一種“浮雕式”紙基微流控檢測設(shè)備及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物殘留物的快速檢測設(shè)備的設(shè)計及制備技術(shù)領(lǐng)域,特別是涉及一種“浮雕式”紙基微流控檢測設(shè)備,由底物反應(yīng)區(qū)和底物基底區(qū)組成,底物反應(yīng)區(qū)置于底物基底區(qū)表面,由具備若干微小親水性木質(zhì)纖維絲及通過浸潤方式包埋于其內(nèi)的反應(yīng)底物及呈色劑層制成;底物基底區(qū)是疏水性的有機材質(zhì)。制備方法:(1)取市售疏水性的材質(zhì)無菌處理后,裁剪成底物基底區(qū);(2)無菌條件下,將親水性的whatman濾紙置于底物基底區(qū)上,即形成底物反應(yīng)區(qū);然后,將制備好的反應(yīng)底物及呈色劑溶液滴加在whatman濾紙上,25?40℃條件下,浸潤0.5?2h;無菌條件下晾干,即制成“浮雕式”紙基微流控檢測設(shè)備。使用本檢測設(shè)備能對動物源性食品病原微生物進行準確快速粗定量檢測。
【專利說明】
一種“浮雕式”紙基微流控檢測設(shè)備及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于生物殘留物的快速檢測設(shè)備的設(shè)計及制備和使用方法技術(shù)領(lǐng)域,特別是涉及一種“浮雕式”紙基微流控檢測設(shè)備及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]食源致病微生物污染是困擾食品安全的主要問題之一,而其快速準確檢測與監(jiān)測是保障食品安全的第一道防線。目前常用的檢測技術(shù)主要有傳統(tǒng)生化培養(yǎng)技術(shù)、免疫學(xué)技術(shù)、液相色譜技術(shù)和新近發(fā)展起來的分子生物學(xué)技術(shù),傳統(tǒng)生化培養(yǎng)技術(shù)具有特異準確的優(yōu)勢,但程序復(fù)雜、耗時耗力,檢測周期較長,無法滿足快速檢測需要,基于免疫學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)發(fā)展起來的檢測技術(shù)具有良好的特異性和靈敏性,準確快速,但對昂貴儀器設(shè)備和專業(yè)技術(shù)人員的依賴程度較高,無法滿足食品生產(chǎn)一線的快速檢測與監(jiān)測需要。
[0003]紙基微流控檢測裝置(microf luidic paper based analytical devices,μPADs)是近幾年發(fā)展起來的一種制備簡便、成本低廉、幾無污染的快速檢測技術(shù),其基本原理是:通過計算機設(shè)計圖形,噴蠟打印濾紙,制備疏水隔離區(qū),在隔離區(qū)內(nèi)包被反應(yīng)物,通過紙上反應(yīng)實現(xiàn)對被檢物的快速檢測,該方法與傳統(tǒng)生化培養(yǎng)技術(shù)、免疫學(xué)技術(shù)、液相色譜技術(shù)和的分子生物學(xué)檢測技術(shù)具有很好的互補性,彌補了前述幾種方法的不足和局限性,非常適合食品生產(chǎn)一線的快速檢測需要。
[0004]然而,由于噴蠟打印技術(shù)近幾年退出了市場,噴蠟打印機已市場難覓,導(dǎo)致紙基微流控檢測技術(shù)陷入困境,而其替代方法如光刻膠技術(shù)、十八烷基三甲氧基硅烷(TMOS)蝕刻技術(shù)等又都存在檢測紙片制備復(fù)雜、穩(wěn)定性較差、不易保存的缺陷。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005]本發(fā)明的目的在于:設(shè)計一種“浮雕式”紙基微流控檢測設(shè)備,使用這種設(shè)備,能對動物源性食品病原微生物進行準確快速定性檢測;更進一步的利用已知酶底物反應(yīng)原理中的數(shù)學(xué)模型,在預(yù)設(shè)檢測設(shè)備中底物一定量的基礎(chǔ)上,通過已知的數(shù)學(xué)模型關(guān)系式,間接的計算出待測微生物的基本定量,能較好的滿足食品生產(chǎn)一線的質(zhì)控、抽檢、初篩等便捷檢測要求。
