，并通過各項性能測試比較從以下幾方面進行了具體工藝條件的選擇研究。本實施例中涉及的各個參數(shù)的檢測方法如下1.光信號檢測方法在反應(yīng)孔中分別加入25iil樣品，再依次加入25ia發(fā)光試劑(50iig/ml)和251生物素化抗體試劑(1yg/ml)。然后放入儀器(光激化學發(fā)光分析系統(tǒng))，由儀器自動按以下步驟操作振動，37t:溫育20分鐘，再自動加入175親和素包被的感光微粒試劑(40g/ml)后37t:溫育15分鐘。儀器自動產(chǎn)生激光照射微孔計算每孔發(fā)光光子量。檢測TSH濃度分別為1.OuIU/ml和9.OuIU/ml的質(zhì)控品光信號，每個濃度做10孔重復(fù)測定，代入公式，計算CV值。低濃度的精密性測定表示為QCL，高濃度的精密性測定表示為QCH。2.靈敏度檢測方法檢測10孔定標品10uIU/ml，計算其RLU均值(AVE)和二個標準偏差(SD)，以AVE+2SD反代入標準曲線，得到的濃度值即為本試劑盒的分析靈敏度，經(jīng)檢測兩個批號的試劑，其分析靈敏度分別為0.002uIU/ml、0.003uIU/ml，均不高于0.OluIU/ml。3.工藝條件選擇1)發(fā)光試劑緩沖液的選擇根據(jù)相應(yīng)的文獻資料，并結(jié)合本發(fā)明的特點，選擇PH8.0的成分為HEPES、NaCl和EDTA-Na-2H20的HEPES緩沖液，并在其中添加起封閉和蛋白保護作用的BSA以及防止微粒聚集穩(wěn)定試劑的Tween20后作為發(fā)光試劑的緩沖液。2)發(fā)光試劑防腐劑的考察出于對試劑防腐以及長期儲存的考慮，我們選擇萬分之五Proclin300作為防腐劑進行考察。分別使用未添加防腐劑及添加萬分之五Proclin300作為防腐劑的發(fā)光試劑緩沖液配制發(fā)光試劑對企業(yè)內(nèi)控品進行檢測，分別考察靈敏度、特異性、準確性、精密度等指標。結(jié)果見下表未添加防腐劑添加防腐劑靈敏度(uIU/ml)o駕O避Hook(1000IU/ml檢測濃度值)>100>100QCH均值8.948.95cv(%)3.403.84QCL均值1,111.06cv(%)4.854.46對上述結(jié)果進行分析比較，發(fā)現(xiàn)添加Proclin300作為防腐劑對我們的試劑體系沒有明顯的影響，所以我們選擇濃度萬分之五Proclin300作為發(fā)光試劑緩沖液的防腐劑。3)發(fā)光微粒與TSHAb的反應(yīng)比例發(fā)光微粒抗TSH抗體分別按下表中的比例包被，比較選取最佳的包被反應(yīng)比例。檢測其靈敏度、精密性等。其它反應(yīng)條件0.05MpH6.0的MESbuffer作為反應(yīng)緩沖液，20mg/ml的發(fā)光微粒反應(yīng)濃度，離心法清洗。檢測結(jié)果如下表發(fā)光微粒與抗TSH反應(yīng)比例的比較12<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>抗體加入量與發(fā)光微粒上包被的抗體量基本呈正比關(guān)系，但抗體繼續(xù)增加時包被上的抗體達到飽和。綜合考慮QC結(jié)果及成本問題，選擇發(fā)光微粒與抗-TSH抗體的質(zhì)量比例為12.5:1作為反應(yīng)條件。4)清洗方式的選擇透析法清洗步驟100倍體積透析，每次4-5小時，更換緩沖液2次。透析清洗操作時間較長，且清洗不徹底。離心法清洗步驟12000rpm離心30分鐘，清洗3次，沉淀以超聲法重懸。這種方法清洗所用時間較短，效果好。綜合考慮選用離心法清洗。最終選擇250nm的粒徑，發(fā)光量為》250，000光子數(shù)/100ug的發(fā)光微粒，1%BSA的O.OIMpH7.4PBS作為稀釋液，萬分之五Proclin300作為防腐劑，10:2的發(fā)光微粒與TSHAb的比例，離心法清洗作為最優(yōu)制備條件。