來自水稻條紋病毒的一段提高蛋白表達水平的核苷酸序列的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一段核苷酸序列，將它連接到基因編碼區(qū)的上游后再進行常規(guī)的外源基因在植物體內(nèi)的表達過程。優(yōu)選的，核苷酸序列被連接到外源基因編碼區(qū)起始密碼子的上游。這樣，可大大提高外源基因在植物體內(nèi)的表達水平。
【專利說明】
來自水稻條紋病毒的一段提高蛋白表達水平的核昔酸序列
技術(shù)領域
[0001] 本發(fā)明設及生物技術(shù)領域，用于提高外源基因在植物體內(nèi)的表達水平。
【背景技術(shù)】
[0002] 植物的瞬時表達系統(tǒng)是一種較為安全快速的外源蛋白表達體系，但其蛋白表達水 平較低廣受人垢病。大量研究表明，基因的5'UTR在基因的調(diào)控中起重要作用。mRNA S^UTR 可通過對翻譯起始過程的調(diào)控來影響基因的翻譯水平。已有實驗證實，煙草花葉病毒的前 導序列即5/UTR作為蛋白翻譯增強子在體外表達系統(tǒng)中很大程度上增加蛋白翻譯水平。此 外，5 ' UTR還參與mRNA的穩(wěn)定性，折疊，核內(nèi)運輸相互作用，RNA加工，剪切和翻譯機器，及細 胞內(nèi)的運輸和定位，如mRNA 5 ' UTR可能通過與某個結(jié)合蛋白相互作用來影響mRNA半衰期， 進而調(diào)控mRNA穩(wěn)定性。
[0003] 運就有必要對傳統(tǒng)的植物的瞬時表達系統(tǒng)進行改進，從而提高蛋白表達水平。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 鑒于5'UTR具有調(diào)芐基因表達的特點，我們就利用其特點進而提高基因表達水平。
[0005] 本發(fā)明的序列來源于水稻條紋病毒RNA基因組，該病毒基因組序列雖然已報道，我 們發(fā)現(xiàn)其中一段序列能夠在翻譯水平上提高基因表達水平，運是W往未曾報道的結(jié)果。
[0006] -方面，本發(fā)明提供一段核巧酸序列，將它連接到基因編碼區(qū)的上游后再進行常 規(guī)的外源基因在植物體內(nèi)的表達過程。運樣，可大大提高外源基因在植物體內(nèi)的表達水平。 優(yōu)選的，核巧酸序列被連接到外源基因編碼區(qū)起始密碼子的上游。
[0007] 另一方面，本發(fā)明提供一種質(zhì)粒載體，其中，在該質(zhì)粒載體的基因編碼區(qū)的上游包 括一段核巧酸序列，該核巧酸序列能夠提高外源基因在植物體內(nèi)的表達水平。優(yōu)選的，該基 因序列被連接到外源基因編碼區(qū)起始密碼子的上游。
[000引再有另一方面，一種核巧酸序列在制備外源基因表達質(zhì)粒載體上的用途，其中該 基因序列被插入到質(zhì)粒載體中的基因編碼區(qū)的上游。優(yōu)選的，基因序列被連接到外源基因 編碼區(qū)起始密碼子的上游。
[0009] 在W上所有實施方式中，優(yōu)選的，所述的核巧酸序列為：acacaaagtc tgggtaataa aattttcgat tttgctttta cattccaaat ttcatctaag ccgcaaccat tcctccagta cctcttgcta c過〇
[0010] 在W上所有實施方式中，優(yōu)選的，所述的核巧酸序列來源于水稻條紋病毒。
[0011] 另一方面，本發(fā)明提供一種獲得能夠提高外源基因在植物體內(nèi)的表達水平的核巧 酸的方法，該方法包括如下步驟:Trizol法抽提感染水稻條紋病毒的水稻的總RNA，反轉(zhuǎn)錄 為 cDNA;W 此為模板，用 P1(ACACAAAGTCTGGGTAATA)(SEQ N0.1)和 P2 (TGTAGCAAGAGGTACTGGA)(沈Q NO. 2)引物進行PCR反應。
[0012] 優(yōu)選的，擴增體系如下：10XEX Taq buffer 5μ1，2.5πιΜ dNTPs 扣Ι,ΙΟμΜ P巧口P2 各化1，ΕΧ Taq酶(抓/μLΗμΙ(購自大連Takara公司），無菌水補足50μ1。
[OOU] 優(yōu)選的，反應條件為94°c預變性3min;94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸30s， 35個循環(huán)；72°C延伸lOmin。
