一種天然對(duì)氨基苯甲酸及其衍生物的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種天然對(duì)氨基苯甲酸及其衍生物的制備方法，通過液體發(fā)酵培養(yǎng)雞樅菌，獲取發(fā)酵物，然后從發(fā)酵物中分離純化天然對(duì)氨基苯甲酸及其衍生物。本發(fā)明采用的天然對(duì)氨基苯甲酸及其衍生物制備方法，可以利用真菌菌種雞樅菌Termitomyces albuminosus經(jīng)液體發(fā)酵制得，培養(yǎng)基原料來源廣泛，制備方法簡(jiǎn)單安全，且環(huán)境友好，容易實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。CCTCC M 201626220160516
【專利說明】
-種天然對(duì)氨基苯甲酸及其衍生物的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種天然對(duì)氨基苯甲酸及其衍生物的制備方法，屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 對(duì)氨基苯甲酸，又名PABA等，是許多有機(jī)合成中一個(gè)重要前體及中間體，用于染料 和醫(yī)藥中間體，可用于生產(chǎn)活性紅M-80，M-10B，活性紅紫X-2R等染料W及制取氯基苯甲酸 生產(chǎn)藥物對(duì)簇基節(jié)胺。對(duì)氨基苯甲酸可用作防曬劑，其衍生物對(duì)二甲氨基甲酸辛醋，是優(yōu)良 的防曬劑。含有PABA結(jié)構(gòu)單元的一些衍生物具有抗癌、抗腫瘤、抗乙型肝炎病毒等藥理作 用。PABA還可參與葉酸的合成，其氨基酸衍生物可用于二氨葉酸還原酶，胸巧酸合成酶，法 尼基轉(zhuǎn)移酶等酶抑制劑的合成，還可W作為合成具有抗糖尿病分子的活性片段。文獻(xiàn)表明 具有PABA結(jié)構(gòu)單元的一些化合物能能夠修飾過氧化氨酶激活受體（peroxisome proliferator activated receptors，PPAR)，具有較好的PPAR激動(dòng)活性，可用于緩解治療 乳糖不難受癥所導(dǎo)致的腹脹，腹痛。2-甲氧基-4-氨基苯甲酸為對(duì)氨基苯甲酸的衍生物，只 在苯環(huán)2位的碳上多了一個(gè)甲氧基，可用于制備腸胃藥甲氧氯普胺。
[0003] 目前，對(duì)氨基苯甲酸及其衍生物2-甲氧基-4-氨基苯甲酸主要依靠化學(xué)合成。化學(xué) 合成常會(huì)用到大量的化學(xué)試劑，會(huì)造成環(huán)境污染。為尋找安全和環(huán)境友好的藥物制備技術(shù)， 開展本發(fā)明的研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種天然對(duì)氨基苯甲酸及其衍生物的制備方法。
[0005] 本發(fā)明所述制備方法通過液體發(fā)酵培養(yǎng)雞秋菌，獲取發(fā)酵物，然后從發(fā)酵物中分 離純化天然對(duì)氨基苯甲酸及其衍生物。
[0006] 具體包括如下： 1)真菌液體發(fā)酵:將雞秋菌Termi iomjces a弘t/minos化鄉(xiāng)面菌種活化后，進(jìn)行液體深 層發(fā)酵，培養(yǎng)基配方按重量比為：馬鈴馨5-40%，葡萄糖1-5%，余量為水，于0.1 Mpa和121 °C 滅菌30 min。采用恒溫?fù)u床或各式發(fā)酵罐進(jìn)行液體發(fā)酵，溫度設(shè)置22-30 °C，發(fā)酵7-30天； 所述菌株為雞秋菌（化rmiiomjces )ZYB2016于2016年5月16日保藏于中國(guó)典 型培養(yǎng)物保藏中屯、，保藏編號(hào)為CCTCC Μ 2016262,地址為武漢大學(xué)。
[0007] 2)發(fā)酵產(chǎn)物處理:液體發(fā)酵結(jié)束后，除去菌絲體的發(fā)酵液用乙酸乙醋萃取，萃取 液經(jīng)脫水、濃縮，得到有機(jī)粗提物浸膏； 3)天然對(duì)氨基苯甲酸及其衍生物的分離純化:將2)所述的有機(jī)粗提物浸膏用甲醇溶 解，進(jìn)行反相硅膠柱層析，用濃度為10-50%的甲醇水或丙酬水為洗脫劑，分管收集，將含有 目標(biāo)組分的洗脫液濃縮得到亞組分。用甲醇將亞組分溶解，進(jìn)行凝膠柱層析，用丙酬或甲醇 溶液洗脫，分管收集，將含有所述化合物的洗脫液合并，接著進(jìn)行正相硅膠柱層析，W氯仿 裝柱，干法上樣，用氯仿：甲醇= 100:0.1-10的溶劑洗脫，得到對(duì)氨基苯甲酸及其衍生物。 [000引所述的衍生物包括2-甲氧基-4-氨基苯甲酸。
