一種基于四氧化三鐵納米簇催化信號放大的可視化檢測傳感器及其構(gòu)建與應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開一種基于四氧化三鐵納米簇催化信號放大的可視化檢測傳感器及其構(gòu)建與應(yīng)用，屬于生物檢測技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明主要包括：(1)四氧化三鐵納米簇探針的制備；(2)構(gòu)建基于四氧化三鐵納米簇探針催化信號放大的可視化檢測傳感器；(3)對食源性致病菌進(jìn)行快速和可視化檢測。所用四氧化三鐵納米簇探針由于納米粒子聚集作用，催化能力增強(qiáng)，從而大大提高檢測靈敏度。所述傳感器構(gòu)建簡單方便，可保存使用。該方法穩(wěn)定性好，可不通過昂貴的儀器進(jìn)行檢測，通過裸眼即可進(jìn)行比色檢測，利于拓展到現(xiàn)場檢測；檢測過程快速簡單，利用已準(zhǔn)備好的傳感器，整個(gè)檢測可以在145分鐘內(nèi)完成。展現(xiàn)了良好的潛能可拓展應(yīng)用到食源性致病菌的現(xiàn)場檢測中去。
【專利說明】
-種基于四氧化H鐵納米簇催化信號放大的可視化檢測傳感 器及其構(gòu)建與應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種基于四氧化=鐵納米簇催化信號放 大的可視化檢測傳感器及其構(gòu)建與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 由于食源性疾病的高爆發(fā)率，食源性致病菌對于公共健康已經(jīng)成為了重大的威 脅。食源性致病菌的識別方法需要具有快速，準(zhǔn)確和方便的特性。傳統(tǒng)的食源性致病菌識別 方法多基于培養(yǎng)和菌落形態(tài)觀察，并且結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)的生化識別。運(yùn)些方法雖相對可靠，但是要 求專業(yè)人員操作，工作強(qiáng)度大，且所需時(shí)間長?；诤怂釘U(kuò)增的檢測方法被廣泛用來檢測食 源性致病菌，如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，依賴核酸序列的擴(kuò)增（NASBA)，環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增 (LAMP)等。雖然運(yùn)些方法靈敏度高，但是需要細(xì)胞裂解和核酸提取，及昂貴和專業(yè)的儀器。 免疫檢測的方法已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于食源性致病菌檢測，如酶聯(lián)免疫檢測化LISAKS明治 ELISA是一種常見的形式，運(yùn)種免疫檢測設(shè)及兩個(gè)抗體分別結(jié)合在致病菌的兩個(gè)不同的位 點(diǎn)，通常通過酶催化顯色底物來進(jìn)行比色檢測。然而當(dāng)前發(fā)展的比色免疫檢測被它們的低 靈敏度所限制，尤其當(dāng)所要檢測標(biāo)志物量低時(shí)，運(yùn)成為了檢測食源性致病菌的一個(gè)瓶頸。因 此發(fā)展一種快速的，高靈敏度的，方便操作的檢測方法具有重要的價(jià)值和意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，本發(fā)明的首要目的在于提供一種具有催化活性 的功能化四氧化=鐵納米簇探針的合成方法。
[0004] 本發(fā)明的另一目的在于提供通過上述合成方法得到的功能化四氧化=鐵納米簇 探針。該功能化納米簇探針可用于可視化檢測傳感器的構(gòu)建。
[0005] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種基于四氧化=鐵納米簇催化信號放大的可視化 檢測傳感器的構(gòu)建方法。
[0006] 本發(fā)明的另一目的在于提供通過上述構(gòu)建方法得到的基于四氧化=鐵納米簇催 化信號放大的可視化檢測傳感器。