實施例2生物素標記抗體的制備制備方法1)抗體處理將抗-TSH抗體透析于0.1MNaHC03溶液，測定抗體濃度并調(diào)節(jié)至lmg/ml。2)用DMSO配制16.17mg/ml的Biotin溶液。3)標記取處理好的lmg/ml抗-AFP抗體標記抗體與配制好的Biotin溶液，二者按照72:10000的體積比進行混合，迅速混勻。4。C靜置反應(yīng)1216小時。4)透析將反應(yīng)好的生物素標記抗體透析于生物素標記透析緩沖液(pH8.0)。5)將透析好的生物素化抗體吸出轉(zhuǎn)移至干凈離心管中，取樣測定抗體濃度。將質(zhì)檢合格的生物素標記抗體濃度調(diào)節(jié)至0.5mg/ml。將抗體與Biotin按照不同比例進行反應(yīng)并進行檢測本實施例中涉及的各個參數(shù)的檢測方法如下1、生物素與抗TSH抗體比例的選擇將Biotin-X-X-NHS:抗體按照20:1、30:1、40:1的不同比例進行標記，比較選取最佳的標記比例。檢測其靈敏度、精密性等。檢測結(jié)果如下表抗體與生物素的標記比例比較13<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>從靈敏度、Hookeffect、成本等方面進行考慮，最終選擇30:1的比例。2、生物素標記抗TSH抗體的緩沖液的選取本實施例中，選擇pH8.0的成分為Tris、NaCl和EDTA-Na_2H20的Tris緩沖液，并在其中添加起封閉和蛋白保護作用的BSA以及防止微粒聚集穩(wěn)定試劑的Tween20后作為生物素化抗體的緩沖液。3、生物素化抗體緩沖液中防腐劑的選擇出于對試劑防腐以及長期儲存的考慮，選擇萬分之五Proc1in300作為防腐劑進行考察。分別使用未添加防腐劑及添加萬分之五Proclin300作為防腐劑的生物素化抗體緩沖液配制生物素化抗體對企業(yè)內(nèi)控品進行檢測，分別考察靈敏度、精密度等指標。結(jié)果見下表<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>對上述結(jié)果進行分析比較，發(fā)現(xiàn)添加Proclin300作為防腐劑對試劑體系沒有明顯的影響，因此選擇萬分之五Proclin300作為生物素化抗體緩沖液的防腐劑。4、發(fā)光微粒試劑與生物素化抗體濃度的選擇1)發(fā)光試劑和生物素化抗體濃度的初篩分別配制濃度為30ug/ml、60ug/ml、90ug/ml的發(fā)光試劑以及濃度為lug/ml、3ug/ml、5ug/ml的生物素化抗體交叉配對進行檢測，結(jié)果分別如下30ug/ml發(fā)光試劑<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>[one]60ug/ml發(fā)光試劑<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>[O178]90ug/ml發(fā)光試劑<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>對上述結(jié)果進行分析比較，發(fā)光試劑的濃度在30ug/ml-60ug/ml之間，生物素化抗體的濃度在3ug/ml-5ug/ml之間結(jié)果較為理想。