[0009] 本發(fā)明采用的天然對(duì)氨基苯甲酸及其衍生物制備方法，可W利用真菌菌種雞秋菌 Termiiomjces a經(jīng)液體發(fā)酵制得，培養(yǎng)基原料來源廣泛，制備方法簡(jiǎn)單安全，且 環(huán)境友好，容易實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。
【附圖說明】
[0010] 圖1所述對(duì)氨基苯甲酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)式。
[0011]圖2所述2-甲氧基-4-氨基苯甲酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)式。
【具體實(shí)施方式】
[0012] 本發(fā)明提供的天然對(duì)氨基苯甲酸及其衍生物的制備方法，其步驟為： 1)液體培養(yǎng)及發(fā)酵產(chǎn)物處理:將真菌Termi iomjces a弘t/minostA·?斜面菌種先接種于裝 有150mL馬鈴馨液體培養(yǎng)基的Ξ角瓶中活化，活化條件為轉(zhuǎn)速230 r/min，培養(yǎng)溫度28 °C， 培養(yǎng)7天，再進(jìn)行大批量的液體發(fā)酵，采用培養(yǎng)基配方為:每升水中含馬鈴馨200 g，葡萄糖 20 g，抑自然，0.1 Mpa，121 °C滅菌30 min,置于25-28 °C，180-230 r/min恒溫?fù)u床中培 養(yǎng)。發(fā)酵15天后，用離屯、法將菌絲體與發(fā)酵液分離。發(fā)酵液用等體積的乙酸乙醋萃取，所得 萃取物用無水硫酸鋼脫水，再用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于40°C條件下真空濃縮，得到有機(jī)粗提物浸膏。
[0013] 化合物分離：將1)所述的有機(jī)粗提物浸膏用甲醇溶解，進(jìn)行反相硅膠柱層析，用 30%甲醇水洗脫，用化C檢測(cè)具有對(duì)氨基苯甲酸的組分并合并，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去洗脫劑后 用甲醇溶解，再進(jìn)行凝膠柱層析，W甲醇為洗脫劑，收集目標(biāo)組分，接著進(jìn)行正相硅膠層析， 氯仿裝柱，干法上樣，用氯仿：甲醇（100:1)洗脫得到化合物對(duì)氨基苯甲酸。
[0014] 對(duì)純品進(jìn)行核磁共振和質(zhì)譜分析鑒定，根據(jù)核磁共振波譜數(shù)據(jù)，對(duì)化合物進(jìn)行結(jié) 構(gòu)鑒定，可確定該化合物。
[001引實(shí)施例1 用馬鈴馨葡萄糖培養(yǎng)基(每升水中含馬鈴馨200g，葡萄糖20 g，pH自然，0.1Mpa，12rC 滅菌30min)，將活化后的菌株Termiiomjces 液體發(fā)酵培養(yǎng)37 L，于28 °C搖床 培養(yǎng)15 d。菌體過濾后，發(fā)酵液濃縮至1 L，發(fā)酵液用乙酸乙醋萃取，乙酸乙醋部分用無水 硫酸鋼脫水后濃縮，得到有機(jī)粗提物浸膏(3.1 g)。
[0016]將上一步驟中得到的3.1 g有機(jī)粗提物，用甲醇充分溶解，進(jìn)行反相硅膠（170 g) 柱層析，用30%甲醇水洗脫2 L，流速為15 mL /min,每管收集280 mL，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀真空濃 縮后，分別取樣進(jìn)行薄層層析分析合并(展開劑為氯仿：甲醇= 10:1，顯色劑為艦、10%硫酸 乙醇或艦化祕(mì)鐘），得到含有目標(biāo)化合物的組分(186 mg)。
[0017] 從上一步驟得到的組分（186 mg)，用甲醇溶解，進(jìn)行凝膠（120g，Sephadex LH-20) 柱層析，甲醇洗脫，流速約為12 s/drop，每管收集4 mL，根據(jù)薄層層析檢測(cè)合并得到組分 (90.2 mg)。