[0007] 本發(fā)明的再一目的在于提供一種基于四氧化=鐵納米簇催化信號放大的可視化 檢測傳感器對食源性致病菌進(jìn)行快速和可視化檢測的方法。
[000引本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0009] -種具有催化活性的功能化四氧化=鐵納米簇探針的合成方法，具體包括如下步 驟：
[0010] 通過水熱法合成表面簇基化的四氧化S鐵納米粒子（FesCkNP)，通過聚賴氨酸 (化U上氨基與FesCkNP上簇基之間進(jìn)行縮合反應(yīng)形成交聯(lián)，從而形成四氧化S鐵納米粒子 簇(FesCkNPC);特異性的適配體與得到的化304NPC連接即得到功能化的FesCkNPC probe。
[001。 所述的化3O4NP，表面基團(tuán)：-COOH，粒徑為200~300nm，濃度為5mg/血；
[0012] 所述的聚賴氨酸分子量是30~70kDa。
[001引所述的水熱法合成表面簇基化的Fe304NP的反應(yīng)步驟如下：
[0014] 1) W乙二醇為基礎(chǔ)液，混合加入六水合氯化鐵，攬拌形成澄清溶液；
[0015] 2)向澄清溶液中加入醋酸鋼，將混合液攬拌；
[0016] 3)將攬拌均勻的混合液加入聚四氣乙締高壓反應(yīng)蓋中反應(yīng)后在室溫中冷卻高壓 反應(yīng)蓋；
[0017] 4)得到產(chǎn)物用超純水和乙醇清洗，用磁分離器去除多余液體，在真空中干燥產(chǎn)物， 得到表面簇基化的化304NP。
[0018] 步驟1)中所述的六水合氯化鐵，乙二醇均購自美國西格瑪奧德里奇公司，六水合 氯化鐵用量優(yōu)選為10~30g/l;更優(yōu)選為30g/L
[0019] 步驟2)中所述的醋酸鋼用量優(yōu)選為50~75g/L，更優(yōu)選為75g/L，購自廣州試劑廠；
[0020] 步驟2)中所述的攬拌的時(shí)間優(yōu)選為30~60分鐘;更優(yōu)選為30分鐘；
[0021] 步驟3)中所述的反應(yīng)的條件優(yōu)選為180~200°C反應(yīng)16~20小時(shí)；更優(yōu)選為200°C 反應(yīng)16小時(shí)；
[0022] 步驟4)中所述的干燥的時(shí)間優(yōu)選為10~12小時(shí)。
[0023] 所述的Fe3〇4NPC合成的合成反應(yīng)步驟如下：
[0024] 1)將1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽巧DC)通過滿旋溶解在PBS緩沖 液，將Fe3〇4NP加入其中，室溫解育活化；
[0025] 2)然后加入化L，4°C解育過夜；
[00%] 3)去除多余的未反應(yīng)的化L和抓C，F(xiàn)e3化NPC形成，將產(chǎn)物重分散在PBS緩沖液中，4 °C保存?zhèn)溆谩?br>[0027]步驟1)中所述的邸C購自美國西格瑪奧德里奇公司；
[002引步驟1)中所述的PBS緩沖液優(yōu)選為1 X PBS緩沖液，pH7.4~7.6，用量優(yōu)選為0.5~ ImL，購自上海生工生物工程公司；
[0029] 步驟1)中所述的邸C在PBS緩沖液中的濃度優(yōu)選為1~5mg/mL更優(yōu)選為Img/mL
[0030] 步驟1)中所述的EDC與Fe3〇4NP的質(zhì)量比優(yōu)選為（1~5): 1;
[0031 ]步驟1)中所述的室溫解育活化的時(shí)間優(yōu)選為30~60分鐘；
[0032] 步驟2)中所述的化L的分子量優(yōu)選為30~70kDa，購自美國西格瑪奧德里奇公司， 濃度優(yōu)選為5~15yg/ni;優(yōu)選為12.5yg/ni;
[0033] 所述的化3O4NPC probe的制備反應(yīng)步驟：
[0034] 1)用邸C和徑基班巧酷亞胺(畑S)活化Fe3〇4NPC，室溫下活化；
[0035] 2)用PBS緩沖液清洗產(chǎn)物后，活化的FesCkNPC與特異性的適配體解育在醋酸鋼緩沖 液中，反應(yīng)解育過夜，然后用PBS緩沖液清洗連接產(chǎn)物；
[0036] 3)將產(chǎn)物重分散在化is緩沖液中，室溫下解育，用PBS緩沖液清洗，重分散在PBS緩 沖液中儲存在4°C備用。
