專利名稱：促心激素在肝病中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及促心激素(cardiotrophin)(CT-1)在刺激肝再生和保護(hù)肝細(xì)胞抵抗編程性細(xì)胞死亡和壞死方面的應(yīng)用。因此本發(fā)明涉及促心激素用于治療急性、亞急性、爆發(fā)性和慢性肝炎及治療肝硬化，以及用于促進(jìn)肝切除術(shù)，肝移植后的肝再生及用于刺激培養(yǎng)中的肝細(xì)胞或肝細(xì)胞前體的增殖和營養(yǎng)的應(yīng)用。
技術(shù)狀態(tài)人與動物的肝臟均具有調(diào)控其生長和重量的獨特能力。如果某種有害試劑損害了部分肝實質(zhì)，則存活的肝細(xì)胞能夠進(jìn)行復(fù)制，從而替代損傷的實質(zhì)。如果病毒性、毒性、免疫原性或代謝來源的肝切除術(shù)或肝細(xì)胞損傷影響了實質(zhì)的絕大部分，以至于超過殘留肝組織的再生能力，則將發(fā)展為致命性的肝功能不全。目前，沒有任何具有肝保護(hù)和刺激再生作用的藥物可用于治療急性或慢性肝功能不全。因此迫切需要并且這點很重要，即肝臟學(xué)所用的陳列的藥物應(yīng)包括這些指示性的治療產(chǎn)物。
本發(fā)明提出促心激素在肝病中的應(yīng)用。
促心激素(也稱為CHF或心臟肥大因子)先前已用于治療心臟病和神經(jīng)變性及神經(jīng)疾病(WO 95/29237)，作為與LIFRβ受體連接的局部炎癥調(diào)節(jié)物(WO 97/30146)，診斷和治療腫瘤(WO 00/43790)，及治療肌萎縮性側(cè)索硬化癥和帕金森氏癥(WO 97/39629)。
本發(fā)明并不涉及這些應(yīng)用的任何一種應(yīng)用，而是集中在CT-1在可用于治療肝細(xì)胞的治療藥物中的應(yīng)用，特別是通常作為保護(hù)后者抵抗編程性細(xì)胞死亡和壞死過程的試劑，及作為刺激肝再生的試劑。
CT-1是一種所謂促神經(jīng)細(xì)胞因子(neuropoietic cytokines)，屬于IL-6家族(1)。該家族細(xì)胞因子受體由不同亞單位組成，但它們均包括gp130亞單位(2)。家族的某些成員(IL-6和IL-11)可誘導(dǎo)gp130的同型二聚體化(3)，而其他成員，例如白血病抑制因子(LIF)、制瘤素和睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)則誘導(dǎo)gp130亞單位與190kDa的LIF受體的異型二聚體化(4)。CT-1受體包括gp130鏈、LIF受體的β亞基(LIFRβ)和第三種已知為CT-1受體α亞基的成分(5、6)。后者參與形成三元復(fù)合體，賦予CT-1高靈敏度和特異性。CT-1受體的激活誘導(dǎo)產(chǎn)生一系列胞內(nèi)信號，包括JAK家族的酪氨酸激酶(JAK-1、JAK-2和Tyk2)的早期激活。JAKs的主要效應(yīng)器是細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子STATs組(STAT-1和STAT-3；轉(zhuǎn)錄的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)激活物)。JAKs的激活也通過Ras-MAP激酶途徑傳導(dǎo)信號，并參與PI3-K(磷脂酰肌醇3-激酶)途徑的激活(2)。
由于CT-1在刺激心肌細(xì)胞的胚胎發(fā)育及保護(hù)心肌細(xì)胞抵抗由低氧、局部缺氧及局部缺血—再灌注導(dǎo)致的損傷和(8，9，10，11，12)中的作用，因此最初它被鑒定為心肌細(xì)胞中的肥大因子(7、8)。而且也描述了它在心力衰竭情況下對心肌層的保護(hù)作用(10)。CT-1的其他作用包括促進(jìn)運(yùn)動神經(jīng)元和多巴胺能神經(jīng)元的存活(13、14)。
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發(fā)明描述為了本發(fā)明的目的i)CT-1的活性部分是指維持本發(fā)明所要求的完整蛋白的生理作用的任何CT-1的部分多肽序列。
ii)具有CT-1活性的多肽衍生物是指與天然CT-1同源性大于80％且維持本發(fā)明所要求的完整蛋白的生理作用的任何多肽序列。
iii)而且應(yīng)理解編碼i)和ii)中所述的CT-1所述活性部分序列或CT-1的多肽衍生物的多核苷酸序列也包括在本發(fā)明中。
iv)促心激素-1或CT-1是指該蛋白的天然形式、任何重組蛋白形式(簡單或延遲釋放制劑)、任何編碼或表達(dá)CT-1完整蛋白的多核苷酸形式、或i)、ii)和iii)中所述的任何形式的延伸。
本發(fā)明是基于發(fā)現(xiàn)CT-1基因在肝實質(zhì)部分外科肝切除術(shù)后的肝再生過程中過量表達(dá)，在肝切除48小時后達(dá)到最高表達(dá)，并與肝細(xì)胞達(dá)到最大增殖的時間一致。根據(jù)該發(fā)現(xiàn)，調(diào)查了CT-1在肝再生過程中的作用，發(fā)現(xiàn)在部分肝切除后用編碼CT-1的基因序列轉(zhuǎn)導(dǎo)肝實質(zhì)顯著刺激肝再生，而且在幾乎全部肝切除后可以抑制動物死亡。同樣，已表明用編碼CT-1的序列轉(zhuǎn)導(dǎo)肝臟提供了高度有效的保護(hù)肝細(xì)胞以抵抗各種肝毒性試劑、顯著降低肝細(xì)胞編程性細(xì)胞死亡/壞死現(xiàn)象。最后，這些發(fā)現(xiàn)表明CT-1是一種有效的保護(hù)試劑，可使肝細(xì)胞抵抗造成細(xì)胞死亡的試劑，而且還具有刺激肝再生過程的性質(zhì)。