[0014]優(yōu)選的，PCR產(chǎn)物經(jīng)Qiagen凝膠純化試劑盒（德國Qiagen公司）純化后，利用 PromegapGE:M?-T EASY Vector(美國Promega公司）進行PCR片段的TA克隆，條件如下：2X Promega ligase buffer 5yl，pGEM'9-T EASY Vector lyl，PCR回收片段化liPromega T4-ligase化1(美國Promega公司），無菌水化1，混勻后4°C反應16h;反應完畢后，取10μ1反 應液加入到含有1〇化1大腸桿菌感受態(tài)細胞的離屯、管中，輕輕混勻冰上放置30min后，42°C 熱激90s，立即放置冰上2-3min，向離屯、管中加入LB液體培養(yǎng)基89化1;將離屯、管放于37°C搖 床上震動培養(yǎng)化后，取300μ1培養(yǎng)液涂布于含有l(wèi)OOmmol/L氨節(jié)青霉素、Immol/L IPTG和 lOmg/L的固體LB培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)14-16h。之后選擇白色的菌斑送擎科公司測序，即獲得 含有插入序列的克隆命名為T-UTR。
[001引有益效果
[0016] 本發(fā)明的序列，可提高外源基因在植物體內(nèi)的表達水平。利用分子生物學實驗技 術(shù)將獲得序列連到外源基因編碼區(qū)起始密碼子的上游，W融合片段作為一個整體進行常規(guī) 的植物表達載體構(gòu)建后進行外源基因在植物體內(nèi)的表達，即可提高外源基因在植物體內(nèi)的 表達水平。
【附圖說明】
[0017] 圖1:本發(fā)明序列連接到目的基因編碼區(qū)上游的載體示意圖。
[0018] 圖2:本發(fā)明序列連接到GFP的起始密碼子的上游后提高GFP在煙草葉片內(nèi)的表達 水平結(jié)果圖。
[0019]圖3:本發(fā)明序列連接到RSV-CP蛋白的起始密碼子的上游后提高RSV-CP在煙草葉 片內(nèi)的表達水平結(jié)果圖。
【具體實施方式】
[0020]現(xiàn)結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步的詳細說明，本發(fā)明的實施方式是為了具體闡述 本發(fā)明的精髓如何實現(xiàn)而采用有限的舉例來說明，而不是對本發(fā)明做出任何的限定。 陶]實施例1:應用本發(fā)明提高GFP在植物體內(nèi)的表達水平
[0022] 1.序列的克隆
[0023] 化izol法抽提感染水稻條紋病毒的水稻樣品的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA;W此為模 板，用P1 (ACACAAAGTCTGGGTAATA) (SEQ NO. 1)和P2 (TGTAGCAAGAGGTACTGGA)(沈Q NO. 2)引物 進行PCR反應。擴增體系如下：10XEX Taq buffer 5μ1，2.5πιΜ dNTPs 扣Ι,ΙΟμΜ P1 和P2各2 μ1，EX Taq酶巧υ/μ1 )化1 (購自大連化kara公司），無菌水補足50μ1。反應條件為94°C預變性 3min;94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸30s，35個循環(huán);72°C延伸lOmin。目的PCR產(chǎn)物大 小為92bp(序列女日下：acacaaagtc tgggtaataa aattttcgat tttgctttta cattccaaat ttcatctaag ccgcaaccat tcctccag1:a cctcttgcta ca)(沈Q N0.10)，PCR產(chǎn)物經(jīng)Qiagen凝 膠純化試劑盒（德國Qiagen公司）純化后，利用PromegapGEM'';|-T EASY Vector(美國 Promega公司）進行PCR片段的ΤΑ克隆，條件如下：2XP;romega ligase buffer 扣l，p.GEM@ -τ EASY Vectorlyl，PCR回收片段化l，Promega T4-ligase 化 1(美國Promega公司），無菌 水化1，混勻后4°C反應16h。反應完畢后，取10μ1反應液加入到含有10化1大腸桿菌感受態(tài)細 胞的離屯、管中，輕輕混勻冰上放置30min后，42°C熱激90s，立即放置冰上2-3min，向離屯、管 中加入LB液體培養(yǎng)基89化1。將離屯、管放于37°C搖床上震動培養(yǎng)化后，取30化1培養(yǎng)液涂布 于含有l(wèi)OOmmol/L氨節(jié)青霉素、Immol/L IPTG和lOmg/L的固體LB培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)14- 16h。之后選擇白色的菌斑送擎科公司測序。含有插入序列的克隆命名為T-UTR。