2)發(fā)光試劑和生物素化抗體濃度的精篩根據(jù)初篩的結(jié)果分別配制濃度為30ug/ml、50ug/ml、60ug/ml的發(fā)光試劑以及濃度為3ug/ml、4ug/ml、5ug/ml的生物素化抗體交叉配對進行檢測，結(jié)果分別如下30ug/ml發(fā)光試劑<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>50ug/ml發(fā)光試劑<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>60ug/ml發(fā)光試劑<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>對上述結(jié)果進行分析比較，發(fā)光試劑的濃度在50ug/ml，生物素化抗體的濃度在4ug/ml時結(jié)果最為理想，故選擇以上濃度為工作濃度。實施例3親和素包被的感光微粒的制備感光微粒采用粒徑為220±40nm的感光微粒(美國PentaTek公司)制備方法a、感光微?；鞈乙禾幚砦∫欢康母泄馕⒘Ｓ诟咚倮鋬鲭x心機中離心，棄去上清，加入一定量MES緩沖液，超聲細胞破碎儀上超聲至微粒重新懸浮，加入MES緩沖液調(diào)節(jié)感光微粒濃度至100mg/ml。b、親和素溶液配制稱量一定量Avidin，加MES緩沖液溶解至8mg/ml。c、混合將處理好的感光微?；鞈乙?、8mg/ml的Avidin以及MES緩沖液，以2:5:1的體積比進行混合，迅速混勻，得到反應(yīng)液。d、反應(yīng)MES緩沖液配制25mg/ml的NaBH3CN溶液，按照與反應(yīng)液1:25的體積比加入，迅速混勻。37t:旋轉(zhuǎn)反應(yīng)48小時。e、封閉MES緩沖液配制75mg/ml的Gly溶液以及25mg/ml的NaBH3CN溶液，按照與反應(yīng)液2:1:10的體積比加入上述溶液中，混勻，37t:旋轉(zhuǎn)反應(yīng)2小時。再加入200mg/ml的BSA溶液(MES緩沖液)，其與反應(yīng)液體積比為5:8，迅速混勻，37。C旋轉(zhuǎn)反應(yīng)16小時。f、清洗向反應(yīng)好的溶液中加入MES緩沖液，高速冷凍離心機離心，棄上清，加入新鮮MES緩沖液超聲法重新懸浮，再次離心，如此清洗3次，最后用少量的感光試劑緩沖液進行懸浮，測定固含量，用感光試劑緩沖液調(diào)節(jié)濃度至10mg/ml。實施例4促甲狀腺激素定量檢測首先向反應(yīng)孔中分別加入樣品，再依次加入發(fā)光試劑(抗體包被的發(fā)光微粒)和生物素標記抗體。然后放入儀器(光激化學發(fā)光分析系統(tǒng))，由儀器自動按以下步驟操作振動，37t:溫育。再自動加入親和素包被的感光微粒后37t:再次溫育。溫育結(jié)束后儀器自動產(chǎn)生激光照射微孔計算每孔發(fā)光光子量。按上述方法檢測各個定標品的發(fā)光光子量，將測得的光信號值與相應(yīng)的定標品濃度采用cubicspline擬和作圖即得，標準曲線呈線性。在定量測定中，根據(jù)標準曲線，按樣本實測光信號值計算每一個樣本的TSH含量，單位是uIU/ml。檢測條件的優(yōu)化試驗1、溫育時間的確定試驗材料采用抗體包被的50iig/ml的發(fā)光微粒試劑和4yg/ml的生物素標記抗體試劑，及40g/ml的親和素包被的感光微粒試劑。檢驗樣本靈敏度參考品和質(zhì)控品QcL，QcH。初始反應(yīng)條件加樣量為樣品251，發(fā)光微粒試劑25y1，生物素標記抗體試劑25iU，親和素包被的感光微粒試劑為175iU，兩步溫浴。1.1第一步溫育時間的確定第一步分別實驗溫育時間分別為10min、15min、20min、30min，第二步溫育時間為15min，比較選取最適溫育時間。以四種不同溫育時間檢測其靈敏度、精密度、線性。檢測結(jié)果如下表第一步溫育時間的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>根據(jù)以上實驗結(jié)果可知，在其余條件相同的情況下，第一步溫育時間為20min結(jié)果已經(jīng)趨于穩(wěn)定，延長第一步溫育時間已經(jīng)沒有實際意義，故將第一步溫育時間確定為20min。