因此，本發(fā)明提出并要求保護(hù)CT-1、或CT-1活性片段、或具有CT-1活性的多肽衍生物、或編碼并表達(dá)CT-1、CT-1活性片段或具有CT-1活性的多肽衍生物的多核苷酸序列，在制造可用于在部分肝臟外科肝切除后或由化學(xué)試劑、生物試劑、炎癥或免疫調(diào)節(jié)物引起的肝損傷后刺激肝再生和另外作為毒性、病毒性、免疫或代謝病因的各種形式急性、亞急性、爆發(fā)性或慢性肝炎中酐保護(hù)性藥物，和用于刺激再生，保護(hù)肝細(xì)胞并提高在醇性、病毒性、代謝或免疫病因性肝硬化及肝移植中的肝功能的應(yīng)用。
實施例1.包含編碼CT-1基因序列的腺病毒載體(AdCT-1)構(gòu)建包含促心激素-1基因的缺陷型腺病毒(缺失E1和E3)(AdCT-1)，其過程如下詳述。以相應(yīng)于鼠cDNA序列(GenBank登錄號為U18366)的核苷酸20-639為PCR探針，從鼠肌肉cDNA文庫中篩選得到鼠CT-1的cDNA。將其克隆到pGEM-T/CT-1載體中，并通過測序進(jìn)行驗證。然后，將CT-1的cDNA克隆到pKS載體中，得到pKS-CT-1，它包含一個由勞斯肉瘤病毒啟動子(GenBank M83237的RSV核苷酸4526-5108)、神經(jīng)生長因子信號肽(GenBank V00836的NGF核苷酸298-378)、鼠CT-1的cDNA(GenBank U18366的核苷酸20-639)及SV40聚腺苷酸化信號(GenBank NC0016691的核苷酸2546-2775)組成的表達(dá)盒。該表達(dá)盒通過BamHI/SalI從pKS-CT-1質(zhì)粒中切除，并在HinfI位點連接到pGY63腺病毒穿梭質(zhì)粒中，得到pGY63-CT-1質(zhì)粒。該質(zhì)粒pGY63-CT-1包含腺病毒左臂ITR(反向末端重復(fù))、包裝信號(ps)及部分pIX基因，在后二者之間是CT-1表達(dá)盒。該質(zhì)粒pGY63-CT-1與包含用于同源整合的腺病毒基因組的pXL2689一起共轉(zhuǎn)化電感受態(tài)大腸桿菌SF800細(xì)胞。正確的重組子用PacI進(jìn)行消化，并轉(zhuǎn)染293細(xì)胞(用腺病毒5的DNA轉(zhuǎn)化的人胚胎腎細(xì)胞，ATCC參考號為CRL-1573)，以生產(chǎn)腺病毒。AdCT-1的結(jié)構(gòu)如

圖1所示。大腸桿菌轉(zhuǎn)化株于2001年9月12日保存在巴倫西亞大學(xué)(Burjasot，巴倫西亞，西班牙)的西班牙典型培養(yǎng)物保藏中心(CECT)(大腸桿菌PKSCT1，CECT號為5980)。
使用細(xì)胞293，并用含有重組腺病毒的上清感染來用于生產(chǎn)腺病毒儲液。首先將大約80％匯合的293細(xì)胞接種在6孔板中，以2％DMEM為培養(yǎng)基。幾小時后，除去培養(yǎng)基，用0.5μl包含稀釋在3ml DEMEM中的重組腺病毒上清感染細(xì)胞。37溫育1小時后，除去接種物，加入4ml瓊脂。細(xì)胞在37培養(yǎng)5到7天。用巴斯德移液管，從單層細(xì)胞中形成的病毒斑中收集病毒樣品；將瓊脂柱在500μl含有2％胎牛血清的DMEM中重懸，并貯存在-80。為了鑒定重組腺病毒，將293細(xì)胞接種到12孔板中，然后用250μl先前分離的病毒進(jìn)行感染。當(dāng)開始觀察到致細(xì)胞病變效應(yīng)時，再次從各孔中獨立收集細(xì)胞。隨后，細(xì)胞反復(fù)凍融3次，使它們裂解并釋放最大量的病毒顆粒。來自每個系列的細(xì)胞裂解物在1500rpm離心10分鐘。包含病毒的上清再次用于感染培養(yǎng)在6孔板中的293細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞開始表現(xiàn)為圓形時，立即收集上清，并通過檢測所述上清中的病毒DNA和RNA來確定病毒的存在。篩選表現(xiàn)出高水平病毒表達(dá)的上清用于擴(kuò)增，目的在于構(gòu)建重組腺病毒的儲液。
將293細(xì)胞在150-mm培養(yǎng)皿中進(jìn)行培養(yǎng)(50到100個培養(yǎng)皿)，并用來源于儲液的M.O.I.為10(10個蝕斑形成單位，-pfu-/細(xì)胞)腺病毒進(jìn)行感染。當(dāng)細(xì)胞表現(xiàn)出細(xì)胞致病變效應(yīng)時進(jìn)行收集，1500rpm離心10分鐘，重懸在0.1M Tris(pH8)中，并在-80凍存至下一步純化。
重組腺病毒通過氯化銫梯度進(jìn)行純化。為了這個目的，將貯存在-80的細(xì)胞重懸在0.01M Tris中，用5％氧脫膽酸鈉以1/10比例(v/v)處理30分鐘。然后，用預(yù)冷的手動玻璃勻漿器破碎細(xì)胞，直到獲得半液體溶液為止。隨后，將細(xì)胞提取物加到飽和的氯化銫溶液中，維持每10ml細(xì)胞提取物加5.8ml氯化銫溶液的比例。該混合物在特定的熱封polyhalomer管(Quick-seal，Beckman Instruments，CA，美國)中制備。用Beckman50 Ti固定角轉(zhuǎn)子以35,000rpm在4離心16-20小時。用無菌針頭和注射器收集對應(yīng)于病毒的條帶，然后在相同條件下進(jìn)行第二次離心。當(dāng)條帶被萃取后，用0.01M Tris pH8在4進(jìn)行透析，共透析兩次，每次1.5小時。將等分試樣的病毒制劑放在含10％(v/v)無菌甘油(ICN，美國)的瓶中，凍存在液氮中備用。