[0037] 步驟1)中所述的抓C和NHS的濃度優(yōu)選均為1~5mg/mL，更優(yōu)選均為Img/mL，NHS購 自美國西格瑪奧德里奇公司；
[0038] 步驟1)中所述的活化的時(shí)間優(yōu)選為30~60分鐘；
[0039] 步驟2)中所述的特異性的適配體的優(yōu)選序列為：5'-N出-TTT TTT TTT TAT CCA TGG GGC GGA GAT GAG GGG GAG GAG GGC GGG TAC CCG GTT GAT-3'，合成自上海生工生物 工程公司；
[0040] 步驟2)中所述的醋酸鋼緩沖液濃度優(yōu)選為50~70mM，pH 5.0~6.0;更優(yōu)選為 SOmM，P冊.0;
[0041 ]步驟2)中所述的PBS緩沖液優(yōu)選1 X PBS緩沖液，pH7.4~7.6;
[0042] 步驟3)中所述的Tris緩沖液濃度優(yōu)選為50~60mM，pH7.0~8.0;更優(yōu)選為50mM， pH7.2；
[0043] 步驟3)中所述的解育的時(shí)間優(yōu)選為30~60分鐘。
[0044] 一種具有催化活性的功能化Fe3〇4NPC probe,通過上述制備方法得到。
[0045] -種基于上述FesCkNPC probe催化信號放大的可視化檢測傳感器的構(gòu)建方法，具 體步驟如下：
[0046] 1)用邸C和N服活化萬古霉素(化n);
[0047] 2)向已活化的化n溶液中加入牛血清白蛋白溶液(BSA)，4°C解育過夜；
[004引 3)向BSA-Van混合液中加入Tris緩沖液終止反應(yīng)；
[0049] 4)用超濾管離屯、去除多余未反應(yīng)的化n和邸C，轉(zhuǎn)速為5000~7000巧m。
[0050] 5)將BSA-Van加入到包被液中，用BSA-Van包被微孔板，震蕩；
[0051] 6)去除包被液，修飾的孔用清洗液清洗=次;然后用封閉液封閉微孔板，室溫下在 振蕩器上解育；
[0052] 7)去除封閉液，用清洗液清洗立次，最后每孔加上PBS，4°C保存?zhèn)溆?，基于?04NPC probe催化信號放大的可視化檢測傳感器構(gòu)建完成；
[0053] 步驟1)中所述的抓C的濃度優(yōu)選為20~50mg/mL，更優(yōu)選為20mg/mLNHS的濃度優(yōu) 選為1.0~5. Omg/mL，更優(yōu)選為1. Omg/mL
[0054] 步驟1)中所述的化n購自美國西格瑪奧德里奇公司；
[0055] 步驟2)中所述的BSA的濃度優(yōu)選為0.5~1. Omg/mL，更優(yōu)選為1. Omg/mL，購自上海 生工生物工程公司；
[0化6] 步驟3)中所述的TriS緩沖液濃度優(yōu)選為50~60mM，pH7.0~8.0;更優(yōu)選為50mM， pH7.2；
[0057] 步驟4)中所述的超濾管優(yōu)選為I OkDa;
[005引步驟5)中所述的包被液為Tris-HCl緩沖液，濃度優(yōu)選為0 . Ol~0.05M，pH7.5~ 8.7;更優(yōu)選為0.011，口冊.5;
[0059] 步驟5)中所述的包被微孔板的BSA-Van的濃度優(yōu)選為50~75iig/mL，更優(yōu)選為50y g/mL所述的微孔板優(yōu)選為96孔板；
[0060] 步驟5)中所述的震蕩的條件優(yōu)選為600~70化pm震蕩4°C過夜；
[OOW]步驟6)中所述的清洗液為包含0.05 %~0.1 % Tween-20的1 X PBS緩沖液;更優(yōu)選 為包含0.05 % Tween-20的1 X PBS緩沖液；
[0062] 步驟6)中所述的封閉液為包含2%~3 %BSA和0.05 %~0.1 % Tween-20的PBS緩 沖液;更優(yōu)選為包含3 % BSA和0.05 % Tween-20的PBS緩沖液；
[0063] 步驟6)中所述的解育的時(shí)間優(yōu)選為30~60分鐘；
[0064] 一種基于化304NPC probe催化信號放大的可視化檢測傳感器，通過上述方法構(gòu)建 得到；
[0065] 一種基于化304NPC probe催化信號放大的可視化檢測傳感器對食源性致病菌進(jìn)行 快速和可視化檢測的方法，具體步驟如下：