[0018] 從上一步驟得到的組分(90.2 mg)，用甲醇溶解，再進(jìn)行反相硅膠（120 g)柱層析， 用30%甲醇水洗脫1 L，流速為15 mL /min,每管收集20 mL，每管旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮后，分管取 樣進(jìn)行薄層層析分析合并，得到含有目標(biāo)化合物的組分(20.1 mg)。
[0019] 從上一步驟得到的組分(20.1 mg)進(jìn)行正相硅膠層析(3 g硅膠），氯仿裝柱，干法 上樣，流動(dòng)相為氯仿：甲醇（200 :1 )，洗脫體積為750 mL，薄層層析檢測(cè)合并得到純化合物 (14.8 mg)〇
[0020] 將上一步驟所得的化合物用気代甲醇溶解，轉(zhuǎn)移到核磁管中，測(cè)定核磁共振波譜 州-醒3、1化-醒1?、冊(cè)9(：、歷齡、古1護(hù)(：05￥)，并進(jìn)行質(zhì)譜和紫外光譜測(cè)定，并確定化合物結(jié) 構(gòu)。
[0021] 從化合物的1h-醒R(5 6.67，δ 7.88和它們之間的截合常數(shù)1=9.3)和1化-醒如勺化 學(xué)位移值表明化合物中含有對(duì)位取代的苯環(huán)結(jié)構(gòu)。另據(jù)UC-NMR化學(xué)位移值(170.3 S，163.5 S，133.1 dX2,123.0 S，116.2 dX 2)推測(cè)其為7個(gè)碳。根據(jù)高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)m/z :137.0233 [M] +，理論計(jì)算m/z:137.0477,結(jié)合NMR波譜數(shù)據(jù)推測(cè)分子式為C7化N02?；衔锏淖贤庾畲?吸收波長(zhǎng)為252 nm (MeOH)。綜合運(yùn)些理化數(shù)據(jù)，確定化合物的結(jié)構(gòu)為對(duì)氨基苯甲酸。
[0022] 實(shí)施例2 用馬鈴馨葡萄糖培養(yǎng)基(每升水中含馬鈴馨200g，葡萄糖20 g，pH自然，0.1Mpa，12rC 滅菌30min)，將活化后的菌株Termiiomjces 液體發(fā)酵培養(yǎng)37 L，于28 °C搖床 培養(yǎng)15 d。菌體過濾后，發(fā)酵液濃縮至1 L，發(fā)酵液用乙酸乙醋萃取，乙酸乙醋部分用無水 硫酸鋼脫水后濃縮，得到有機(jī)粗提物浸膏(3.1 g)。
[0023] 將上一步驟中得到的3.1 g有機(jī)粗提物，用甲醇充分溶解，進(jìn)行反相硅膠（170 g) 柱層析，用30%甲醇水洗脫2 L，流速為15血/min,每管收集280血，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀真空濃縮 后，分管取樣進(jìn)行薄層層析檢測(cè)合并（展開劑為氯仿：甲醇= 10:1，顯色劑為艦、10%硫酸乙 醇或艦化祕(mì)鐘），得到含有目標(biāo)化合物的組分(281.9 mg)。
[0024] 從上一步驟得到的組分（281.9 mg)，用甲醇溶解，進(jìn)行凝膠（120g，Se地adex LH- 20)柱層析，甲醇洗脫，流速約為12 s/drop，每管收集4 mL，根據(jù)薄層層析檢測(cè)合并得到組 分(138.6 mg)。
[0025] 從上一步驟得到的組分（138.6 mg)，用甲醇溶解，再進(jìn)行反相硅膠（120 g)柱層 析，用30%甲醇水洗脫1 L，流速為15 mL/min，每管收集20 mL，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀真空濃縮后，分 管取樣進(jìn)行薄層層析(分析合并，得到含有目標(biāo)化合物的組分(103.3 mg)。
[00%]從上一步驟得到的組分（103.3 mg)進(jìn)行正相硅膠層析(3.5 g硅膠），氯仿裝柱， 干法上樣，流動(dòng)相為氯仿：甲醇(200:1)，洗脫體積為1000 mL，薄層層析檢測(cè)合并，得到純化 合物(83.1 mg)。