[0006]本發(fā)明技術(shù)方案:一種“浮雕式”紙基微流控檢測設(shè)備,該檢測設(shè)備由兩部分組成:底物反應(yīng)區(qū)和底物基底區(qū),所述底物反應(yīng)區(qū)垂直置于底物基底區(qū)表面;所述底物反應(yīng)區(qū)由具備若干微小親水性木質(zhì)纖維絲及通過浸潤方式均勻包埋于木質(zhì)纖維絲內(nèi)的反應(yīng)底物及呈色劑層制成;所述底物基底區(qū)是由疏水性的有機材質(zhì)制成。
[0007]所述的底物反應(yīng)區(qū)為圓形或矩形或不規(guī)則形狀,或依據(jù)檢測目要求的任意形狀。所述的底物反應(yīng)區(qū)高于底物基底區(qū)l_5mm。所述的底物反應(yīng)區(qū)為含有反應(yīng)底物及呈色劑層的whatman濾紙。所述的底物基底區(qū)為具備疏水性的單面或雙面膠。所述的反應(yīng)底物及呈色劑層為能在待測細菌產(chǎn)生的特異酶催化下產(chǎn)生顯色反應(yīng)的物質(zhì)組。
[0008]—種“浮雕式”紙基微流控檢測設(shè)備的制備方法,該制備方法包括下述步驟:(I)取市售疏水性的單面或雙面膠帶無菌處理后,裁剪成大于底物反應(yīng)區(qū)2倍以上的面積作為疏水性的底物基底區(qū),備用;(2)在無菌條件下,將親水性的whatman濾紙制作成要求的形狀,并置于步驟(I)制備好的底物基底區(qū)上,即形成底物反應(yīng)區(qū);然后,將事先制備好的反應(yīng)底物及呈色劑溶液均勻滴加在whatman濾紙上,通過浸潤方式均勻的將反應(yīng)底物及呈色劑包埋于whatman濾紙內(nèi)細小的木質(zhì)纖維絲中,25-40 °C條件下,浸潤0.5_2h ;無菌條件下瞭干,即可制成“浮雕式”紙基微流控檢測設(shè)備。
[0009]有益效果:使用本檢測設(shè)備能對動物源性食品病原微生物進行準確快速粗定量檢測;利用已知酶底物反應(yīng)原理中的數(shù)學(xué)模型,在預(yù)設(shè)檢測設(shè)備中底物一定量的基礎(chǔ)上,間接的計算出待測微生物的基礎(chǔ)數(shù)量,實現(xiàn)快速,基本定量的檢測要求。同時,本發(fā)明克服了噴蠟打印技術(shù)退市后采用光刻和化學(xué)蝕刻等替代技術(shù)制備紙基微流控檢測設(shè)備的復(fù)雜性和不穩(wěn)定性,保持了紙基微流控檢測設(shè)備制備方法簡單的優(yōu)勢,并且材料簡單、價格低廉、幾無污染。
【附圖說明】
[0010]附圖1為實施例1主視結(jié)構(gòu)示意圖;附圖2為A-A剖視圖;附圖3為實施例2的主視結(jié)構(gòu)示意圖;附圖4為實施例3的主視結(jié)構(gòu)示意圖;附圖5為實施例4的主視結(jié)構(gòu)示意圖;附圖6為LM菌液濃度與灰度值的線性關(guān)系圖。
【具體實施方式】
[0011]實施例1、一種“浮雕式”紙基微流控檢測設(shè)備,如圖1-2所示,該檢測設(shè)備由兩部分組成:底物反應(yīng)區(qū)I和底物基底區(qū)2,所述底物反應(yīng)區(qū)I垂直置于底物基底區(qū)2表面;所述底物反應(yīng)區(qū)I由具備若干微小親水性木質(zhì)纖維絲4及通過浸潤方式均勻包埋于木質(zhì)纖維絲4內(nèi)的反應(yīng)底物及呈色劑層5制成;所述底物基底區(qū)2是由疏水性的有機材質(zhì)3制成。
[0012]所述的底物反應(yīng)區(qū)I高于底物基底區(qū)21-5mm。所述的底物反應(yīng)區(qū)I為含有反應(yīng)底物及呈色劑層5的whatman濾紙。所述的底物基底區(qū)2為具備疏水性的單面或雙面膠。所述的反應(yīng)底物及呈色劑層5為能在待測細菌產(chǎn)生的特異酶催化下產(chǎn)生顯色反應(yīng)的物質(zhì)組。