[0066] 1)檢測食源性致病菌樣品制備
[0067] 培養(yǎng)食源性致病菌直至OD 600值達(dá)到1.0;取食源性致病菌菌液，離屯、，去除培養(yǎng) 基，用PBS緩沖液清洗S次，得到食源性致病菌細(xì)胞重分散在PBS緩沖液中；并進(jìn)行梯度稀 釋，得到各濃度檢測菌液；
[0068] 2)可視化檢測傳感器對食源性致病菌進(jìn)行捕獲
[0069] 檢測樣品加入上述基于FesCkNPC probe催化信號放大的可視化檢測傳感器中，室 溫下解育，然后去除未捕獲樣品，用清洗液清洗=次；
[0070] 3)Fe3〇4NPC probe識別檢測食源性致病菌
[0071] 將化304NPC probe加入可視化檢測傳感器中，振蕩器上解育后去除未結(jié)合探針，清 觀三狄?，
[0072] 4)對可視化檢測傳感器上捕獲食源性致病菌進(jìn)行比色檢測
[0073] 將顯色底物加入可視化檢測傳感器中，在FesCkNPC probe的催化下，底物變色，檢 測波長為652nm;結(jié)果也能通過催化產(chǎn)物的顏色變化進(jìn)行裸眼檢測；
[0074] 所述的食源性致病菌優(yōu)選為革蘭氏陽性菌；
[0075] 所述的食源性致病菌優(yōu)選為單增李斯特菌化isteria mono巧togenes);
[0076] 步驟1)中所述的離屯、的條件優(yōu)選為5000~1000化pm離屯、2~5分鐘；
[0077] 步驟1)中所述的PBS緩沖液的濃度優(yōu)選為0.1~0.5M;更優(yōu)選為0.1M;
[0078] 步驟2)中所述的解育的時(shí)間優(yōu)選為30~60分鐘；
[0079] 步驟2)中所述的清洗液為包含0.05 %~0.1 % Tween-20的1 X PBS緩沖液;更優(yōu)選 為包含0.05 % Tween-20的1 X PBS緩沖液；
[0080] 步驟3)中所述的解育的時(shí)間優(yōu)選為30~60分鐘；
[0081] 步驟4)中所述的顯色底物優(yōu)選為四甲基聯(lián)苯胺顯色底物;所述的四甲基聯(lián)苯胺顯 色底物優(yōu)選為I-St巧叫tra TMB solution,購自美國賽默飛公司；
[0082] 本發(fā)明的基本原理如圖1所示：
[0083] Van與BSA連接，Van通過BSA的物理吸附作用結(jié)合到微孔板上。革蘭氏陽性菌與萬 古霉素通過牢固的五點(diǎn)氨鍵連接結(jié)合，化n牢固的錯(cuò)定在革蘭氏菌細(xì)胞壁上的D-Ala-D-Ala 基團(tuán)上，而D-Ala-D-Ala來自細(xì)菌細(xì)胞壁上的N-乙酷-葡萄糖膚和N-乙酷胞壁酸。適配體標(biāo) 記的Fe3〇4NP抗只別細(xì)菌通過強(qiáng)特異性結(jié)合在細(xì)菌細(xì)胞壁上的內(nèi)源蛋白A上。運(yùn)樣S明治識別 復(fù)合體在微孔板上形成了。FesCkNPC的合成通過單個(gè)的FesCkNP與化L交聯(lián)，P化在每個(gè)重復(fù) 單元具有一個(gè)氨基基團(tuán)。FesCkNPC具有S個(gè)功能：識別，可視化和信號放大。Fes化NP具有內(nèi) 在的過氧化物酶活性，利用Fe3〇4NPC的聚集作用，F(xiàn)esCkNPC相比較化304NP會有更高的催化能 力。運(yùn)樣傳感器通過化304NPC probe催化顯色底物可W產(chǎn)生變色反應(yīng)，因此可W直接可視化 檢測細(xì)菌。此方法可W成為一個(gè)有效的信號放大策略用于納米粒子催化的比色檢測。
[0084] 本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)，具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果：
[0085] (1)基于化304NPC probe催化信號放大的可視化檢測傳感器構(gòu)建簡單方便，可保存 使用。
[0086] (2)該方法穩(wěn)定性好，可不通過昂貴的儀器進(jìn)行檢測，通過裸眼即可進(jìn)行比色檢 測，利于拓展到現(xiàn)場檢測。