[0024] 2.序列與GFP的融合
[0025] 為了分析本發(fā)明序列促進基因表達的功能，利用常用的標記基因綠色巧光蛋白 (Green fluorescence protein,GFP)基因作為目的基因開展驗證工作。
[0026] 根據(jù)UTR測定的序列，設計引物P3 (TCTAGAACACAAAGTCTGGGTAATA，下劃線為Xba I 識別位點）（沈Q N0.3)和P4(CCTCGCCCTTGCTCACCATTGTAGCAAGAGGTACTGGA)(沈Q N0.4)，W T-UTR載體為模板進行PCR反應。擴增體系如下：10XEx Taq buffer 5μ1，2.5πιΜ dNTPs扣 1，ΙΟμΜ P3和P4各化1，Ex Taq酶（抓/μ1 ΗμL (購自大連化kara公司），無菌水補足5化1。反應 條件為94°C預變性3min;94°C變性3〇8,55°(：退火3〇3,72°(：延伸3〇3,35個循環(huán)；72°(：延伸 lOmin。目的PCR產(chǎn)物大小約100bp，PCR產(chǎn)物(產(chǎn)物1)經(jīng)Qiagen凝膠純化試劑盒(德國Qiagen 公司）純化。根據(jù)祀GFP-N1中的EGFP序列(GFP的序列（SEQ NO. 11))和本發(fā)明序列設計引物 P5
[0027] (TCCAGTACCTCTTGCTACAATGGTGAGCAAGGGCGAGG)(SEQ NO.5)和P6(GAGCTCCTACTT GTACAGCTCGTCCA，下劃線為Sac I識別位點）（沈Q N0.6)，W祀GFP-N1質(zhì)粒為模板擴增GFP序 列。擴增體系如下：l〇XEx Taq buffer 化l，2.5mM dNTPs 扣Ι,ΙΟμΜ P5和P6各化l，Ex Taq 酶巧υ/μ1) 1μ1 (購自大連Takara公司），無菌水補足50μ1。反應條件為94°C預變性3min; 94°C 變性3〇8,55°(：退火3〇3,72°(：延伸3〇3,35個循環(huán)；72°(：延伸1〇111111。目的？〔1?產(chǎn)物大小約 750bp，PCR產(chǎn)物(產(chǎn)物2)經(jīng)Qiagen凝膠純化試劑盒(德國Qiagen公司）純化。將產(chǎn)物1和產(chǎn)物2 稀釋100倍后混合，W此為模板，用P3和P6為引物進行PCR反應。擴增體系如下：10 XEx化q buffer 5μ1，2.5πιΜ dNTPs 扣Ι,ΙΟμΜ P3和P6各化l，Ex Taq酶（5υ/μ1)1μ1 (大連Takara公 司），無菌水補足50μ1。反應條件為94°C預變性3min;94°C變性30s，55°C退火Imin，72°C延伸 3〇8,35個循環(huán)；72°(：延伸1〇111111。？〔1?產(chǎn)物經(jīng)扣日肖611凝膠純化試劑盒純化后，利用？'〇1116邑曰 .pGEM'@-T EASY Vector(美國Promega公司）進行PCR片段的ΤΑ克隆，條件如下：2XP;romega ligase buffer 扣l，.pGEM.@-T EASY VectorlyliPCR回收片段化LPromega T4_ligase 1 μ1 (美國Promega公司），無菌水化1，混勻后4°C反應16h。反應完畢后，取10μ1反應液加入到 含有10化1大腸桿菌感受態(tài)細胞的離屯、管中，輕輕混勻冰上放置30min后，42°C熱激90s，立 即放置冰上2-3min，向離屯、管中加入LB液體培養(yǎng)基89化1。將離屯、管放于37°C搖床上震動培 養(yǎng)化后，取300μ1培養(yǎng)液涂布于含有l(wèi)OOmmol/L氨節(jié)青霉素、Immol/L IPTG和lOmg/L的固體 LB培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)14-1化。之后選擇白色的菌斑送擎科公司測序。測序正確的克隆命名 為T-UTR-GFP((具體部分結(jié)構(gòu)件圖1上部）。
[002引 3.融合GFP在植物體內(nèi)的表達