[0027] 將上一步驟所得的化合物用気代甲醇溶解，轉(zhuǎn)移到核磁管中，測(cè)定核磁共振波譜 州-醒3、1化-醒1?、冊(cè)9(：、歷齡、古1護(hù)(：05￥)，并進(jìn)行質(zhì)譜和紫外光譜測(cè)定，并確定化合物結(jié) 構(gòu)。
[0028] 從化合物的iH-匪R和1化-醒R的波譜數(shù)據(jù)表明化合物中含有取代的苯環(huán)結(jié)構(gòu)（表 1)。又根據(jù)Uc-NMR的化學(xué)位移值（123.2 s，152.8 s，113.9 d，148.8 s，116.0 d，125.4 d， 170.2 s，56.5 q)推測(cè)其含有8個(gè)碳。根據(jù)高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)m/z: 167.0399 [M]%理論計(jì)算值 為m/z : 167.0582，結(jié)合NMR波譜數(shù)據(jù)推測(cè)該化合物的分子式為C姐9N03?；衔锏淖贤庾畲笪?收波長(zhǎng)為216 nm (MeOH)。綜合W上波譜數(shù)據(jù)，確定化合物的結(jié)構(gòu)為2-甲氧基-4-氨基苯甲 酸。
[0029] 表1化合物的NMR波譜數(shù)據(jù)(気代甲醇，500 M)
w上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，凡依本發(fā)明申請(qǐng)專利范圍所做的均等變化與修 飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種天然對(duì)氨基苯甲酸及其衍生物的制備方法，其特征在于:通過液體發(fā)酵培養(yǎng)雞 樅菌，獲取發(fā)酵物，然后從發(fā)酵物中分離純化天然對(duì)氨基苯甲酸及其衍生物。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種天然對(duì)氨基苯甲酸及其衍生物的制備方法，其特征在于： 所述方法包括如下步驟： 1) 真菌液體發(fā)酵:將雞縱菌rerffii ioffijces ai/wffiioosus斜面菌種活化后，進(jìn)行液體深 層發(fā)酵，培養(yǎng)基配方按重量百分比為：馬鈴薯5-40%，葡萄糖1-5%，余量為水，于0.1 Mpa和 121 °C滅菌30 min;采用恒溫?fù)u床或各式發(fā)酵罐進(jìn)行液體發(fā)酵，溫度設(shè)置22-30 °C，發(fā)酵7-30天； 2) 發(fā)酵產(chǎn)物處理:液體發(fā)酵結(jié)束后，除去菌絲體的發(fā)酵液用乙酸乙酯萃取，萃取液經(jīng) 脫水、濃縮，得到有機(jī)粗提物浸膏； 3) 天然對(duì)氨基苯甲酸及其衍生物的分離純化:將2)所述的有機(jī)粗提物浸膏用甲醇溶 解，進(jìn)行反相硅膠柱層析，用濃度為10-50%的甲醇水或丙酮水為洗脫劑，分管收集，將含有 目標(biāo)組分的洗脫液濃縮得到亞組分;用甲醇將亞組分溶解，進(jìn)行凝膠柱層析，用丙酮或甲醇 溶液洗脫，分管收集，將含有所述化合物的洗脫液合并，接著進(jìn)行正相硅膠柱層析，以氯仿 裝柱，干法上樣，用氯仿：甲醇= 100:0.1-10的溶劑洗脫，得到對(duì)氨基苯甲酸及其衍生物。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種天然對(duì)氨基苯甲酸及其衍生物的制備方法，其特征在于： 所述的衍生物包括2-甲氧基-4-氨基苯甲酸。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的天然對(duì)氨基苯甲酸及其衍生物的制備方法，其特征在于:所述 菌株為雞縱菌（^虹《#〇?尺65 3_//7^^/3〇5^/5)2￥132016，已于2016年5月16日保藏于中國(guó)典 型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC Μ 2016262。
【文檔編號(hào)】C12P13/00GK106011190SQ201610325004
【公開日】2016年10月12日
【申請(qǐng)日】2016年5月17日
【發(fā)明人】鄭永標(biāo), 吳雅濱, 鄒先文
【申請(qǐng)人】福建師范大學(xué)