[0087] (3)該傳感器有明顯的靈敏度增強(qiáng)效應(yīng)，能通過FesCkNPC的聚集效應(yīng)增強(qiáng)催化能 力，從而大大提局檢測靈敏度。
[0088] (4)可快速檢測，使用已構(gòu)建完成的可視化檢測傳感器，整個(gè)檢測過程用時(shí)145分 鐘。本發(fā)明的方法展現(xiàn)了良好的潛能可拓展應(yīng)用到食源性致病菌的現(xiàn)場檢測中去。
【附圖說明】
[00例圖1是制備FesCkNPC probe的原理圖及基于FesCkNPC probe催化信號放大的可視 化檢測傳感器的原理圖。
[0090] 圖2是合成的化304NP形貌表征透射電鏡照片及制備FesCkNPC probe過程中納米粒 子表面Zeta電位變化檢測結(jié)果圖。
[0091] 圖3是基于FesCkNPC probe催化信號放大的可視化檢測傳感器靈敏度可視化檢測 結(jié)果對比，及靈敏度統(tǒng)計(jì)檢測結(jié)果對比。
【具體實(shí)施方式】
[0092] 下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限 于此。
[0093] 下述實(shí)驗(yàn)方法如無特別說明，均為常規(guī)方法，所使用的實(shí)驗(yàn)材料如無特別說明，均 可容易地從商業(yè)公司獲取。
[0094] FesCkNPC probe的制備原理圖，見圖1A;基于化304NPC probe催化信號放大的可視 化檢測傳感器的原理圖，見圖1B。
[0095] 實(shí)施例1:合成具有催化活性的功能化Fe3〇4NPC probe,具體包括如下步驟：
[0096] 1. W 20mL乙二醇為基礎(chǔ)液，混合加入0.6g六水合氯化鐵，攬拌形成澄清溶液，向澄 清溶液中加入1.5g醋酸鋼，混合液大力攬拌30分鐘，將攬拌均勻的混合液加入聚四氣乙締 高壓反應(yīng)蓋中200°C反應(yīng)16小時(shí)后在室溫中冷卻高壓反應(yīng)蓋，得到產(chǎn)物用超純水和乙醇清 洗，用磁分離器去除多余液體，在真空中干燥產(chǎn)物12小時(shí)，得到表面簇基化的化304NP;
[0097] 2.將Img EDC通過滿旋溶解在IXPBS緩沖液，將Img化3O4NP加入其中，室溫解育活 化30分鐘，加入12.5iig P化，4°C解育過夜。用磁分離器去除多余的未反應(yīng)的化L和抓C， 化304NPC形成，將產(chǎn)物重分散在1血PBS緩沖液中，4°C保存?zhèn)溆茫?br>[009引 3.用Img/mL EDC和N服活化Img Fe304NPC，室溫下活化30分鐘；用IXPBS緩沖液(pH 7.4~7.6)清洗產(chǎn)物后，活化的化3O4NPC與特異性的適配體解育在50mM醋酸鋼緩沖液中（pH 6.0)，反應(yīng)解育過夜，然后用PBS緩沖液清洗連接產(chǎn)物;將產(chǎn)物重分散在50mM化is緩沖液 (抑7.2)中，室溫下解育30分鐘，用PBS緩沖液清洗，重分散在ImL PBS緩沖液中儲存在4°C 備用。
[0099] 所述的特異性的適配體的序列為：5'-NH2-TTT TTT TTT TAT CCA TGG GGC GGA GAT GAG GGG GAG GAG GGC GGG TAC CCG GTT GAT-3'，合成自上海生工生物工程公司。
[0100] 對實(shí)施例1中得到的FesCkNP通過透射電鏡進(jìn)行拍照，見圖2A;圖2B為制備化304NPC probe過程中納米粒子表面Zeta電位變化檢測結(jié)果圖。
[0101] 實(shí)施例2:構(gòu)建基于上述Fe3〇4NPC probe催化信號放大的可視化檢測傳感器：
[0102] 1.用300化 EDC(20mg/mL)和300化 NHS(1.0mg/mL)活化IOmg Van,向已活化的Van 溶液中加入250化BSA(1 .Omg/mL)，4°C解育過夜。向BSA-Van混合液中加入40化his緩沖 液（50mM，pH7.2)終止反應(yīng)。用IOkDa超濾管離屯、去除多余未反應(yīng)的Van和EDC，轉(zhuǎn)速為 5000巧m。