為了測定純化的重組腺病毒的感染滴度，在96孔板中進(jìn)行有限稀釋測試。該測試是基于研究病毒施加給293細(xì)胞的細(xì)胞致病變效應(yīng)，其測定能夠感染并在293細(xì)胞中增殖的病毒懸液的最大十進(jìn)制稀釋度。293細(xì)胞以每孔104個細(xì)胞預(yù)先接種到96-孔板中。然后，從培養(yǎng)孔中除去培養(yǎng)基，并用漸進(jìn)稀釋的腺病毒以每孔50μl體積感染細(xì)胞，實驗進(jìn)行兩個重復(fù)，6小時后，加入150μl新鮮DMEM培養(yǎng)基，最后，細(xì)胞在37培養(yǎng)最多7天。這段時間后，估測病毒對細(xì)胞的致細(xì)胞病變效應(yīng)的存在。在將具有細(xì)胞致病變效應(yīng)的細(xì)胞數(shù)與可以觀察到該效應(yīng)的最大稀釋度相乘，并將結(jié)果除以評估的總體積(0.05ml)后確定滴度，從而確定每ml蝕斑形成單位(pfu)的數(shù)目。對每個樣品的測定至少重復(fù)三次。
2.CT-1，重組蛋白通過用EcoRI消化pGEM-T/CT-1質(zhì)粒而獲得編碼CT-1的cDNA，并克隆到pET28b載體(Novagen)中(pET28b/CT-1)。該載體提供一個編碼一系列組氨酸殘基(1kDa)的序列，它與克隆的cDNA同相翻譯而產(chǎn)生一個融合蛋白，其氨基末端是1kDa的組氨酸尾，之后是CT-1，二者之間是凝血酶切割位點。
為了生產(chǎn)該蛋白，由于菌株BL21(DE3)(Novagen，德國，Cat.No.70235)包含一個T7 RNA聚合酶可誘導(dǎo)的基因，我們使用其的感受態(tài)細(xì)菌，它在隨后的蛋白生產(chǎn)中是必須的。感受態(tài)細(xì)菌用先前制備的載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化即具有克隆的CT-1 cDNA的pET14b(pET-14b載體來源于Novagen，Cat.No.69660-3)。由于載體含有對氨芐青霉素抗性的基因，因此轉(zhuǎn)化的細(xì)菌在含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基生長中進(jìn)行篩選。
為了生產(chǎn)重組CT-1，將轉(zhuǎn)化的細(xì)菌在含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中37培養(yǎng)至600nm處的光密度為0.4。然后用終濃度為0.5mM的IPTG誘導(dǎo)重組蛋白的表達(dá)。這樣，lac啟動子被誘導(dǎo)，結(jié)果包含該載體并控制克隆的cDNA表達(dá)的T7 RNA聚合酶啟動子。培養(yǎng)物在相同條件下進(jìn)一步培養(yǎng)4小時。
為了獲得萃取物，一旦細(xì)菌已生長，將其在4離心。將沉淀的細(xì)菌重懸在10mM Tris/HCl、10％蔗糖、2mM 2-巰基乙醇和蛋白酶抑制劑的緩沖液中。加入溶菌酶，4溫育30分鐘后，通過超聲進(jìn)行勻漿。這樣可能破壞細(xì)胞壁而提高提取過程的產(chǎn)量。通過將勻漿100,000g離心90分鐘獲得胞質(zhì)提取物。通過對胞質(zhì)部分進(jìn)行SDS-PAGE分析來測定蛋白產(chǎn)量。
通過在2ml鎳柱上對胞質(zhì)提取物進(jìn)行層析而對His-CT-1融合蛋白進(jìn)行純化。柱洗滌后，蛋白用1M咪唑進(jìn)行洗脫。純蛋白用凝血酶加工并回收CT-1。
3.檢測CT-1體內(nèi)表達(dá)的RNA印跡從鼠肝臟中提取mRNA后，用RNA印跡技術(shù)分析肝再生過程中各種細(xì)胞因子(肝細(xì)胞生長因子HGF；LIF；制瘤素；CNTF；CT-1)的基因表達(dá)。通過硫氰酸胍-酚氯仿法提取RNA。RNA印跡分析如我們以前所述進(jìn)行(15)，用28S的表達(dá)作為上樣對照，使用對每個待分析基因特異的探針。
4.來源于肝細(xì)胞的細(xì)胞系的培養(yǎng)為了體外研究，我們使用一種來源于鼠肝癌的肝細(xì)胞系-H35細(xì)胞。將細(xì)胞在補(bǔ)加10％牛血清、2mM谷氨酰胺、100U/ml鏈霉素及100mg/ml青霉素的Dulbecco’s改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM)中進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)物在37在5％CO2氣氛中進(jìn)行培養(yǎng)。
5.從細(xì)胞周期和膜聯(lián)蛋白的表達(dá)分析細(xì)胞編程性死亡的技術(shù)通過碘化丙錠進(jìn)行DNA染色的方法分析細(xì)胞周期。用0.5μl 50μg/ml碘化丙錠和4KU/ml RNAse(DNA-Prep Coulter試劑盒，Coulter)進(jìn)行染色前，用50μl 0.1％NP40溶液浸透細(xì)胞(0.5×106)。將細(xì)胞在37溫育20分鐘，然后在FACS流式細(xì)胞分析儀(FACScalibur cytofluorometer)上進(jìn)行測定。將碘化丙錠陽性的細(xì)胞在排除雙連體并使用FL3參數(shù)的流式細(xì)胞儀(FACScalibur，Becton-Dickinson，美國)的“雙連體辨別模式”DDM中進(jìn)行分析。亞二倍體細(xì)胞的頻率定義處于編程性細(xì)胞死亡的細(xì)胞的比例。