1.2第二步溫育時間的確定第一步溫育時間為20min，第二步分別實驗溫育時間分別為10min、15min、20min、30min，比較選取最適溫育時間。以四種不同溫育時間檢測其靈敏度、精密度、線性。檢測結(jié)果如下表第二步溫育時間的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>根據(jù)以上實驗結(jié)果可知，在其余條件相同的情況下，第二步溫育時間為15min結(jié)果已經(jīng)趨于穩(wěn)定，延長第二步溫育時間已經(jīng)沒有實際意義，故將第二步溫育時間確定為15min。2、加樣模式的考察試驗材料采用抗體包被的50pg/ml的發(fā)光微粒試劑(下簡稱發(fā)光抗體試劑)4iig/ml的生物素標記抗體試劑，及40pg/ml的親和素包被的感光微粒試劑。檢驗樣本靈敏度參考品和質(zhì)控品QcL，QcH。初始反應(yīng)條件依次添加樣品、發(fā)光微粒試劑、生物素標記抗體試劑、親和素包被的感光微粒，兩步溫浴，其中第一溫浴時間為20min，第二溫浴時間為15min。根據(jù)關(guān)于抗原-抗體反應(yīng)時間的文獻資料，并結(jié)合本方法的特點設(shè)計了三種加樣模式進行考察。模式1:10ul樣品+10ul發(fā)光試劑+10ul生物素化抗體+70ul親和素包被的感光微粒試劑；模式2:15ul樣品+15ul發(fā)光試劑+15ul生物素化抗體+105ul親和素包被的感光微粒試劑；模式3:25ul樣品+25ul發(fā)光試劑+25ul生物素化抗體+175ul親和素包被的感光微粒試劑。按照以上三種加樣模式對企業(yè)內(nèi)控品進行檢測，分別考察靈敏度、準確性、精密度等指標。結(jié)果見下表模式l模式2模式3靈敏度o廁0.0020扁QCH均值9.279.038,69cv(%)3.134.533.卯QCL均值1.041.161.05cv(%)3.643.784.58對上述結(jié)果進行分析比較，在其余條件相同的情況下，并考慮到手工加樣樣品量過小會造成不便于操作的影響以及更容易產(chǎn)生誤差，所以選擇模式3為加樣模式。183、親和素包被的感光微粒的濃度的篩選發(fā)光抗體濃度選用150iig/ml，生物素化抗體的濃度選用0.15yg/ml，親和素包被的感光微粒濃度分別配制為30iig/ml，40iig/ml，50iig/ml，在初始反應(yīng)條件下，結(jié)果如下<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>根據(jù)靈敏度比較，QcL和QcH的測定濃度，親和素包被的感光微粒濃度在40yg/ml時結(jié)果最為理想。實施例5定標品的配制用稱重法將中國藥品生物制品檢定所的TSH國家定標品以新生牛血清為稀釋液將其配制為OuIU/ml、0.05uIU/ml、0.4uIU/ml、4uIU/ml、30uIU/ml、100uIU/ml的定標品系列。實施例6評價試驗試劑采用發(fā)光抗體試劑(50g/ml)、生物素標記抗體試劑(4yg/ml)及親和素包被的感光微粒試劑(40iig/ml)。檢測方法在反應(yīng)孔中分別加入25ii1樣品，再依次加入25ii1發(fā)光試劑和25y1生物素化抗體試劑。然后放入儀器，由儀器自動按以下步驟操作振動，37t:溫育20分鐘，再自動加入親和素包被的感光微粒試劑175后37t:溫育15分鐘。儀器自動產(chǎn)生激光照射微孔計算每孔發(fā)光光子量，根據(jù)標準曲線可以推算樣品TSH濃度，單位是uIU/ml，最后打印試驗報告。