本發(fā)明涉及醫(yī)藥化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種抗腫瘤活性的高烏甲素靛紅雜合體及其合成方法。

背景技術(shù)：

腫瘤已嚴(yán)重威脅到人類的健康，尋找有效安全、毒副作用小的抗腫瘤藥物一直是腫瘤藥物研發(fā)工作者孜孜以求的目標(biāo)。隨著藥物化學(xué)的發(fā)展，尋找高效低毒的天然抗腫瘤化合物或進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造合成其衍生物成為當(dāng)前抗腫瘤藥物研究中的一個重要趨勢。

高烏甲素[(1α,14α,16β)-20-乙基-1,14,16-三甲氧烏頭烷-4,8,9-三醇4-[2-(乙酰氨基)]苯甲酸酯](lappaconitine)又名拉巴烏頭堿，是從毛茛科植物高烏頭(Aconitum sinomontanum Nakai)根中提取的一種二萜類生物堿，其結(jié)構(gòu)式如下。藥理實(shí)驗(yàn)證明具有較強(qiáng)的中樞鎮(zhèn)痛作用及解熱、消腫和局部麻醉等作用。毒性實(shí)驗(yàn)表明，本品對各種組織均無損害，無致畸作用。

高烏甲素是單酯型生物堿，本身具有毒性，而產(chǎn)生毒性的一個主要原因是8位的羥基容易酯化。高烏甲素C-8、C-9位的鄰二羥基能與靛紅類化合物的羰基縮合生成螺環(huán)結(jié)構(gòu)，根據(jù)相關(guān)報道，已經(jīng)證實(shí)靛紅螺環(huán)衍生物具有較好的抗腫瘤活性。

靛紅，又名2,3-吲哚醌或吲哚滿二酮，是存在于中藥青黛、大青葉中的有效化學(xué)成分，也是哺乳動物和人體組織及體液中的內(nèi)源性物質(zhì)。靛紅及其衍生物具有多種生物活性，在抗腫瘤、抗病毒、神經(jīng)保護(hù)等方面的活性具有著重要意義。靛紅及常見的衍生物如下式所示：

近年來，對于抗腫瘤活性的高烏甲素衍生物，藥物化學(xué)家和生物學(xué)家進(jìn)行了大量的研究，合成篩選出各種不同基團(tuán)修飾的有抗腫瘤活性的高烏甲素衍生物，為進(jìn)一步開發(fā)有效低毒的抗腫瘤藥物打下了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

臨床上常使用的氫溴酸高烏甲素，為我國首創(chuàng)的非成癮性鎮(zhèn)痛藥，因其鎮(zhèn)痛作用強(qiáng)而無成癮性、無蓄積現(xiàn)象和毒副作用輕而廣泛應(yīng)用于臨床各種疼痛。但是，氫溴酸高烏甲素不溶于水，使得藥物在人體內(nèi)吸收受到影響，導(dǎo)致其鎮(zhèn)痛起效慢，并且游離的溴離子在人體內(nèi)具有一定的副作用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的是提供一種抗腫瘤活性的高烏甲素靛紅雜合體及其合成方法，通過利用靛紅類生物優(yōu)良的生物活性來改善高烏甲素結(jié)構(gòu)，以期合成得到低毒高效的衍生物。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

一種具有抗腫瘤活性的高烏甲素靛紅雜合體，其結(jié)構(gòu)式(I)如下所示：

其中，R₁選自鹵素、R₂選自低級烷烴。

一種具有抗腫瘤活性的高烏甲素靛紅雜合體的合成方法，以高烏甲素、靛紅及其衍生物為原料，磷鎢酸作催化劑，甲苯作為反應(yīng)溶劑的條件下進(jìn)行合成，合成路線如下所示：

詳細(xì)步驟如下：

1)按靛紅類化合物與原甲酸三甲酯摩爾比為1:1～1:5的比例投料，室溫磁力攪拌，在酸性條件下進(jìn)行反應(yīng)，用薄層色譜判斷是否有新的產(chǎn)物生成以及追蹤反應(yīng)進(jìn)度；