定向于細(xì)胞外部的磷脂酰絲氨酸的存在是將細(xì)胞定義為編程性細(xì)胞死亡的參數(shù)之一。當(dāng)細(xì)胞被定義為正在進(jìn)行編程性細(xì)胞死亡時，膜聯(lián)蛋白V通過其能夠與存在的朝向細(xì)胞膜外部的磷脂酰絲氨酸分子結(jié)合而檢測凋亡的細(xì)胞。細(xì)胞(0.5×106)在溫育緩沖液中洗滌一次，所述緩沖液包括140mM NaCl、5mM KCl、1.2mM MgCl2、10mM CaCl2及Hepes。將細(xì)胞在100μl溫育緩沖液和5μl偶聯(lián)膜聯(lián)蛋白V(膜聯(lián)蛋白-FITC)的熒光素異硫氰酸鹽結(jié)合物(fluorescein isothiocyanate conjugate)中室溫下溫育15分鐘。隨后，細(xì)胞用FACS流式細(xì)胞儀以FL1參數(shù)進(jìn)行測定。從對膜聯(lián)蛋白-FITC陽性的細(xì)胞比例確定編程性細(xì)胞死亡指數(shù)。
6.蛋白分析方法電泳。為了進(jìn)行蛋白分析，將細(xì)胞在裂解緩沖液(20mM Tris pH7.5；150mM NaCl，1mM EGTA，1mM EDTA，1％Triton x-100，2.5mM焦磷酸鈉，1mM Na3VO4，1μg/ml亮抑蛋白酶肽，胃酶抑制劑，10μg/ml胰蛋白酶抑制劑，1mM PMSF)中進(jìn)行裂解。0.5×106細(xì)胞裂解物重懸v/v在遷移緩沖液(125mM Tris-HCl(pH6.8)，10％十二烷基硫酸鈉，20％甘油，100mM二硫蘇糖醇，0.2％溴酚藍(lán))中。將蛋白提取樣品在100加熱5分鐘，然后在10％聚丙烯酰氨凝膠中進(jìn)行電泳。
通過蛋白印跡免疫檢測。電泳后，將蛋白在轉(zhuǎn)移緩沖液(25mM Tris，0.2M甘氨酸，20％甲醇，pH8.5)中在電流300mA下轉(zhuǎn)移1小時，使其轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。轉(zhuǎn)移的蛋白用麗春紅溶液進(jìn)行染色以確定轉(zhuǎn)移成功。然后，對膜進(jìn)行特異蛋白的免疫檢測。為此，膜用含2％BSA(白蛋白部分V)的TBS-T溫育緩沖液(20mM Tris，137mM NaCl，pH7.6及0.5％Tween 20)封閉1小時。膜用直接抗待測蛋白的特異抗體溫育2小時。隨后，膜用TBS-T緩沖液洗滌1小時，并再次與蛋白G-HRPO(BIORAD)溫育1小時。在TBS-T緩沖液中洗滌幾次后，用化學(xué)發(fā)光試劑(NEN Life Science產(chǎn)品)對膜進(jìn)行顯色，并立刻在預(yù)定時間下在超敏膠片(Amersham)上進(jìn)行曝光。
免疫沉淀。為了免疫沉淀特定蛋白，106細(xì)胞裂解物在存在特異抗體和20μl蛋白G-瓊脂糖條件下4溫育18小時。通過離心分離免疫復(fù)合物，在裂解緩沖液中洗滌2次，然后溶解在遷移緩沖液中。隨后，樣品加熱到100，并在10％凝膠中進(jìn)行電泳遷移。通過蛋白印跡對特定蛋白進(jìn)行免疫檢測。
7.測定DNA合成檢測增殖將H-35細(xì)胞接種到96-孔板中。無血清培養(yǎng)24小時后，用稀釋在無血清DMEN中的CT-1(50ng/ml)刺激細(xì)胞。與CT-1溫育24小時后，用10-μCi/ml[甲基-3H]-胸苷(ICN，Amersham)標(biāo)記12小時。除去放射性培養(yǎng)基，細(xì)胞用100μl胰蛋白酶在37進(jìn)行分離，并收集到25μl閃爍混合物(scintillation cocktail)(Ecolite；ICN)中。用tri Carb 2900TR閃爍計數(shù)器(Packard，Meriden，CT)分析[3H]-胸苷的結(jié)合。
8.部分肝切除(75％外科切除)后體內(nèi)檢測肝再生在Fisher鼠(雄性，重180g)中進(jìn)行肝再生研究。外科切除75％肝臟，在不同時間(1小時、3小時、6小時、10小時、24小時、48小時、3天、6天和9天)處死鼠。然后取出肝臟樣品并分為三部分組織學(xué)檢查(固定在甲醛中)，免疫組化檢查(固定在OCT)及進(jìn)行RNA分析(凍存在液氮中)。每次分析最少需4只鼠。分析的肝再生參數(shù)是肝臟重量和通過免疫組化測定的細(xì)胞增殖的核抗原表達(dá)的比例。
8.1.肝再生中CT-1的基因表達(dá)在部分肝切除模型中分析了各種細(xì)胞因子(HGF、LIF、制瘤素、CNTF、CT-1)的基因表達(dá)，從而研究它們在肝再生中的作用。在該研究中，我們分析了部分肝切除后不同時間(1小時、3小時、6小時、10小時、24小時、48小時、3天、6天和9天)獲得的鼠肝臟樣品。每組最少包括4只動物。另外，分析了未進(jìn)行肝切除的健康鼠的肝臟(對照)。通過RNA印跡確定每種細(xì)胞因子相應(yīng)的mRNA水平。這些實驗使我們得到一個全新的發(fā)現(xiàn)，即CT-1的mRNA水平在肝切除后24和48小時后顯著增加(圖2和3)，這與如來自實驗動物的肝組織樣品的免疫組化檢測中PCNA表達(dá)和肝細(xì)胞的5-溴脫氧尿苷(BrdU)整合所證實的肝細(xì)胞的最大增殖是一致的。另外，我們發(fā)現(xiàn)肝切除10小時后，HGF表達(dá)峰超過CT-1轉(zhuǎn)錄表達(dá)的增加。
8.2.CT-1在部分肝切除后對肝再生的作用為了研究CT-1在肝再生中的作用，靜脈注射劑量為108pfu的腺病毒CT-1(AdCT-1)，或以同樣劑量的具有LacZ報告基因的腺病毒(AdLac-Z)作為對照。在48小時后進(jìn)行75％肝臟外科切除術(shù)。按前述相同時間處死鼠。每次分析所用的鼠最少為4只，最多為8只。