1、檢測范圍本試劑盒線性檢測范圍為0.01-100uIU/ml，對其用雙對數(shù)模型擬合，劑量-反應(yīng)曲線相關(guān)系數(shù)(r)的絕對值不低于O.9900。如要準確的測定樣品中TSH濃度值，樣品中TSH濃度值應(yīng)不超出0.01-100uIU/ml定標品曲線的濃度范圍，超出此范圍的測定結(jié)果是通過曲線外延得出的計算結(jié)果。經(jīng)本試劑盒對大量的臨床樣本的檢驗結(jié)果可知道，大部分樣本結(jié)果小于100uIU/ml，因此，本試劑盒設(shè)定的檢測范圍為0.01-100uIU/ml完全可滿足臨床應(yīng)用要求。2、分析靈敏度的檢測檢測10孔定標品10uIU/ml，計算其RLU均值(AVE)和二個標準偏差(SD)，以AVE+2SD反代入標準曲線，得到的濃度值即為本試劑盒的分析靈敏度，經(jīng)檢測兩個批號的試劑，其分析靈敏度分別為0.002uIU/ml、0.003uIU/ml，均不高于0.01uIU/ml。3、功能靈敏度檢測以0.luIU/mlTSH定標品倍比稀釋成0.05、0.025、0.0125、0.00625、0uIU/ml，每個點作10孔加樣檢測，共60L以TSH定標品系列檢測其濃度值，并以CV為Y軸，濃度值為X軸，計算CV為20%時相對應(yīng)的濃度值，經(jīng)檢測兩個批號的試劑，本試劑盒功能靈敏度分別為0.006uIU/ml、0.006uIU/ml。4、精密度檢測分別采用2個批號的TSH試劑盒對質(zhì)控品QCL、QCH進行1次檢測，每次復(fù)測10孔，每份樣品共檢測20次。得到如下結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>由上述結(jié)果可知，本產(chǎn)品其批內(nèi)精密性小于10%、批間精密性小于15%。5、線性檢測對除0值外其他5點定標品用雙對數(shù)或其他數(shù)學模型擬合，劑量_反應(yīng)曲線相關(guān)系數(shù)(r)的絕對值應(yīng)不低于O.9900。經(jīng)檢測兩個批號的試劑盒，其線性r值分別為0.9963、0.998。6、Hook實驗<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>由上述結(jié)果可知，本試劑盒的HOOK效應(yīng)在1000uIU/ml未見。7、干擾性實驗在已知濃度的臨床標本1#、2#、3#中加入250mg/dL血紅蛋白、500mg/dL甘油三酯、10mg/dL膽紅素，以本試劑盒進行檢測，結(jié)果如下表表1試劑盒批號20060809(單位uIU/ml)<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>表2試劑盒批號20060811(單位uIU/ml)<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>由上述結(jié)果可知，500mg/dL甘油三酯和10mg/dL膽紅素對本產(chǎn)品無明顯干攏，但250mg/dL血紅蛋白對本產(chǎn)品檢測結(jié)果產(chǎn)生影響，因此盡量避免樣本嚴重溶血。實施例7比較試驗試劑采用發(fā)光抗體試劑(50g/ml)、生物素標記抗體試劑(4yg/ml)及親和素包被的感光微粒試劑(40iig/ml)。以西門子公司的TSH試劑盒為參照進行了質(zhì)量水平比較，所用標本為實施例5中的靈敏度參考品，結(jié)果如圖4所示。由圖4所示的結(jié)果可知，本發(fā)明的試劑盒檢測結(jié)果與西門子結(jié)果相關(guān)性r=0.990，且該試劑盒成本底、靈敏度高、精密性好、檢測范圍寬、操作簡便、省時，適合于向臨床推廣實施例8試劑盒的組配將實施例1-3中按照各種方法制備的的三種試劑分別獨立包裝，組配后獲得基本試劑盒。