2)反應(yīng)完全后，加三乙胺中和反應(yīng)液至中性，減壓蒸去多余的原甲酸三甲酯；

3)按高烏甲素與靛紅類化合物摩爾比為1:1～1:5的比例向反應(yīng)器中投入高烏甲素，置于磁力攪拌器上攪拌，反應(yīng)體系達(dá)到回流后，加入酸性催化劑，TCL追蹤實(shí)驗(yàn)進(jìn)度，反應(yīng)完全后將反應(yīng)液減壓蒸出，濃縮物加水，有固體物質(zhì)析出，抽濾，洗滌濾餅，得到目標(biāo)產(chǎn)物粗品，重結(jié)晶即可得到目標(biāo)產(chǎn)物純品；

4)將得到的目標(biāo)產(chǎn)物稱重，計(jì)算產(chǎn)率。

進(jìn)一步，步驟1)所述的的投料比，靛紅類化合物與原甲酸三甲酯摩爾比為1:1～1:2。

進(jìn)一步，步驟1)所述的反應(yīng)催化劑和溶劑，為磷鎢酸和甲苯，。

進(jìn)一步，步驟3)所述的反應(yīng)時間為6～8小時。

進(jìn)一步，步驟3)所述的投料比，優(yōu)選的高烏甲素與靛紅類化合物摩爾比為1:1～1:3。

進(jìn)一步，一種具有抗腫瘤活性的高烏甲素靛紅雜合體在治療人前列腺癌、胃癌、肺癌、乳腺癌、肝癌中的應(yīng)用。

本發(fā)明的有益效果是：

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：采用“一鍋煮”的方法制備高烏甲素靛紅雜合體,減少了實(shí)驗(yàn)步驟,操作簡單,轉(zhuǎn)化率高。原料環(huán)保，生產(chǎn)成本低，操作安全性高，反應(yīng)條件溫和，可實(shí)現(xiàn)反應(yīng)原料的充分利用，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。將一個具有抗腫瘤活性的化合物進(jìn)行縮合，對探究該類化合物的生物活性與總結(jié)構(gòu)效關(guān)系具有重要的理論價值和應(yīng)用價值。

具體實(shí)施例

以下結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)一步敘述，但本發(fā)明不局限于以下實(shí)施例。

實(shí)施例1

高烏甲素與靛紅的縮合產(chǎn)物

于100mL燒瓶中，投入高烏甲素50mg、靛紅25.16mg、原甲酸三甲酯27.22mg(28.06mL)和適量磷鎢酸，室溫磁力攪拌，用薄層色譜判斷是否有新的產(chǎn)物生成以及追蹤反應(yīng)進(jìn)度，反應(yīng)完全后，加適量三乙胺中和反應(yīng)液至中性，反應(yīng)完全后將反應(yīng)液減壓蒸出，濃縮物加水，有固體物質(zhì)析出，抽濾，洗滌濾餅，得到目標(biāo)產(chǎn)物粗品，重結(jié)晶即可得到目標(biāo)產(chǎn)物純品。

(2R,3S,3aS,6aS,7R,7aR,10S,13S,13aR,13bS,14S,17S)-8-ethyl-3,13,17-trimethox y-13b,14-dimethyl-2'-oxo-1,2,3,7,7a,8,9,10,11,12,13,13b-dodecahydrospiro[10,13a,7-(epiethane[1,1,2]triyl)-2,6a-ethano[1,3]dioxolo[4',5':7,7a]indeno[5,4-b]azocine-5,3'-in dolin]-10-yl 2-acetamidobenzoate

暗紅色無定型粉末31.08mg，收率48.99％，m.p.231～233℃。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ(ppm):11.04(1H,s),10.58(1H,s),8.29(1H,d,J＝12.5Hz),7.85(1H,d,J＝10.4Hz),7.58(2H,m),7.50(1H,d,J＝6.8Hz),7.17(1H,dd,J＝15.3,1.1Hz),7.08(1H,d,J＝7.5Hz),6.92(1H,d,J＝7.8),3.37-3.42(9H,m),3.27(4H,d,J＝6.7Hz),3.14-3.21(8H,m),2.88(1H,s),2.68(2H,dd,J＝14.5,7.5Hz),2.24(2H,dd,J＝14.4,6.9Hz),2.11(3H,s),1.86-1.96(3H,m),1.39(2H, q),1.03(3H,t,J＝7.1Hz).¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆)δ(ppm):178.23,168.41,166.10,150.71,139.95,138.33,133.80,130.60,126.71,124.65,122.98,122.72,120.91,117.79,117.55,115.37,112.16,90.67,89.22,86.59,84.34,83.43,82.83,78.13,73.40,67.84,60.31,58.28,57.04,55.87,55.36,50.69,50.56,48.22,48.14,47.48,42.77,35.58,31.38,26.41,25.93,24.72,23.76,13.27.HRMS(ESI)calcd.forC₄₀H₄₇N₃O₉[M+H]⁺:713.3312,found:713.3379.