給藥AdCT-1誘導(dǎo)用AdCT-1處理的鼠中肝臟重量的增加，給藥48小時后，與那些用AdLac-Z處理的鼠相比較，二組的肝細(xì)胞最大增殖時間(如肝切除后從這些鼠中獲得的肝臟樣品中通過對PCNA進(jìn)行免疫染色來證實)有顯著差異。肝切除3天和6天后，用AdCT-1處理的鼠其肝臟重量比來自對照鼠的大，雖然在這些時間二組的差異不是統(tǒng)計學(xué)上顯著的差異(圖4)。這些結(jié)果表明用CT-1處理的肝臟表現(xiàn)為促進(jìn)肝再生，因而在肝切除后最初階段比對照組有更大的重量。但由于自我平衡機(jī)制調(diào)控肝臟的最終大小，因此最終將與對照組達(dá)到類似數(shù)值。
9.擴(kuò)展肝切除后體內(nèi)檢測肝再生(外科切除＞85％)為了估測CT-1是否能夠抑制接受了幾乎全部肝切除手術(shù)的動物的死亡，在Fischer鼠中進(jìn)行實驗，對其進(jìn)行超過85％的外科肝切除手術(shù)。該實驗部分使用兩組，每組30只鼠進(jìn)行實驗。一組用AdLac-Z進(jìn)行靜脈處理，而另一組用AdCT-1靜脈處理，劑量如前所述。在給藥腺病毒48小時之后，進(jìn)行這種類型的外科肝切除。外科切除存活鼠的數(shù)量在AdLac-Z組中降為14只鼠，而那些注射AdCT-1的為13只鼠。這些鼠在擴(kuò)展外科肝切除后繼續(xù)檢測其長期存活率。
在肝切除1小時后觀察到，AdLac-Z組的死亡率為77％，而AdCT-1組不到20％。在肝切除24小時后，用AdLac-Z處理的鼠僅有7％存活，而用AdCT-1處理的鼠存活率為61％；這些差異在統(tǒng)計學(xué)上是顯著的。在手術(shù)4天后這些比例維持在相同的數(shù)值(圖5)。我們的數(shù)據(jù)表明CT-1可以抵抗擴(kuò)展肝切除的死亡率。
10.CT-1抵抗肝細(xì)胞的編程性細(xì)胞死亡/壞死的體內(nèi)保護(hù)作用。爆發(fā)性肝損傷檢測為了估測CT-1在調(diào)控由各種有害試劑引起的肝損傷中的作用，用Balb/c鼠(雄性，重30g)，在三種肝細(xì)胞損傷模式中估測肝損傷i)通過靜脈給藥100mg/kg伴刀豆球蛋白A-Con-A(Sigma，St，Louis，MO.，美國)引起的損傷；ii)通過結(jié)合靜脈給藥TNFα(Peprotech)(0.5μg/鼠)和腹膜內(nèi)給藥25mg D-半乳糖胺-TNFα/D-Gal(Sigma)引起的損傷；iii)通過靜脈給藥1.5μg/鼠抗-Fas(Jo2，Pharmingen)引起的損傷。給藥Con-A或TNFα/D-Gal或抗-Fas 6小時后，從鼠中采血并將它們處死。
為了測定CT-1對肝損傷的作用，“A”組鼠用鹽水溶液處理，“B”組用AdLac-Z(107pfu)處理，“C”組用AdCT-1(107pfu)處理。48小時后，每組以前述3種模式誘導(dǎo)肝損傷。包括一組用鹽水血清代替肝炎誘導(dǎo)物處理的鼠作為實驗的陰性對照(NC)。每組動物包括5只鼠。6小時后，根據(jù)兩個參數(shù)測定肝損傷程度通過自動比色檢測(Technicon RA-1000，Bayer)測定血清中轉(zhuǎn)氨酶(GPT)，用“原位死細(xì)胞檢測試劑盒”(RocheDiagnostics GmbH，Indianapolis，IN，美國)通過TUNEL技術(shù)在固定在OCT中的肝臟樣品中測量編程性細(xì)胞死亡。
從每只鼠中取血樣，測定轉(zhuǎn)氨酶，然后立即處死動物，將肝臟進(jìn)行組織學(xué)檢查(固定在甲醛中)，并通過TUNEL技術(shù)進(jìn)行編程性細(xì)胞死亡檢查(凍存在OCT中)。
在第一種由給藥Con-A誘導(dǎo)的急性肝損傷模式中發(fā)現(xiàn)，對照組中的鼠(給藥鹽水或AdLac-Z的動物)表現(xiàn)出很高的GPT值，而用AdCT-1處理的動物其轉(zhuǎn)氨酶變化很小，它們與對照組的鼠之間的差異非常顯著(圖6A)。當(dāng)對肝組織進(jìn)行TUNEL技術(shù)時，我們觀察到用AdCT-1處理的鼠的肝樣品中不存在編程性細(xì)胞死亡，比較而言，在給藥Con-A前用鹽水血清或AdLac-Z處理的動物有大范圍區(qū)域的壞死和編程性細(xì)胞死亡(圖7)。
在第二種由給藥抗-Fas單克隆抗體誘導(dǎo)的急性肝損傷模式中，我們再次發(fā)現(xiàn)，用AdCT-1處理可抑制肝細(xì)胞死亡(圖6B)。給藥抗-Fas 6小時后，給藥AdCT-1的動物中的轉(zhuǎn)氨酶數(shù)(figure)在那些用AdCT-1處理的動物中比那些給藥鹽水血清或AdLac-Z的動物較低(具有統(tǒng)計學(xué)上顯著差異)。另外，我們通過TUNEL技術(shù)和組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)在肝組織樣品中，用AdCT-1處理的鼠與對照組動物相比較，凋亡個體大幅度降低。
CT-1的肝保護(hù)作用也在第三種由聯(lián)合給藥TNFα和D-半乳糖胺(TNFα/D-Gal)引起的肝損傷模式中進(jìn)行估測。肝損傷6小時后，與對照組中的鼠相比較，轉(zhuǎn)氨酶水平和組織學(xué)觀察表明，用AdCT-1處理的鼠其轉(zhuǎn)氨酶數(shù)顯著下降，通過TUNEL技術(shù)測定的凋亡肝細(xì)胞數(shù)目也顯著下降(圖6C)。
這些數(shù)據(jù)均表明CT-1可以保護(hù)肝細(xì)胞抵制各種引起肝細(xì)胞編程性細(xì)胞死亡或壞死的刺激。
11.分析CT-1在細(xì)胞周期和來源于細(xì)胞系的肝細(xì)胞存活方面的作用利用H35鼠肝臟細(xì)胞系，我們調(diào)查了重組CT-1作為肝細(xì)胞編程性細(xì)胞死亡的細(xì)胞因子調(diào)節(jié)物的生物作用。為了檢測CT-1刺激，細(xì)胞預(yù)先無血清培養(yǎng)18小時。CT-1刺激檢測在無血清情況下進(jìn)行。