可用于定量檢測樣品中TSH的濃度。權(quán)利要求一種用于檢測促甲狀腺激素的檢測微粒，為抗促甲狀腺激素抗體包被的發(fā)光微粒。2.如權(quán)利要求1所述用于檢測促甲狀腺激素的檢測微粒，其特征在于，所述發(fā)光微粒的粒徑范圍為100-400nm。3.如權(quán)利要求1所述用于檢測促甲狀腺激素的檢測微粒，其特征在于，所述發(fā)光微粒的表面官能團選自羧基或醛基。4.如權(quán)利要求1所述用于檢測促甲狀腺激素的檢測微粒，其特征在于，所述發(fā)光微粒的發(fā)光量為150，000-350，000光子數(shù)/100yg發(fā)光微粒。5.如權(quán)利要求1-4中任一權(quán)利要求所述用于檢測促甲狀腺激素的檢測微粒，其特征在于，所述檢測微粒經(jīng)如下工藝制得a)混合將發(fā)光微粒與抗促甲狀腺激素抗體混合于緩沖液中；b)反應(yīng)加入緩沖液配制的EDAC溶液混合并反應(yīng)；c)往步驟b獲得的反應(yīng)液中加入緩沖液配制的BSA溶液混勻并反應(yīng)；d)清洗產(chǎn)物，獲得抗促甲狀腺激素抗體包被的發(fā)光微粒。6.如權(quán)利要求5所述用于檢測促甲狀腺激素的檢測微粒，其特征在于，所述緩沖液為MES緩沖液。7.如權(quán)利要求5所述用于檢測促甲狀腺激素的檢測微粒，其特征在于，所述步驟a中，發(fā)光微粒與抗促甲狀腺激素抗體的質(zhì)量比例為(8-15):1。8.如權(quán)利要求7所述用于檢測促甲狀腺激素的檢測微粒，其特征在于，所述，發(fā)光微粒與抗促甲狀腺激素抗體的質(zhì)量比例為12.5:1。9.如權(quán)利要求5所述用于檢測促甲狀腺激素的檢測微粒，其特征在于，所述步驟d的清洗的方式為離心法清洗。10.—種促甲狀腺激素的檢測試劑盒，包括權(quán)利要求1-9中任一權(quán)利要求所述用于檢測促甲狀腺激素的檢測微粒。11.如權(quán)利要求io所述促甲狀腺激素的檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括生物素標記的抗促甲狀腺激素抗體或親和素包被的感光微粒中的一種或兩種。12.如權(quán)利要求11所述促甲狀腺激素的檢測試劑盒，其特征在于，所述生物素標記的抗促甲狀腺激素抗體中，生物素與抗體的分子比例為(20-40):1。13.如權(quán)利要求11所述促甲狀腺激素的檢測試劑盒，其特征在于，所述親和素包被的感光微粒中，親和素與感光微粒的質(zhì)量比例為1:(3-10)。14.如權(quán)利要求11所述促甲狀腺激素的檢測試劑盒，其特征在于，所述用于檢測促甲狀腺激素的檢測微粒、生物素標記的抗促甲狀腺激素抗體以及親和素包被的感光微粒分別獨立包裝，且均為混懸液。15.如權(quán)利要求14所述促甲狀腺激素的檢測試劑盒，其特征在于，所述混懸液的溶劑選自HEPES緩沖體系或Tris緩沖體系。16.如權(quán)利要求15所述促甲狀腺激素的檢測試劑盒，其特征在于，所述用于檢測促甲狀腺激素的檢測微?；鞈乙旱娜軇镻H8.0的成分為HEPES、NaCl和EDTA-Na_2H20的HEPES緩沖液。17.如權(quán)利要求15所述促甲狀腺激素的檢測試劑盒，其特征在于，所述生物素標記的抗促甲狀腺激素抗體混懸液的溶劑為pH8.0的成分為Tris、NaCl和EDTA_Na-2H20的Tris緩沖液。18.如權(quán)利要求15所述促甲狀腺激素的檢測試劑盒，其特征在于，所述親和素包被的感光微?；鞈乙旱娜軇槌煞譃镠EPES、NaCl和EDTA-Na_2H20的HEPES緩沖液。19.如權(quán)利要求14所述促甲狀腺激素的檢測試劑盒，其特征在于，所述混懸液中還包括蛋白保護劑、防止微粒聚集的穩(wěn)定試劑或防腐劑中的一種或多種。