[0103] 2.將 BSA-Van 加入到包被液（0.01M，pH 8.5的Tris-HCl緩沖液）中，用50i^g/mL BSA-Van包被96孔板，每孔10化L，置于振蕩器600~70化pm震蕩4 °C過夜。去除包被液，修飾 的孔用清洗液(包含0.05 % Tween-20的1 X PBS緩沖液)清洗S次，每孔30化L。然后用封閉液 (包含3%BSA和0.05%Tween-20的PBS緩沖液)封閉微孔板，每孔15化L，室溫下在振蕩器上 解育60分鐘，去除封閉液，用清洗液清洗S次，最后每孔加上25化L PBS，4°C保存?zhèn)溆?，基?化3O4NPC probe催化信號放大的可視化檢測傳感器構(gòu)建完成。
[0104] 實(shí)施例3基于FesCkNPC probe催化信號放大的可視化檢測傳感器對單增李斯特菌 進(jìn)行快速和可視化檢測，具體步驟如下：
[010日]1.檢測細(xì)菌樣品制備，實(shí)驗(yàn)所檢測菌為單增李斯特菌化isteria monocytogenes) (菌株號為CMCC54007，購自廣州微生物研究所)在IOmL LB培養(yǎng)基化B培養(yǎng)基的配方如下:將 1 .Og的膜蛋白腺，〇.5g的酵母提取物，1 .Og的化Cl加入到lOOmL水中，用化OH溶液調(diào)pH為 7.0)中進(jìn)行過夜培養(yǎng)的細(xì)菌，0D600為1，濃度約為IX IO8CfuAiU取ImL上述細(xì)菌菌液， 500化pm離屯、5分鐘，去除培養(yǎng)基，用PBS緩沖液清洗S次，得到細(xì)菌細(xì)胞重分散在0.1 M PBS 緩沖液中，并進(jìn)行梯度稀釋，得到各濃度檢測菌液；
[0106] 2.將150化檢測細(xì)菌樣品加入實(shí)施例2構(gòu)建的基于化304NPC probe催化信號放大的 可視化檢測傳感器中，室溫下解育30分鐘，然后去除未捕獲樣品，用清洗液清洗S次；100化 實(shí)施例1制備的Fe3〇4NPC probe加入可視化檢測傳感器中，振蕩器上解育30分鐘后去除未結(jié) 合探針，清洗=次。
[0107] 3.100化 I-Step Ultra TMB solution加入可視化檢測傳感器中，在FesCkNPC probe的催化下，底物變色，檢測波長為652皿。結(jié)果也可W通過催化產(chǎn)物的顏色變化進(jìn)行裸 眼檢測。
[0108] 圖3是基于FesCkNPC probe催化信號放大的可視化檢測傳感器靈敏度可視化檢測 結(jié)果對比，及靈敏度統(tǒng)計(jì)檢測結(jié)果對比。
[0109] 從圖3中可W看出，基于FesCkNPC probe催化信號放大的可視化檢測傳感器，單增 李斯特菌在1 X IO3到1 X IO8C化/mL濃度下可W被檢測到，肉眼可視檢測限為1 X IO3C化/mL, 與基于化3O4NP probe的方法相比靈敏度高了兩個(gè)數(shù)量級。
[0110] 上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的 限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化， 均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種具有催化活性的功能化Fe3〇4NPC probe的合成方法，其特征在于包括如下步驟： 通過水熱法合成表面羧基化的Fe3O4NP,通過聚賴氨酸上氨基與Fe3O 4NP上羧基之間進(jìn)行 縮合反應(yīng)形成交聯(lián)，從而形成Fe3O4NPC;特異性的適配體與得到的Fe3O 4NPC連接即得到功能 化Fe3〇4NPC probe。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的合成方法，其特征在于:所述的Fe3O4NP,表面基團(tuán)：-C00H，粒徑 為200~300nm; 所述的聚賴氨酸分子量是30~70kDa。