首先，我們分析了CT-1對這種肝細(xì)胞系的細(xì)胞周期的作用。細(xì)胞周期通過用碘化丙錠對DNA進(jìn)行染色，然后進(jìn)行流式細(xì)胞分析進(jìn)行測定。通過去除細(xì)胞培養(yǎng)基中的血清4天誘導(dǎo)編程性細(xì)胞死亡。結(jié)果表明，在這些條件下培養(yǎng)4天，86％H35細(xì)胞進(jìn)入編程性細(xì)胞死亡狀態(tài)。而且發(fā)現(xiàn)當(dāng)CT-1以50ng/ml劑量存在而不存在其他任何共刺激物時，CT-1也能造成H35細(xì)胞的編程性細(xì)胞死亡起始的顯著延遲，表現(xiàn)為約52％細(xì)胞中發(fā)生編程性細(xì)胞死亡(圖7)。
將H35細(xì)胞培養(yǎng)物在無血清下培養(yǎng)3天后進(jìn)行類似的實驗，然后測定細(xì)胞結(jié)合偶聯(lián)其表面FITC(熒光素異硫氰酸鹽)的純化的膜聯(lián)蛋白的能力。通過流式細(xì)胞分析研究膜聯(lián)蛋白-FITC與H35細(xì)胞表面的結(jié)合。該實驗證明在不存在CT-1時培養(yǎng)的細(xì)胞表現(xiàn)為約21％膜聯(lián)蛋白陽性，那些已用50ng/ml CT-1處理的細(xì)胞表現(xiàn)約為12％(圖8)。因此這些實驗證實在所用劑量下CT-1能夠表現(xiàn)出抗編程性細(xì)胞死亡作用。
12.分析CT-1對細(xì)胞增殖的作用用H-35細(xì)胞系，我們調(diào)查了CT-1在肝細(xì)胞DNA合成中可能具有的作用。為此，在96-孔板中每孔接種20,000個細(xì)胞。為了分析可能的刺激，細(xì)胞預(yù)先在無血清中培養(yǎng)24小時。CT-1刺激檢驗在無血清、劑量為50ng/ml下進(jìn)行24小時。結(jié)果表明，在有CT-1時培養(yǎng)的細(xì)胞比不使用CT-1的對照細(xì)胞表現(xiàn)出更高的DNA合成比例(圖9)。因此這些實驗證實在所用劑量CT-1能夠誘導(dǎo)DNA合成。
13.在來源于肝細(xì)胞的細(xì)胞系中研究和分析由CT-1誘導(dǎo)的信號途徑CT-1在體內(nèi)和體外均可以對肝細(xì)胞表現(xiàn)出抗凋亡作用的發(fā)現(xiàn)使我們研究肝細(xì)胞中CT-1受體的刺激中涉及的信號途徑。IL-6/LIF細(xì)胞因子家族受體的刺激導(dǎo)致屬于JAK-1家族的信號遞質(zhì)的立即磷酸化。在不同時間用CT-1刺激H35后，我們對這些細(xì)胞全部裂解物用特異抗體(CellSignaling Technology)進(jìn)行JAK-1的免疫沉淀。使用磷酸化酪氨酸的特異抗體(4G10，Upstate Biotechnology)和蛋白印跡，證實CT-1在5分鐘誘導(dǎo)JAK-1分子的酪氨酸磷酸化，信號在60分鐘后消失(圖10A)。
STAT-3的磷酸化是其中一個所述的經(jīng)JAK參與的IL-6家族細(xì)胞因子信號中涉及的激活途徑。其磷酸化的激活在某些情況下與誘導(dǎo)細(xì)胞分化有關(guān)，而在其他情況下與肥大有關(guān)(心肌細(xì)胞)。我們用蛋白印跡分析體外用50ng/ml CT-1在不同時間處理的H35裂解物。用磷酸化STAT-3特異抗體(Santa Cruz Biotechnology)表明，CT-1在刺激后5分鐘能夠開始誘導(dǎo)STAT-3磷酸化，在30分鐘達(dá)到最大值(圖10B)。
其中一個顯然參與抑制凋亡信號抑制的途徑是PI-3/AKT途徑(磷脂酰肌糖(phosphatidinositol)-3激酶/AKT激酶)。PI-3K的激活誘導(dǎo)在絲氨酸475和蘇氨酸308通過AKT磷酸化的活化。AKT的激活反過來引起在絲氨酸112和136的BAD的磷酸化。BAD是Bcl-2家族成員，是存活信號的重要調(diào)節(jié)物。無活性BAD與Bcl-x或Bcl-2蛋白二聚體化，從而中和其抗凋亡活性。BAD的磷酸化導(dǎo)致釋放Bcl-2或Bcl-x，其將抑制凋亡途徑。因此推測BAD的磷酸化抑制凋亡途徑。在本發(fā)明中，我們檢測了CT-1是否能夠在H35中激活該存活途徑。在不同時間用50ng/ml CT-1處理細(xì)胞后，我們隨后獲得胞質(zhì)部分，隨后用抗-AKT單克隆抗體(CellSignaling Technology)對AKT進(jìn)行免疫沉淀。然后，用對在絲氨酸475磷酸化的AKT形式特異的多克隆抗體(Cell Signaling Technology)通過蛋白印跡分析磷酸化AKT的存在。證實CT-1在15和30分鐘誘導(dǎo)在絲氨酸475的穩(wěn)態(tài)AKT磷酸化，然后在60分鐘消失。因此CT-1在肝細(xì)胞系中誘導(dǎo)存活信號(圖10C)。
總而言之，CT-能夠誘導(dǎo)JAK/STAT信號途徑和PI-3K/AKT存活途徑。因此由CT-1在肝細(xì)胞中誘導(dǎo)的信號級聯(lián)解釋了CT-1如何作為細(xì)胞因子經(jīng)PI-3k/AKT途徑發(fā)揮抗凋亡作用，而且可能在肝細(xì)胞中經(jīng)JAK/STAT-3途徑作為增殖和分化的誘導(dǎo)物。
14.研究和分析AdCT-1在急性肝衰竭的體內(nèi)模型中誘導(dǎo)的信號途徑為了分析在鼠和鼠中在急性肝損傷的體內(nèi)模型中觀察到的AdCT-1保護(hù)作用，已在體外觀察到的信號途徑似乎參與刺激肝細(xì)胞中CT-1受體，這些也在體內(nèi)模型中進(jìn)行研究。
如先前已在體外實驗中所述，CT-1可以誘導(dǎo)參與存活或抗凋亡的三個基本途徑的活化STAT-3(信號傳導(dǎo)物和轉(zhuǎn)錄激活物)、PI-3K(磷脂酰肌糖3-OH激酶)/AKT及Erk1/2(胞外調(diào)控的激酶)。