20.如權(quán)利要求10-19中任一權(quán)利要求所述促甲狀腺激素的檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中還包括多種濃度已知的促甲狀腺激素溶液，不同濃度的促甲狀腺激素溶液分別獨立包裝。21.如權(quán)利要求10-20中任一權(quán)利要求所述促甲狀腺激素的檢測試劑盒的使用方法，包括下列步驟a)在反應(yīng)孔中加入樣品、試劑盒中用于檢測促甲狀腺激素的檢測微粒和生物素標記的抗促甲狀腺激素抗體，獲得初始反應(yīng)溶液，混合反應(yīng)；b)再加入親和素包被的感光微粒獲得最終反應(yīng)溶液進行反應(yīng)；c)激發(fā)光照射反應(yīng)孔，測量每個反應(yīng)孔發(fā)光光子量獲得光信號值。22.如權(quán)利要求21所述促甲狀腺激素的檢測試劑盒的使用方法，其特征在于，所述激發(fā)光光源波長范圍為600-700nm。23.如權(quán)利要求21所述促甲狀腺激素的檢測試劑盒的使用方法，其特征在于，所述激發(fā)光光源的功率范圍為5-100mw。24.如權(quán)利要求21所述促甲狀腺激素的檢測試劑盒的使用方法，其特征在于，所述步驟a和b的反應(yīng)條件為37t:溫育10-30分鐘。25.如權(quán)利要求24所述促甲狀腺激素的檢測試劑盒的使用方法，其特征在于，所述步驟a的反應(yīng)條件為37t:溫育20分鐘，步驟b的反應(yīng)條件為37t:溫育15分鐘。26.如權(quán)利要求21所述促甲狀腺激素的檢測試劑盒的使用方法，其特征在于，所述用于檢測促甲狀腺激素的檢測微粒為混懸液，用于檢測促甲狀腺激素的檢測微粒在混懸液中的濃度為30-90iig/ml;所述生物素標記的抗促甲狀腺激素抗體為混懸液，生物素標記的抗促甲狀腺激素抗體在混懸液中的濃度為l-5yg/ml;所述親和素包被的感光微粒為混懸液，親和素包被的感光微粒在混懸液中的濃度為30-50iig/ml。27.如權(quán)利要求26所述促甲狀腺激素的檢測試劑盒的使用方法，其特征在于，所述用于檢測促甲狀腺激素的檢測微粒在混懸液中的濃度為50iig/ml;所述生物素標記的抗促甲狀腺激素抗體在混懸液中的濃度為4iig/ml;所述親和素包被的感光微粒在混懸液中的濃度為40ug/ml。28.如權(quán)利要求21所述促甲狀腺激素的檢測試劑盒的使用方法，其特征在于，所述初始反應(yīng)溶液的體積為30-75iU;最終反應(yīng)溶液的體積為100-250iU。29.如權(quán)利要28所述促甲狀腺激素的檢測試劑盒的使用方法，其特征在于，所述初始反應(yīng)溶液的體積為75ul;最終反應(yīng)溶液的體積為250ul。30.如權(quán)利要求21-29中任一權(quán)利要求所述促甲狀腺激素的檢測試劑盒的使用方法，其特征在于，還包括根據(jù)標準曲線計算待測樣品促甲狀腺激素的含量。全文摘要本發(fā)明涉及甲狀腺疾病的輔助診斷試劑，公開了一種促甲狀腺激素檢測微粒，為抗促甲狀腺激素抗體包被的發(fā)光微粒。本發(fā)明還公開了上述促甲狀腺激素檢測微粒的制備及應(yīng)用。此外，本發(fā)明又進一步公開了一種測定樣品中促甲狀腺激素的體外診斷試劑盒，同時公開了該試劑盒的使用方法。本發(fā)明的試劑盒可以與其它血清和臨床信息聯(lián)合用于甲狀腺疾病的輔助診斷及相關(guān)病人治療效果的監(jiān)測。文檔編號G01N21/76GK101769933SQ200810205000公開日2010年7月7日申請日期2008年12月30日優(yōu)先權(quán)日2008年12月30日發(fā)明者張偉,王海蛟,趙衛(wèi)國申請人:博陽生物科技(上海)有限公司