實(shí)施例2

高烏甲素與5-氟靛紅的縮合產(chǎn)物

于100mL燒瓶中，投入高烏甲素50mg、5-氟靛紅28.24mg、原甲酸三甲酯27.22mg(28.06mL)和適量磷鎢酸，室溫磁力攪拌，用薄層色譜判斷是否有新的產(chǎn)物生成以及追蹤反應(yīng)進(jìn)度，反應(yīng)完全后，加適量三乙胺中和反應(yīng)液至中性，反應(yīng)完全后將反應(yīng)液減壓蒸出，濃縮物加水，有固體物質(zhì)析出，抽濾，洗滌濾餅，得到目標(biāo)產(chǎn)物粗品，重結(jié)晶即可得到目標(biāo)產(chǎn)物純品。

(2R,3S,3aS,6aS,7R,7aR,10S,13S,13aR,13bS,14S,17S)-8-ethyl-5'-fluoro-3,13,17-trimethoxy-13b,14-dimethyl-2'-oxo-1,2,3,7,7a,8,9,10,11,12,13,13b-dodecahydrospiro[10,13a,7-(epiethane[1,1,2]triyl)-2,6a-ethano[1,3]dioxolo[4',5':7,7a]indeno[5,4-b]azoc ine-5,3'-indolin]-10-yl 2-acetamidobenzoate

暗紅色無定型粉末28.77mg，收率44.28％，m.p.235～237℃。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ(ppm):11.05(1H,s),10.55(1H,s),8.28(1H,d,J＝8.3Hz),7.85(1H,d,J＝9.4Hz),7.57(1H,t,J＝7.8Hz),7.44(2H,m),7.17(1H,t,J＝7.2Hz),6.92(1H,dd,J＝8.5,3.9Hz),3.39(6H,m),3.26(3H,s),3.18(8H,m),2.88(1H,s),2.68(2H,dd,J＝14.5,7.5Hz),2.35(1H,m),2.25(2H,m),2.07-2.10(6H,m),1.88-1.96(3H,m),1.39(2H,q),1.03(3H,t,J＝7.1Hz).¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆)δ(ppm):176.71,168.40,166.11,156.85,146.95,139.96,133.80,130.60, 124.58,124.34,122.98,120.71,118.41,117.47,113.47,111.48,89.22,84.35,83.44,82.83,78.13,73.40,60.31,57.04,56.81,55.87,55.19,50.70,48.14,47.49,42.71,35.59,31.40,26.35,25.82,24.73,23.73,13.27.

實(shí)施例3

高烏甲素與5-氯靛紅的縮合產(chǎn)物

于100mL燒瓶中，投入高烏甲素50mg、5-氯靛紅31.05mg、原甲酸三甲酯27.22mg(28.06mL)和適量磷鎢酸，室溫磁力攪拌，用薄層色譜判斷是否有新的產(chǎn)物生成以及追蹤反應(yīng)進(jìn)度，反應(yīng)完全后，加適量三乙胺中和反應(yīng)液至中性，反應(yīng)完全后將反應(yīng)液減壓蒸出，濃縮物加水，有固體物質(zhì)析出，抽濾，洗滌濾餅，得到目標(biāo)產(chǎn)物粗品，重結(jié)晶即可得到目標(biāo)產(chǎn)物純品。

(2R,3S,3aS,6aS,7R,7aR,10S,13S,13aR,13bS,14S,17S)-5'-chloro-8-ethyl-3,13,17-trimethoxy-13b,14-dimethyl-2'-oxo-1,2,3,7,7a,8,9,10,11,12,13,13b-dodecahydrospiro[10,13a,7-(epiethane[1,1,2]triyl)-2,6a-ethano[1,3]dioxolo[4',5':7,7a]indeno[5,4-b]azoc ine-5,3'-indolin]-10-yl 2-acetamidobenzoate

黃色無定型粉末29.89mg，收率45.02％，m.p.240～242℃。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ(ppm):11.15(1H,s),10.55(1H,s),8.28(1H,s),7.83(1H,s),7.67(3H,m),7.17(1H,s),6.92(1H,s),3.36(9H,d,J＝7.9Hz),3.28(3H,s),3.20(7H,d,J＝5.0Hz),2.89(1H,d,J＝7.1Hz),2.70(2H,m),2.29(4H,m),2.13(3H,s),1.94(3H,m),1.40(2H,q),1.04(3H,t).¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆)δ(ppm):175.48,168.41,166.17,149.44,139.95,137.21,133.64,130.42,126.62,126.35,124.10,122.90,119.13,113.80,89.06,84.34,83.43,82.70,78.13,73.40,60.31,57.04,55.87,55.36,50.69,50.56,48.14,42.77,35.59,26.34,24.73,23.81,13.27.