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的合成方法，其特征在于:所述的Fe3O4NPC的合成反應(yīng)步驟如下： 1) 將EDC通過渦旋溶解在PBS緩沖液，將Fe3O4NP加入其中，室溫孵育活化； 2) 然后加入聚賴氨酸，4°C孵育過夜； 3) 去除多余的未反應(yīng)的PLL和EDC，F(xiàn)e3〇4NPC形成，將產(chǎn)物重分散在PBS緩沖液中，4°C保 存?zhèn)溆谩?. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的合成方法，其特征在于:所述的Fe3〇4NPC probe的制備反應(yīng)步 驟： 1) 用EDC和NHS活化Fe3O4NPC，室溫下活化； 2) 用PBS緩沖液清洗產(chǎn)物后，活化的Fe3O4NPC與特異性的適配體孵育在醋酸鈉緩沖液 中，反應(yīng)孵育過夜，然后用PBS緩沖液清洗連接產(chǎn)物； 3) 將產(chǎn)物重分散在Tris緩沖液中，室溫下孵育，用PBS緩沖液清洗，重分散在PBS緩沖液 中儲存在4°C備用。5. 根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的合成方法，其特征在于:所述的特異性的適配體的序列為： 5'-NH2-TTT TTT TTT TAT CCA TGG GGC GGA GAT GAG GGG GAG GAG GGC GGG TAC CCG GTT GAT-3，。6. -種具有催化活性的功能化Fe3〇4NPC probe，其特征在于通過權(quán)利要求1~5任一項(xiàng) 所述的制備方法得到。7. -種基于Fe3〇4NPC probe催化信號放大的可視化檢測傳感器的構(gòu)建方法，其特征在 于具體步驟如下： 1) 用EDC和NHS活化萬古霉素； 2) 向已活化的Van溶液中加入牛血清白蛋白溶液，4 °C孵育過夜； 3) 向BSA-Van混合液中加入Tr i s緩沖液終止反應(yīng)； 4) 用超濾管離心去除多余未反應(yīng)的Van和EDC，轉(zhuǎn)速為5000~7000rpm; 5) 將BSA-Van加入到包被液中，用BSA-Van包被微孔板，震蕩； 6) 去除包被液，修飾的孔用清洗液清洗三次;然后用封閉液封閉微孔板，室溫下在振蕩 器上孵育； 7) 去除封閉液，用清洗液清洗三次，最后每孔加上PBS，4°C保存?zhèn)溆?，基于Fe3O4NPC probe催化信號放大的可視化檢測傳感器構(gòu)建完成。8. -種基于Fe3〇4NPC probe催化信號放大的可視化檢測傳感器，其特征在于通過權(quán)利 要求7所述的構(gòu)建方法構(gòu)建得到。9. 一種基于Fe3O4NPC probe催化信號放大的可視化檢測傳感器對食源性致病菌進(jìn)行快 速和可視化檢測的方法，其特征在于具體步驟如下： 1) 檢測食源性致病菌樣品制備 培養(yǎng)食源性致病菌直至OD 600值達(dá)到1.0 ;取食源性致病菌菌液，離心，去除培養(yǎng)基，用 PBS緩沖液清洗三次，得到食源性致病菌細(xì)胞重分散在PBS緩沖液中；并進(jìn)行梯度稀釋，得到 各濃度檢測菌液； 2) 可視化檢測傳感器對食源性致病菌進(jìn)行捕獲 檢測樣品加入上述基于Fe3O4NPC probe催化信號放大的可視化檢測傳感器中，室溫下 孵育，然后去除未捕獲樣品，用清洗液清洗三次； 3. Fe3〇4NPC probe識別檢測食源性致病菌 將Fe3O4NPC probe加入可視化檢測傳感器中，振蕩器上孵育后去除未結(jié)合探針，清洗三 次； 4) 對可視化檢測傳感器上捕獲食源性致病菌進(jìn)行比色檢測 將顯色底物加入可視化檢測傳感器中，在Fe3O4NPC probe的催化下，底物變色，檢測波 長為652nm;結(jié)果也能通過催化產(chǎn)物的顏色變化進(jìn)行裸眼檢測。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于： 所述的食源性致病菌為革蘭氏陽性菌。
【文檔編號】G01N1/28GK105954268SQ201610256776
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年4月22日
【發(fā)明人】周小明, 邢達(dá), 張麗莎
【申請人】華南師范大學(xué)