a.擴(kuò)展的肝切除的鼠模型如實施例9所述的實驗(肝切除＞85％)中所證實，在外科切除1小時后觀察到最高死亡率(參見圖5)。因此，所述實驗用3個處理組(AdCT-1、AdLac-Z和鹽水)進(jìn)行重復(fù)，但這次在外科切除1小時后處死鼠以得到肝臟樣品。
收集的肝臟樣品分為3部分用于組織學(xué)檢驗(固定在甲醛中)、免疫組化研究(固定在OCT中)和用于蛋白分析(凍存在液氮中)。從在液氮中凍存的樣品，在裂解緩沖液(20mM Tris pH7.5；150mM NaCl；1mM EGTA；1mM EDTA；1％Triton x-100；2.5mM焦磷酸鈉；1mMNa3VO4及抗蛋白酶混合物)中獲得肝勻漿。通過從Cell SignalingTechnology(Beverly，Massachussetts)獲得的特異抗體進(jìn)行蛋白印跡，在3組鼠中研究信號用AdCT-1、AdLac-Z及鹽水(S)處理。所用抗體是抗-Stat-3、抗-磷酸化的-Stat-3(Stat-3-Y-705)、抗-AKT、抗-磷酸化的AKT(Akt-Ser-473)、抗-Erk1/2、抗-磷酸化的Erk1/2，其同時檢測Erk1(Erk1-Thr-202)和Erk2(Erk2-Y-204)的磷酸化形式。這樣觀察到用AdCT-1處理的鼠肝臟表現(xiàn)出STAT-3、ERK1/2和AKT的磷酸化，相反那些用AdLac-Z和鹽水處理的鼠不表現(xiàn)出這一點(圖12A)。
另一方面，caspasa-3參與應(yīng)答很多刺激而進(jìn)行的編程性細(xì)胞死亡，所述刺激包括擴(kuò)展肝切除(＞85％)。由于這個原因，根據(jù)公司提供的檢測方案對液氮中收集的部分樣品進(jìn)行caspasa-3活性檢測(CaspACE，Promega，Madison，Wisconsin)。觀察到，與用AdLac-Z和鹽水處理的鼠肝臟相比較，先用AdCT-1處理的鼠肝臟表現(xiàn)出較低的caspasa-3活性(圖12B)，因此表面前者中較低的凋亡指數(shù)。
前述表明，由AdCT-1在鼠肝損傷中產(chǎn)生的保護(hù)作用是由CT-1誘導(dǎo)的抗凋亡信號的級聯(lián)起始所提供的，從而降低凋亡，如由低caspasa-3活性遭遇所證實。
b.伴刀豆球蛋白A誘導(dǎo)的急性肝損傷的鼠模型為了研究該模型中的信號，用Con-A(見實施例10)對3個處理組(AdCT-1、AdLac-Z和鹽水)重復(fù)誘導(dǎo)實驗，但這次在給藥Con-A 1小時后處死鼠。處死時獲得的肝臟樣品如上述實施例14a一樣進(jìn)行加工。以相同方式并用相同抗體進(jìn)行蛋白印跡。
如在圖13中所見，用AdCT-1處理誘導(dǎo)AKT和ERK1/2的磷酸化，二者是由CT-1誘導(dǎo)的主要抗凋亡和存活途徑。因此，這些結(jié)果表明AdCT-1通過激活這些主要的抗凋亡途徑而保護(hù)鼠抵抗由Con-A誘導(dǎo)的肝損傷。
附圖描述圖1是包含編碼CT-1序列的AdCT-1腺病毒載體的結(jié)構(gòu)示意圖。RSV勞氏肉瘤病毒啟動子；NGF神經(jīng)生長因子的肽信號；CT-1鼠CT-1的cDNA；SV40SV40病毒聚腺苷酸化信號。被抑制的E1和E3區(qū)域顯示為黑色。
圖2是部分肝切除后，在不同時間獲得的鼠肝臟樣品中通過RNA印跡檢測編碼CT-1的mRNA(h＝小時；d＝天)。28SrRNA，作為上樣對照。
圖3是圖2的RNA印跡中CT-1隨時間表達(dá)的示意圖(h＝小時；d＝天)。縱坐標(biāo)光密度的任意單位(CT-1/28S)。
圖4是指部分肝切除后，給藥AdCT-1或AdLac-Z前及實施部分肝切除后，在不同時間(橫坐標(biāo)；h＝小時，d＝天)鼠肝臟重量比例(縱坐標(biāo))。
圖5是用AdCT-1或AdLac-Z處理，并在處理48小時后進(jìn)行肝臟切除的(＞85％)鼠的存活比例(縱坐標(biāo))。橫坐標(biāo)肝切除后的時間(小時)。
圖6是來自在鼠中誘導(dǎo)爆發(fā)性肝炎的3個模型中，轉(zhuǎn)氨酶GPT的血清水平(縱坐標(biāo)，SF單位/ml)的示意圖，及肝組織的組織學(xué)圖片(通過TUNEL技術(shù)可視凋亡)，所述3個模型給藥伴刀豆球蛋白A，Con-A(圖6A)；給藥抗-Fas抗體(圖6B)；及聯(lián)合給藥TNFα和D-半乳糖胺，TNFα/D-Gal(圖6C)。在誘導(dǎo)肝炎前48小時，動物用腺病毒載體(AdCT-1或AdLac-Z)或鹽水血清(S)進(jìn)行處理。陰性對照(NC)相應(yīng)于給藥鹽水來代替誘導(dǎo)肝炎試劑的鼠組。
圖7是在無CT-1(C＝對照)及存在CT-1(CT-1)時，去除血清后培養(yǎng)1天(頂部)和4天(底部)后，H-35細(xì)胞的細(xì)胞周期分析。從左到右選擇的區(qū)域是DNA少于2n的細(xì)胞(凋亡細(xì)胞，Apo)；G0-G1期細(xì)胞(靜息細(xì)胞)和S及M期細(xì)胞(增殖細(xì)胞)?？v坐標(biāo)細(xì)胞數(shù)目。橫坐標(biāo)DNA含量。
圖8是在無CT-1(C＝對照)及存在CT-l(CT-1)時，去除血清3天后，通過流式細(xì)胞儀分析膜聯(lián)蛋白V在H-35細(xì)胞中的表達(dá)。與不存在CT-1時凋亡細(xì)胞為21％相比，用CT-1培養(yǎng)的細(xì)胞表現(xiàn)為約12％凋亡細(xì)胞。
圖9是從結(jié)合[3H]胸苷測定的CT-1對細(xì)胞增殖作用的分析。結(jié)果表明，相對于無處理的對照細(xì)胞(C＝對照)來說，用CT-1處理的細(xì)胞(CT-1)其增殖比例增加(縱坐標(biāo))。