實(shí)施例4

高烏甲素與N-甲基-5-氟靛紅的縮合產(chǎn)物

于100mL燒瓶中，投入高烏甲素50mg、N-甲基-5-氟靛紅30.64mg、原甲酸三甲酯27.22mg(28.06mL)和適量磷鎢酸，室溫磁力攪拌，用薄層色譜判斷是否有新的產(chǎn)物生成以及追蹤反應(yīng)進(jìn)度，反應(yīng)完全后，加適量三乙胺中和反應(yīng)液至中性，反應(yīng)完全后將反應(yīng)液減壓蒸出，濃縮物加水，有固體物質(zhì)析出，抽濾，洗滌濾餅，得到目標(biāo)產(chǎn)物粗品，重結(jié)晶即可得到目標(biāo)產(chǎn)物純品。

(2R,3S,3aS,6aS,7R,7aR,10S,13S,13aR,13bS,14S,17S)-8-ethyl-5'-fluoro-3,13,17-trimethoxy-1',13b,14-trimethyl-2'-oxo-1,2,3,7,7a,8,9,10,11,12,13,13b-dodecahydrospi ro[10,13a,7-(epiethane[1,1,2]triyl)-2,6a-ethano[1,3]dioxolo[4',5':7,7a]indeno[5,4-b]az ocine-5,3'-indolin]-10-yl 2-acetamidobenzoate

淡黃色無定型粉末25.99mg，收率39.27％，m.p.236～238℃。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ(ppm):10.55(1H,s),8.27(1H,d,J＝8.3Hz),7.85(1H,d,J＝6.4Hz),7.56(2H,s),7.46(2H,d,J＝4.4Hz),7.18(1H,d,J＝3.0Hz),3.41(1H,d,J＝11.2Hz),3.34(6H,s),3.26(3H,s),3.20(3H,s),3.14(9H,m),2.89(1H,s),2.69(2H,dd,J＝14.6,7.8Hz),2.35(1H,d,J＝11.0Hz),2.26(3H,m),2.12(3H,s),1.94(3H,m),1.39(2H,q),1.03(3H,t,J＝7.5Hz).¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆)δ(ppm):175.05,168.10,166.17,157.95,150.38,147.50,139.94,133.92,130.41,124.07,123.83,111.93,111.85,111.39,111.14,89.02,82.65,77.65,73.48,60.20,57.04,55.82,55.48,50.11,48.23,47.55,42.46,29.23,26.09,24.17,13.35.

實(shí)施例5

高烏甲素與N-乙基-5-氟靛紅的縮合產(chǎn)物

于100mL燒瓶中，投入高烏甲素50mg、N-乙基-5-氟靛紅33.04mg、原甲酸三甲酯27.22mg(28.06mL)和適量磷鎢酸，室溫磁力攪拌，用薄層色譜判斷是否有新的產(chǎn)物生成以及追蹤反應(yīng)進(jìn)度，反應(yīng)完全后，加適量三乙胺中和反應(yīng)液至中性，反應(yīng)完全后將反應(yīng)液減壓蒸出，濃縮物加水，有固體物質(zhì)析出，抽濾，洗滌濾餅，得到目標(biāo)產(chǎn)物粗品，重結(jié)晶即可得到目標(biāo)產(chǎn)物純品。

(2R,3S,3aS,6aS,7R,7aR,10S,13S,13aR,13bS,14S,17S)-1',8-diethyl-5'-fluoro-3,13,17-trimethoxy-13b,14-dimethyl-2'-oxo-1,2,3,7,7a,8,9,10,11,12,13,13b-dodecahydro spiro[10,13a,7-(epiethane[1,1,2]triyl)-2,6a-ethano[1,3]dioxolo[4',5':7,7a]indeno[5,4-b]azocine-5,3'-indolin]-10-yl 2-acetamidobenzoate