[0029]為明確本發(fā)明序列的功能特點，利用常用的本氏煙葉片瞬時表達系統(tǒng)分析其促進 基因在植物體內(nèi)表達的作用。將T-UTR-GFP中的融合片段經(jīng)Xba I和Sac I酶切后連入同樣 酶切的pCVl300中，構(gòu)建pCV-UTR-GFP載體(構(gòu)建載體示意圖見圖1的上部）；同時，利用同樣 的方法構(gòu)建只含有GFP序列、不含有本發(fā)明核巧酸序列的pCV-GFP載體，作為對照（圖1的下 部的結(jié)構(gòu)不含有本發(fā)明的序列基因）。將兩個載體分別轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105后，應用瞬時表達 系統(tǒng)注射本氏煙草葉片。3天后觀測煙草葉片GFP巧光變化，并通過western blot檢測GFP表 達情況，結(jié)果如圖2所示:在表達pCV-UTR-GFP的區(qū)域，GFP巧光明顯較強（圖2a和b的右邊部 分），而在表達pCV-GFP的區(qū)域，GFP巧光相對較弱（圖2a和b的右邊部分）eWestern blot的結(jié) 果也表明，pCV-UTR-GFP區(qū)域的GFP表達水平大幅度增加，其GFP表達量為pCV-GFP區(qū)域的3-5 倍(圖2.b)。
[0030] 實施例2:應用本發(fā)明提高RSY CP在植物體內(nèi)的表達水平
[0031] 為進一步驗證本發(fā)明序列的促表達作用，用另外一個編碼蛋白RSV CP做了同樣的 驗證。
[00創(chuàng) 1.序列的克隆
[0033] 序列按實施1方法獲得。
[0034] 2.序列與RSV-CP的融合
[0035] 根據(jù)UTR測得的序列，設計引物P3 (TCTAGAACACAAAGTCTGGGTAATA，下劃線為Xba I 識別位點）和？7(了66(：刊61766了6〔〇：4刊0了46〔446466了4圳66)(沈0^.7)，^1'-1]了1?載體為 模板進行PCR反應。擴增體系如下：10XEx Taq buffer 5μ1，2.5πιΜ dNTPs扣Ι,ΙΟμΜ P3和 Ρ4各化1，Ex Taq酶（5υ/μ1) 1μ1 (購自大連Takara公司），無菌水補足50μ1。反應條件為94°C 預變性3111111;94°(：變性3〇3,55°(：退火3〇3,72°(：延伸3〇3,35個循環(huán);72°(：延伸1〇111111。目的口0? 產(chǎn)物大小約10化P，PCR產(chǎn)物(產(chǎn)物1)經(jīng)Qiagen凝膠純化試劑盒(德國Qiagen公司）純化。根據(jù) RSV-CP序列（RSV-CP的序列（SEQ N0.12))和本發(fā)明序列設計引物P8 (CCAGTACCTCTTGCTACAATGGGCACCAACAAGCCA)(SEQ NO.8)和P9(GAGCTCTTAATGTGAG ACATTTGG，下劃線為Sac I識別位點）（SEQ NO. 9)。TriZO1法抽提感染RSV的水稻樣品的總 RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，W此cDNA為模板擴增CP N端多膚序列。擴增體系如下：10XEx Taq buffer 5μ1，2.5πιΜ dNTPs 扣Ι,ΙΟμΜ P8和P9各化l，Ex Taq酶巧υ/μ1)1μ1 (購自大連Takara 公司），無菌水補足50μ1。反應條件為94°C預變性3min;94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延 伸303,35個循環(huán);72°(：延伸10111111。目的？〇?產(chǎn)物大小約75069，？〇?產(chǎn)物(產(chǎn)物2)經(jīng)化日旨611凝 膠純化試劑盒(德國Qiagen公司）純化。將產(chǎn)物1和產(chǎn)物2稀釋100倍后混合，W此為模板，用 P3和P9為引物進行PCR反應。擴增體系如下：10XEx Taq buffer 5μ1，2.5πιΜ dNTPs扣1，10 μΜ P3和P9各化l，Ex Taq酶(5υ/μ1)1μ1 (大連Takara公司），無菌水補足50μ1。反應條件為94 °C 預變性 3min;94°C 變性 3〇8,55°(：退火1111111，72°(：延伸3〇3,35個循環(huán);72°(：延伸1〇111111?？?? 產(chǎn)物經(jīng)Qiagen凝膠純化試劑盒純化后，利用P;romegapG：EM?-T EASY Vector(美國Promega 公司）進行PCR片段的ΤΑ克隆，條件如下JXPromega ligase buffer扣l，pGE.M@-T EASY Vector lyl，PCR回收片段化LPromega T4-ligase化1(美國Promega公司），無菌水化1，混 勻后4°C反應16h。