[0013]實施例2、3及4,如圖2-5所示,所述的底物反應(yīng)區(qū)I為圓形或矩形或不規(guī)則形狀,或依據(jù)檢測目要求的任意形狀。
[0014]實施例5、一種“浮雕式”紙基微流控檢測設(shè)備的制備方法,該制備方法包括下述步驟:(I)取市售疏水性的單面或雙面膠帶無菌處理后,裁剪成大于底物反應(yīng)區(qū)2倍以上的面積作為疏水性的底物基底區(qū),備用;(2)在無菌條件下,將親水性的whatman濾紙制作成要求的形狀,并置于步驟(I)制備好的底物基底區(qū)上,即形成底物反應(yīng)區(qū);然后,將事先制備好的反應(yīng)底物及呈色劑溶液均勻滴加在whatman濾紙上,通過浸潤方式均勻的將反應(yīng)底物及呈色劑包埋于whatman濾紙內(nèi)細小的木質(zhì)纖維絲中,25-40°C條件下,浸潤0.5_2h ;無菌條件下晾干,即可制成“浮雕式”紙基微流控檢測設(shè)備。
[0015]具體實踐:無菌條件下,將whatman濾紙裁制成圓形或矩形或依據(jù)檢測目要求的任意形狀的親水反應(yīng)區(qū),將市售單面或雙面透明膠帶制備成大于親水反應(yīng)區(qū)直徑2倍以上的條狀作為疏水基底區(qū);將制備好的親水反應(yīng)區(qū)whatman濾紙片粘貼其上即可。將待檢微生物產(chǎn)生的特異性酶的底物和顯色劑包埋于親水反應(yīng)區(qū)內(nèi),例如:X-1nP(5-溴-4-氯-3-吲羥肌醇磷酸銨)等,在25-40°C條件下,浸潤0.5-2h;烘干放入無菌自封袋包裝,用做食源微生物快速檢測之用。
[0016]其中,最佳親水反應(yīng)區(qū)直徑、疏水效果篩選。(I)參照文獻資料設(shè)定6、7、8、9和10_直徑的親水區(qū),滴加顏色水溶液(藍色墨水)測試,經(jīng)灰度值轉(zhuǎn)換計算,獲得最佳顯色反應(yīng)區(qū)直徑為6-8 _。(2)采用7mm直徑親水反應(yīng)區(qū),滴加市售墨水原液,滴加量分別為1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60微升共13個梯度,測定其最佳疏水效果,經(jīng)比對分析,I和5微升親水反應(yīng)區(qū)充盈不完全,10和15微升雖充盈完全,但尚未形成明顯的表面張力,不足以反映疏水區(qū)的隔離作用,20微升側(cè)面觀已開始形成略凸于親水區(qū)表面的張力層,25微升以后表面張力層升高,到60微升仍然可以表現(xiàn)出完整的疏水效果,底層疏水基質(zhì)層無滲漏,以最佳經(jīng)濟實用角度考慮,篩選20-25微升作為最佳疏水劑量。
[0017]實施例6、菌液濃度與灰度值量效關(guān)系確定:
(I)細菌復(fù)蘇:將用甘油保存于_20°C的單核增生李斯特菌標準菌株CICC 21633的菌液復(fù)蘇,之后進行平板劃線,分離純化。(2)菌液富集:挑取純化后平皿中長勢良好的單增李斯特菌菌落,進行Sh的菌液富集。(3)將富集好的菌液分別進行2、4、8、10、20倍的稀釋,混勻后分別滴加到試紙片上,1.5h后,終止反應(yīng),觀察顯色結(jié)果并進行掃描。(4)活菌計數(shù)
將富集8 h的菌液進行活菌計數(shù),得到所顯顏色對應(yīng)的菌液濃度。(5 )灰度轉(zhuǎn)換:用Imagejl.4u軟件對顯色結(jié)果進行灰度讀數(shù),得到顏色反應(yīng)的灰度值。(6)建立回歸方程:所得的菌液濃度和灰度值關(guān)系采用Graph Pad Prism 5統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理,并建立回歸方程為:y=-0.03850 x + 9.615,r2=0.9357;如附圖6所示。
[0018]結(jié)論:通過實施例6的實踐能很好的證明,通過本發(fā)明浮雕式檢測試紙(設(shè)備),可以得出待測細菌的半定量的分析結(jié)果??蓾M足食品生產(chǎn)一線的質(zhì)控、抽檢、初篩等便捷檢測要求。