灰色無定型粉末27.61mg，收率40.98％，m.p.233～235℃。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ(ppm):10.54(1H,s),8.25(1H,d,J＝7.4Hz),7.84(1H,d,J＝6.5Hz),7.51-7.60(2H,m),7.46(1H,d,J＝9.8Hz),7.15-7.24(2H,m),3.71(2H,q,J＝7.2Hz),3.42(1H,d,J＝9.4Hz),3.35(6H,s),3.26(3H,s),3.21(8H,m),2.90(1H,s),2.69(2H,q),2.26(4H,m),2.12(3H,s),1.95(4H,m),1.40(2H,q,J＝12.7Hz),1.17(3H,t,J＝7.2Hz),1.04(3H,t,J＝6.3Hz).¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆)δ(ppm):179.48,168.10,165.90,157.39,155.45,146.92,133.62,130.42,128.29,126.05,124.13,123.47,122.85,120.63,118.42,111.75,111.47,89.03,87.09,84.21,82.66,75.43,73.21,57.06,55.76,55.38,50.13,48.19,46.98,42.45,35.24,34.31,33.02,25.73,24.43,13.36,12.14.

實(shí)施例6

高烏甲素與N-甲基-7-氟靛紅的縮合產(chǎn)物

于100mL燒瓶中，投入高烏甲素50mg、N-甲基-7-氟靛紅30.64mg、原甲酸三甲酯27.22mg(28.06mL)和適量磷鎢酸，室溫磁力攪拌，用薄層色譜判斷是否有新的產(chǎn)物生成以及追蹤反應(yīng)進(jìn)度，反應(yīng)完全后，加適量三乙胺中和反應(yīng)液至中性，反應(yīng)完全后將反應(yīng)液減壓蒸出，濃縮物加水，有固體物質(zhì)析出，抽濾，洗滌濾餅，得到目標(biāo)產(chǎn)物粗品，重結(jié)晶即可得到目標(biāo)產(chǎn)物純品。

(2R,3S,3aS,6aS,7R,7aR,10S,13S,13aR,13bS,14S,17S)-8-ethyl-7'-fluoro-3,13,17-trimethoxy-1',13b,14-trimethyl-2'-oxo-1,2,3,7,7a,8,9,10,11,12,13,13b-dodecahydrospi ro[10,13a,7-(epiethane[1,1,2]triyl)-2,6a-ethano[1,3]dioxolo[4',5':7,7a]indeno[5,4-b]az ocine-5,3'-indolin]-10-yl 2-acetamidobenzoate

灰色無定型粉末35.44mg，收率53.55％，m.p.234～236℃。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ(ppm):10.54(1H,s),8.25(1H,s),7.84(1H,d,J＝9.4Hz),7.56(2H,m),7.41(1H,d,J＝8.6Hz),7.14(2H,m),3.43(1H,m),3.33(9H,s),3.30(4H,m),3.21(8H,m),2.90(1H,s),2.71(2H,m),2.26(4H,m),2.12(3H,s),1.95(3H,m),1.41(2H,m),1.04(3H,t).¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆)δ(ppm):176.32,168.40,165.90,157.95,148.81,146.31,137.07,133.64,130.42,128.84,125.86,125.66,124.20,121.91,120.58,111.18,101.68,96.31,89.02,85.51,83.29,82.66,73.50,60.20,56.76,55.49,55.12,50.39,47.89,47.25,44.40,34.89,28.62,24.16,14.35.

實(shí)施例7

高烏甲素與N-乙基靛紅的縮合產(chǎn)物

于100mL燒瓶中，投入高烏甲素50mg、N-乙基靛紅29.96mg、原甲酸三甲酯27.22mg(28.06mL)和適量磷鎢酸，室溫磁力攪拌，用薄層色譜判斷是否有新的產(chǎn)物生成以及追蹤反應(yīng)進(jìn)度，反應(yīng)完全后，加適量三乙胺中和反應(yīng)液至中性，反應(yīng)完全后將反應(yīng)液減壓蒸出，濃縮物加水，有固體物質(zhì)析出，抽濾，洗滌濾餅，得到目標(biāo)產(chǎn)物粗品，重結(jié)晶即可得到目標(biāo)產(chǎn)物純品。