圖10是用CT-1培養(yǎng)與細(xì)胞溫育后，在不同時間取樣的H35細(xì)胞裂解物中磷酸化信號蛋白(Jak-1-Y、Stat-3-Y-705及AKT-Ser-475)的免疫檢測。
A)細(xì)胞裂解物與Jak-1特異抗體的免疫沉淀。隨后通過與磷酸化酪氨酸特異的抗體進(jìn)行蛋白印跡，在5分鐘觀察到Jak-1分子的磷酸化。
B)與磷酸化Stat-3(Stat-3-Y-705)特異的抗體進(jìn)行蛋白印跡，在處理5分鐘觀察到陽性。
C)胞質(zhì)部分與抗-AKT抗體的免疫沉淀，隨后與在絲氨酸475磷酸化的AKT形式(AKT-Ser-475)的特異抗體進(jìn)行蛋白印跡，在15到30分鐘觀察到誘導(dǎo)反應(yīng)。
圖11是pET-14b載體結(jié)構(gòu)。
圖12A是用AdCT-1、AdLac-Z或鹽水(S)處理的鼠肝臟中信號蛋白的蛋白印跡，隨后進(jìn)行大于85％的肝切除，在切除1小時后處死。
1a)用磷酸化Stat-3(Stat-3-Y-705)特異抗體進(jìn)行蛋白印跡1b)用Stat-3特異抗體進(jìn)行蛋白印跡以定量總Stat-3在用AdCT-1處理的鼠中觀察到Stat-3的磷酸化。
2a)用磷酸化Erk1和Erk2(Erk1-Thr-202和Erk2-Tyr-204)特異抗體進(jìn)行蛋白印跡2b)用Erk1和Erk2特異抗體進(jìn)行蛋白印跡以定量總Erk1和Erk2在用AdCT-1處理的鼠中觀察到ERK1/2的磷酸化5)用磷酸化Akt(Akt-Ser473)特異抗體進(jìn)行蛋白印跡6)用Akt特異抗體進(jìn)行蛋白印跡以定量總Akt在用AdCT-1處理的鼠中觀察到Akt的磷酸化。
圖12B是已進(jìn)行擴(kuò)展肝切除(＞85％)的鼠肝臟中caspase-3活性。樣品來自圖12A所述試驗中使用的肝切除鼠的相同組。圖表顯示的是相對于健康肝臟，caspasa-3活性增加的倍數(shù)。
圖13是在給藥Con-A誘導(dǎo)肝損傷之前，分別用AdCT-1、AdLac-Z或鹽水(S)處理的鼠肝臟中信號蛋白的蛋白印跡。樣品在用Con-A誘導(dǎo)1小時后，在處死時進(jìn)行取樣1a)用磷酸化的Akt(Akt-Ser473)特異抗體進(jìn)行蛋白印跡1b)用Akt特異抗體進(jìn)行蛋白印跡以定量總Akt在用AdCT-1處理的鼠中觀察到Akt的磷酸化。
2a)用磷酸化的Erk1和Erk2(Erk1-Thr-202和Erk2-Tyr-204)特異抗體進(jìn)行蛋白印跡2b)用Erk1和Erk2特異抗體進(jìn)行蛋白印跡以定量總Erk1和Erk2在用AdCT-1處理的鼠中觀察到ERK1/2的磷酸化。
權(quán)利要求
1.促心激素-1(CT-1)，或CT-1的活性部分，或具有CT-1活性的多肽衍生物，或表達(dá)和編碼CT-1的多核苷酸序列，用于CT-1的活性部分或用于具有CT-1活性的多肽衍生物，用于制備可用于刺激肝再生的組合物的應(yīng)用。
2.促心激素-1(CT-1)，或CT-1的活性部分，或具有CT-1活性的多肽衍生物，或表達(dá)和編碼CT-1的多核苷酸序列，用于CT-1的活性部分或用于具有CT-1活性的多肽衍生物，用于制備可用作肝保護(hù)劑的組合物的應(yīng)用。
3.權(quán)利要求1的應(yīng)用，其用于制備可用于在外科肝切除術(shù)后刺激肝再生的組合物。
4.權(quán)利要求1和2任一項的應(yīng)用，其用于制備可用于治療任何病因?qū)W慢性肝病的組合物。
5.權(quán)利要求1，2和4任一項的應(yīng)用，其用于制備可用于治療病毒性的、代謝性的或毒性病因?qū)W的急性、亞急性、爆發(fā)性或慢性肝炎的組合物。
6.權(quán)利要求1，2和4任一項的應(yīng)用，其用于制備可用于治療肝硬變的組合物。
7.權(quán)利要求1和2任一項的應(yīng)用，其用于制備可用于治療移植肝的肝功能的組合物。
8.權(quán)利要求1，2任一項的應(yīng)用，其用于制備可用于治療肝內(nèi)腫瘤的組合物。
9.權(quán)利要求1-8任一項的應(yīng)用，其用于制備一種組合物，所述組合物包括具有表達(dá)和編碼CT-1的多核苷酸序列的病毒載體，用于CT-1的活性部分或用于具有CT-1活性的多肽衍生物。
10.權(quán)利要求9的應(yīng)用，其特征在于所述病毒載體是腺病毒。
11.一種培養(yǎng)肝細(xì)胞的方法，其特征在于將CT-1或CT-1的活性部分，或具有CT-1活性的多肽衍生物，或表達(dá)和編碼CT-1的多核苷酸序列，用于CT-1的活性部分或用于具有CT-1活性的多肽養(yǎng)生物，添加到培養(yǎng)基中。
全文摘要
促心激素在肝病中的應(yīng)用。本發(fā)明描述了促心激素(CT－1)在肝再生過程表達(dá)量的增加，其與肝細(xì)胞的最大增殖一致，并描述了CT－1作為肝再生刺激物的作用。另外，描述了CT－1在各種類型的急性肝損傷中的肝保護(hù)作用。證實了CT－1用于制造在治療肝病中使用的組合物過程中的重要性。本發(fā)明以各種形式和方法描述了該應(yīng)用，包括重組蛋白和編碼CT－1的基因序列的應(yīng)用。
文檔編號A61K38/00GK1556816SQ02818533
公開日2004年12月22日 申請日期2002年9月20日 優(yōu)先權(quán)日2001年9月21日
發(fā)明者瑪?shù)贍柕隆げ妓雇兴埂さ掳⑼呋? 赫蘇斯·普列托·巴爾圖埃納, 胡安·何塞·拉薩爾特·薩加斯蒂韋爾薩, 埃萊娜·拜塞拉斯·利亞諾, 拜塞拉斯 利亞諾, 普列托 巴爾圖埃納, 何塞 拉薩爾特 薩加斯蒂韋爾薩, 瑪?shù)贍柕?布斯托斯 德阿瓦霍 申請人:應(yīng)用醫(yī)學(xué)研究所