[0019]本發(fā)明技術(shù)原理:自主研發(fā)一種專用打孔機制備不同直徑不同形狀的濾紙片作為親水反應(yīng)區(qū)(底物反應(yīng)區(qū)),以市售普通單面或雙面膠帶作為疏水隔離基層載體(底物基底區(qū)),將親水反應(yīng)區(qū)濾紙片粘貼在疏水隔離基層上,形成“浮雕”樣親水檢測區(qū)(底物反應(yīng)區(qū))。
[0020]本發(fā)明的創(chuàng)新點:首創(chuàng)了將親水反應(yīng)區(qū)(底物反應(yīng)區(qū))突出在疏水隔離區(qū)基層(底物基底區(qū))之上,依靠親水反應(yīng)區(qū)濾紙的表面張力和周圍疏水阻隔作用制備紙基微流控檢測設(shè)備方法,該方法可將檢測發(fā)生的化學(xué)反應(yīng)限制一致特定區(qū)域內(nèi),從而實現(xiàn)了反應(yīng)的可定量性,且制作材料可獲得性強、制備簡便、成本低廉,制作的檢測試紙可彌補當前快速便捷檢測技術(shù)的匱乏,填補了該領(lǐng)域的空白。
【主權(quán)項】
1.一種“浮雕式”紙基微流控檢測設(shè)備,其特征在于:該檢測設(shè)備由兩部分組成:底物反應(yīng)區(qū)(I)和底物基底區(qū)(2),所述底物反應(yīng)區(qū)(I)垂直置于底物基底區(qū)(2)表面;所述底物反應(yīng)區(qū)(I)由具備若干微小親水性木質(zhì)纖維絲(4)及通過浸潤方式均勻包埋于木質(zhì)纖維絲(4)內(nèi)的反應(yīng)底物及呈色劑層(5 )制成;所述底物基底區(qū)(2 )是由疏水性的有機材質(zhì)(3 )制成。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測設(shè)備,其特征在于:所述的底物反應(yīng)區(qū)(I)為圓形或矩形或不規(guī)則形狀。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的檢測設(shè)備,其特征在于:所述的底物反應(yīng)區(qū)(I)高于底物基底區(qū)(2)l_5mm。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測設(shè)備,其特征在于:所述的底物反應(yīng)區(qū)(I)為含有反應(yīng)底物及呈色劑層(5)的whatman濾紙。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測設(shè)備,其特征在于:所述的底物基底區(qū)(2)為具備疏水性的單面或雙面膠。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測設(shè)備,其特征在于:所述的反應(yīng)底物及呈色劑層(5)為能在待測細菌產(chǎn)生的特異酶催化下產(chǎn)生顯色反應(yīng)的物質(zhì)組。7.一種“浮雕式”紙基微流控檢測設(shè)備的制備方法,其特征在于:該制備方法包括下述步驟:(I)取市售普通雙面膠帶無菌處理后,裁剪成大于底物反應(yīng)區(qū)2倍以上的面積作為疏水性的底物基底區(qū),備用;(2)在無菌條件下,將親水性的whatman濾紙制作成要求的形狀,并置于步驟(I)制備好的底物基底區(qū)上,即形成底物反應(yīng)區(qū);然后,將事先制備好的反應(yīng)底物及呈色劑溶液均勻滴加在whatman濾紙上,通過浸潤方式均勻的將反應(yīng)底物及呈色劑包埋于whatman濾紙內(nèi)細小的木質(zhì)纖維絲中,25-40 °C條件下,浸潤0.5_2h ;無菌條件下瞭干,即可制成“浮雕式”紙基微流控檢測設(shè)備。
【文檔編號】G01N21/78GK105954273SQ201610288961
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年5月4日
【發(fā)明人】姚剛, 鄭曉風(fēng), 張琦, 王金泉, 趙紅瓊, 蘇戰(zhàn)強, 鐘旗, 李宏波, 閆向民
【申請人】新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)