(2R,3S,3aS,6aS,7R,7aR,10S,13S,13aR,13bS,14S,17S)-1',8-diethyl-3,13,17-trime thoxy-13b,14-dimethyl-2'-oxo-1,2,3,7,7a,8,9,10,11,12,13,13b-dodecahydrospiro[10,13a,7-(epiethane[1,1,2]triyl)-2,6a-ethano[1,3]dioxolo[4',5':7,7a]indeno[5,4-b]azocine-5, 3'-indolin]-10-yl 2-acetamidobenzoate

棕色無定型粉末39.01mg，收率59.25％，m.p.228～230℃。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ(ppm):10.55(1H,s),8.27(1H,d,J＝8.1Hz),7.84(1H,d,J＝8.0Hz),7.67(2H,m),7.56(2H,m),7.11-7.21(2H,m),3.70(2H,q),3.41(1H,d,J＝11.3Hz),3.34(6H,s),3.26(3H,s),3.20(8H,m),2.88(1H,s),2.68(2H,d,J＝14.6,7.8Hz),2.35(1H,d,J＝10.6Hz),2.26(3H,m),2.12(3H,s),1.94(4H,m),1.38(2H,q),1.17(3H,t,J＝7.1Hz),1.03(3H,t,J＝7.1Hz).¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆)δ(ppm):170.05,168.59,165.90,150.35,147.52,139.75,138.14,133.46,130.55,124.46,123.04,117.47,110.57,102.59,89.13,84.30,83.31,78.02,73.40,60.31,56.94,55.96,55.25,50.64,48.18,47.46,42.87,35.16,34.24,31.49,24.49,13.27,12.24.

實(shí)施例8

高烏甲素與N-甲基-6-氯靛紅的縮合產(chǎn)物

于100mL燒瓶中，投入高烏甲素50mg、N-甲基-6-氯靛紅33.45mg、原甲酸三甲酯27.22mg(28.06mL)和適量磷鎢酸，室溫磁力攪拌，用薄層色譜判斷是否有新的產(chǎn)物生成以及追蹤反應(yīng)進(jìn)度，反應(yīng)完全后，加適量三乙胺中和反應(yīng)液至中性，反應(yīng)完全后將反應(yīng)液減壓蒸出，濃縮物加水，有固體物質(zhì)析出，抽濾，洗滌濾餅，得到目標(biāo)產(chǎn)物粗品，重結(jié)晶即可得到目標(biāo)產(chǎn)物純品。

(2R,3S,3aS,6aS,7R,7aR,10S,13S,13aR,13bS,14S,17S)-6'-chloro-8-ethyl-3,13,17-trimethoxy-1',13b,14-trimethyl-2'-oxo-1,2,3,7,7a,8,9,10,11,12,13,13b-dodecahydrospi ro[10,13a,7-(epiethane[1,1,2]triyl)-2,6a-ethano[1,3]dioxolo[4',5':7,7a]indeno[5,4-b]az ocine-5,3'-indolin]-10-yl 2-acetamidobenzoate

橙黃色無定型粉末28.11mg，收率41.59％，m.p.245～247℃。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ(ppm):10.54(1H,s),8.26(1H,d,J＝8.8Hz),7.84(1H,d,J＝6.9Hz),7.55(2H,m),7.35(1H,d,J＝1.7Hz),7.18(2H,m),3.42(1H,d,J＝9.4Hz),3.35(9H,s),3.27(4H,m),3.21(6H,m),3.14(3H,s),2.90(1H,s),2.70(2H,dd,J＝13.8,7.5Hz),2.30(3H,m),2.12(3H,s),1.95(3H,m),1.40(2H,q),1.04(3H,t,J＝9.6Hz).¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆)δ(ppm):170.61,168.11,166.19,152.57,142.49,133.93,125.62,122.89,120.33,115.88,111.10,103.53,100.11,89.31,83.29,82.66,73.20,68.43,57.05,55.77,55.13,50.40,47.90,35.26,33.32,26.24,24.44,13.70.HRMS(ESI)calcd.for C₄₁H₄₈ClN₃O₉[M+H]⁺:761.3079,found:761.3023.