反應完畢后，取10μ1反應液加入到含有10化1大腸桿菌感受態(tài)細胞的離屯、 管中，輕輕混勻冰上放置30min后，42°C熱激90s，立即放置冰上2-3min，向離屯、管中加入LB 液體培養(yǎng)基89化1。將離屯、管放于37°C搖床上震動培養(yǎng)化后，取300μ1培養(yǎng)液涂布于含有 lOOmmol/L氨節(jié)青霉素、Immol/LIPTG和lOmg/L的固體LB培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)14-1化。之后選 擇白色的菌斑送擎科公司測序。測序正確的克隆命名為T-UTR-CPN。
[0036] 3.融合RSV-CP在植物體內(nèi)的表達
[0037] 將T-UTR-CPN中的融合片段經(jīng)Xba I和Sac I酶切后連入同樣酶切的PCV1300中，構(gòu) 建pCV-UTR-CPN載體；同時，利用同樣的方法構(gòu)建只含有CPN序列、不含有本發(fā)明核巧酸序列 的pCV-CPN載體。將兩個載體分別轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105后，應用瞬時表達系統(tǒng)注射本氏煙草葉 片。Western blot檢測浸潤3天后CP N端表達情況。結(jié)果表明：pCV-UTR-CPN區(qū)域的CP N端多 膚的表達水平大幅度增加，其表達量為pCV-CPN區(qū)域的3-5倍(圖3)。
[0038] W上兩個目的基因只是典型的舉例來說明本發(fā)明的序列可W顯著提高目的基因 在植物中的表達，當然，本領域的一般技術(shù)人員應當了解，其它的目的基因同樣可W獲得本 發(fā)明的預期的效果。實際上，本發(fā)明的發(fā)明人也通過實驗驗證了一些目的基因的表達，發(fā)現(xiàn) 都可W顯著提高一些目的基因在植物上的表達，具體數(shù)據(jù)略。
【主權(quán)項】
1. 一種質(zhì)粒載體，其中，在該質(zhì)粒載體的基因編碼區(qū)的上游包括一段核苷酸序列，該核 苷酸序列能夠提高外源基因在植物體內(nèi)的表達水平；其中，所述的核苷酸序列為： acacaaagtc tgggtaataa aattttcgat tttgctttta cattccaaat ttcatctaag ccgcaaccat tcctccagta cctcttgcta ca所亦的序列。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的載體，其中，該核苷酸序列被連接到外源基因編碼區(qū)起始密碼 子的上游。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的載體，其中，該核苷酸序列從水稻條紋病毒中被克隆出來。4. 一種核苷酸序列在制備提高外源基因在植物體內(nèi)表達水平試劑中的用途，其中該基 因序列被插入到質(zhì)粒載體中的基因編碼區(qū)的上游;其中，所述的核苷酸序列為:acacaaagtc tgggtaataa aattttcgat tttgctttta cattccaaat ttcatctaag ccgcaaccat tcctccagta cctcttgcta ca所示的序列。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的用途，其中，該核苷酸序列被連接到外源基因編碼區(qū)起始密碼 子的上游。6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的用途，其中，該核苷酸序列從水稻條紋病毒中被克隆出來。7. -種核苷酸序列在制備提高外源基因在植物體內(nèi)表達水平中的用途，其中，所述的 核苷酸序列為 :acacaaagtc tgggtaataa aattttcgat tttgctttta cattccaaat ttcatctaag ccgcaaccat tcctccagta cctcttgcta ca所亦的序列。8. 據(jù)權(quán)利要求7所述的用途，其中，該核苷酸序列從水稻條紋病毒中被克隆出來。
【文檔編號】A01H5/00GK106011168SQ201610445529
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年6月18日
【發(fā)明人】燕飛, 韓科雷, 鄭紅英, 魯宇文, 彭杰軍, 林林, 趙晉平, 程曄, 陳劍平
【申請人】浙江省農(nóng)業(yè)科學院