實(shí)施例9

高烏甲素與N-乙基-6-氯靛紅的縮合產(chǎn)物

于100mL燒瓶中，投入高烏甲素50mg、N-乙基-6-氯靛紅35.85mg、原甲酸三甲酯27.22mg(28.06mL)和適量磷鎢酸，室溫磁力攪拌，用薄層色譜判斷是否有新的產(chǎn)物生成以及追蹤反應(yīng)進(jìn)度，反應(yīng)完全后，加適量三乙胺中和反應(yīng)液至中性，反應(yīng)完全后將反應(yīng)液減壓蒸出，濃縮物加水，有固體物質(zhì)析出，抽濾，洗滌濾餅，得到目標(biāo)產(chǎn)物粗品，重結(jié)晶即可得到目標(biāo)產(chǎn)物純品。

(2R,3S,3aS,6aS,7R,7aR,10S,13S,13aR,13bS,14S,17S)-6'-chloro-1',8-diethyl-3,13,17-trimethoxy-13b,14-dimethyl-2'-oxo-1,2,3,7,7a,8,9,10,11,12,13,13b-dodecahydro spiro[10,13a,7-(epiethane[1,1,2]triyl)-2,6a-ethano[1,3]dioxolo[4',5':7,7a]indeno[5,4-b]azocine-5,3'-indolin]-10-yl 2-acetamidobenzoate

黃色無定型粉末30.02mg，收率43.64％，m.p.231～233℃。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ(ppm):10.55(1H,s),8.27(1H,d,J＝8.3Hz),7.84(1H,d,J＝8.0Hz),7.56(2H,d,J＝8.0Hz),7.41(1H,s),7.15-9.19(2H,m),3.70(2H,q,J＝7.1Hz),3.41(1H,d,J＝11.3Hz),3.35(9H,s),3.26(3H,s),3.20(7H,m),2.89(1H,s),2.68(2H,q,J＝14.6Hz),2.35(1H,m),2.26(2H,m),2.12(3H,s),1.95(3H,m),1.39(2H,q J＝14.4Hz),1.17(3H,t,J＝8.2Hz),1.03(3H,t,J＝7.1Hz).¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆)δ(ppm):178.27,168.40,165.90,151.36,142.46,139.94,125.85,122.83,120.63,116.20,110.99,103.89,83.02,82.38,77.94,73.50,57.04,55.76,55.20,55.12,50.69,50.57,48.20,42.46,35.54,34.47,31.35,26.02,24.44,23.80,13.07,12.20.

實(shí)施例10

高烏甲素與N-乙基-5-氟靛紅的縮合產(chǎn)物

于100mL燒瓶中，投入高烏甲素50mg、N-乙基-5-氟靛紅33.04mg、原甲酸三甲酯27.22mg(28.06mL)和適量磷鎢酸，室溫磁力攪拌，用薄層色譜判斷是否有新的產(chǎn)物生成以及追蹤反應(yīng)進(jìn)度，反應(yīng)完全后，加適量三乙胺中和反應(yīng)液至中性，反應(yīng)完全后將反應(yīng)液減壓蒸出，濃縮物加水，有固體物質(zhì)析出，抽濾，洗滌濾餅，得到目標(biāo)產(chǎn)物粗品，重結(jié)晶即可得到目標(biāo)產(chǎn)物純品。

(2R,3S,3aS,6aS,7R,7aR,10S,13S,13aR,13bS,14S,17S)-1',8-diethyl-7'-fluoro-3,13,17-trimethoxy-13b,14-dimethyl-2'-oxo-1,2,3,7,7a,8,9,10,11,12,13,13b-dodecahydrosp iro[10,13a,7-(epiethane[1,1,2]triyl)-2,6a-ethano[1,3]dioxolo[4',5':7,7a]indeno[5,4-b]a zocine-5,3'-indolin]-10-yl 2-acetamidobenzoate

暗紅色無定型粉末38.13mg，收率56.59％，m.p.233～235℃。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ(ppm):10.54(1H,s),8.25(1H,d,J＝7.4Hz),7.84(1H,d,J＝6.5Hz),7.51-7.60(2H,m),7.46(1H,d,J＝9.8Hz),7.15-7.24(2H,m),3.71(2H,q,J＝7.2Hz),3.42(1H,d,J＝9.4Hz),3.35(6H,s),3.26(3H,s),3.21(8H,m),2.90(1H,s),2.69(2H,q),2.26(4H,m),2.12(3H,s),1.95(4H,m),1.40(2H,q,J＝12.7Hz),1.17(3H,t,J＝7.2Hz),1.04(3H,t,J＝6.3Hz).¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆)δ(ppm):179.48,168.10,165.90,157.39,155.45,146.92,133.62,130.42,128.29,126.05,124.13,123.47,122.85,120.63,118.42,111.75,111.47,89.03,87.09,84.21,82.66,75.43,73.21,57.06,55.76,55.38,50.13,48.19,46.98,42.45,35.24,34.31,33.02,25.73,24.43,13.36,12.14.

實(shí)施例11

本發(fā)明化合物的抗腫瘤活性測試

對本發(fā)明的化合物進(jìn)行了腫瘤細(xì)胞增殖抑制試驗(yàn)，試驗(yàn)方法采用常規(guī)的MTT法。

細(xì)胞株選用：人前列腺癌(PC-3)，人胃腺癌細(xì)胞(SGC-7901)，人肺癌細(xì)胞(A-549)，人乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)，人肝癌細(xì)胞(HepG2)。培養(yǎng)液為DMEM+15％NBS+雙抗。

樣品液的配制：用DMSO(Merck)溶解后，加入PBS(-)配成的100μmol/L的溶液或者均勻的混懸液，然后用DMSO的PBS(-)稀釋，最終濃度分別為0.1，1，10，20，40，60，80，100μmol/L。

將抗腫瘤藥物5-氟尿嘧啶(5-FU)以同樣的條件配成對照品溶液。

細(xì)胞培養(yǎng)：貼壁生長腫瘤細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)于含10％滅活新生牛血清和青霉素、鏈霉素(各100萬U/L)的1640培養(yǎng)液中，置于37℃，5％CO2，飽和濕度的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁生長，每2～3天傳代1次，傳代時首先倒出培養(yǎng)液，PBS洗2次，胰酶消化后，加入新鮮的培養(yǎng)液吹打均勻，調(diào)整細(xì)胞至適當(dāng)濃度移入新的培養(yǎng)瓶中，添加培養(yǎng)液至適量。取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

MTT法檢測細(xì)胞活性及IC₅₀的測定：

實(shí)驗(yàn)原理：活細(xì)胞線粒體中脫氫酶能將黃色的MTT還原成不溶于水的藍(lán)紫色產(chǎn)物甲臜(MTT formazan)，并沉積在細(xì)胞中，生成的量與活細(xì)胞數(shù)目成正比，而死細(xì)胞沒有這種功能。DMSO能溶解藍(lán)紫色結(jié)晶物，顏色深淺與所含的量成正比，因此用酶標(biāo)儀測定的光吸收值可反映細(xì)胞存活率。

實(shí)驗(yàn)方法：取對數(shù)生長期細(xì)胞，消化、計(jì)數(shù)，以3×105/mL的密度接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100μl。培養(yǎng)24小時后，將待測化合物以0.1，1，10，20，40，60，80，100μmol/L濃度處理細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)組每個濃度設(shè)5個復(fù)孔，以含0.4％DMSO的培養(yǎng)液作對照。藥物作用48小時后，去上清，每孔加入100μl MTT(2-(4，5-二甲基-2-噻唑基)-3，5-二苯基-2H-四唑氫溴酸鹽)(1mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)4小時，棄上清，每孔加入100μl DMSO，振蕩混勻，用酶標(biāo)儀在570nm處測定吸光度值，采用IC₅₀計(jì)算軟件求出半數(shù)抑制濃度(IC₅₀)。

試驗(yàn)結(jié)果詳見表1，其中，樣品是指相應(yīng)實(shí)施例中制備的高烏甲素靛紅雜合體，樣品編號對應(yīng)制備實(shí)施例中所得到的化合物的具體編號。

表1化合物對不同腫瘤細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度IC₅₀(單位：μmol/L)

化合物2在所測試的5種細(xì)胞株中均表現(xiàn)出了良好的抗腫瘤活性，化合物3次之，在不同的細(xì)胞株中也表現(xiàn)出了良好的抗腫瘤活性。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明的化合物具有良好的抗腫瘤活性，特別是高烏甲素與5-氟靛紅的縮合產(chǎn)物，抗腫瘤活性明顯。其他化合物的活性在特定細(xì)胞株中抗腫瘤活性與5-氟尿嘧啶相近，對不同腫瘤細(xì)胞株具有明顯選擇性。綜上，本發(fā)明的高烏甲素靛紅雜合體可作為抗腫瘤候選藥物進(jìn)一步進(jìn)行臨床前研究，也可以做為抗腫瘤先導(dǎo)化合物進(jìn)一步研究。