水稻根系發(fā)育和葉色形成的控制基因OsERV1及編碼的蛋白質(zhì)的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了水稻根系發(fā)育和葉色形成的控制基因OsERV1及編碼的蛋白質(zhì)，該控制基因OsERV1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；我們研究表明OsERV1具有控制水稻根系發(fā)育，與側(cè)根伸長、不定根數(shù)目及根系伸長有關(guān)，OsERV1具有控制水稻葉色形成，與葉片中葉綠素含量有關(guān)，可以為水稻的根系及葉色改良和雜交育種或轉(zhuǎn)基因植物的開發(fā)創(chuàng)造條件。
【專利說明】
水稻根系發(fā)育和葉色形成的控制基因OsERVI及編碼的蛋白質(zhì)
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及水稻根系發(fā)育和葉色形成相關(guān)的控制基因，具體涉及水稻根系發(fā)育和葉色形成的控制基因OsERVl及編碼的蛋白質(zhì)。
【背景技術(shù)】
[0002]水稻根系為須根系，一般由胚根、不定根和側(cè)根組成，由于其龐大的側(cè)根，極大的增加了水稻從外界吸收水分和礦物質(zhì)的能力。調(diào)控水稻側(cè)根的基因如授權(quán)公告號為CN102268081的發(fā)明專利，該專利就公開了水稻側(cè)根的控制基因OsIAAII及編碼的蛋白質(zhì)，可培育出側(cè)根控制功能較好的轉(zhuǎn)基因水稻。申請?zhí)枮镃N2013103726010的發(fā)明則公開了水稻側(cè)根發(fā)生控制基因OsHKl的突變體，也可選育出控制側(cè)根發(fā)生和生長的轉(zhuǎn)基因水稻。
[0003]葉片是植物進行光合作用和呼吸作用的主要器官。植物葉綠素的生物合成循環(huán)途徑已經(jīng)研究得非常清楚，整個過程需經(jīng)19步、18個酶和對應(yīng)的29個基因參與，相關(guān)的基因均已被克隆，葉綠素合成的調(diào)控和降解也取得了較大進展。根據(jù)葉綠素合成、調(diào)控和降解途徑，以及外界溫度、光等環(huán)境因子的綜合影響，目前發(fā)現(xiàn)水稻的葉綠素、類胡蘿卜素、血紅素合成與降解過程相所涉及到的基因的突變，會導(dǎo)致葉色發(fā)生變化。如公告號為CN103114076的發(fā)明，就公開了水稻葉色控制基因H02，該基因使水稻具有適合的葉色，能提高光合作用。另外如水稻葉色控制基因LYLl的突變可使水稻葉色由綠轉(zhuǎn)黃。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種水稻根系發(fā)育和葉色形成的控制基因OsERVl及編碼的蛋白質(zhì)，我們研究表明OsERVl具有控制水稻根系發(fā)育，與側(cè)根伸長、不定根數(shù)目及根系伸長有關(guān)，O W K 2具有控制水稻葉色形成，與葉片中葉綠素含量有關(guān)。
[0005]本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為:水稻根系發(fā)育和葉色形成的控制基因OsERVl，該控制基因OsERVl的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其序列由3152個堿基組成，包含6個外顯子和5個內(nèi)含子，⑶S全長為585bp。
[0006]水稻根系發(fā)育和葉色形成的控制基因OsERVl所編碼的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)的氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示，是一個巰基氧化酶，表現(xiàn)為與水稻根系發(fā)育和葉色形成有關(guān)。
[0007]如基因OsERVl起始密碼子ATG后第20個堿基發(fā)生突變，從鳥嘌呤(G)突變成腺嘌呤(A)，形成終止密碼子TAG，導(dǎo)致該基因翻譯提前終止，這樣所編碼的蛋白就抑制根系發(fā)育與葉色形成，具體在植株表現(xiàn)為側(cè)根突破表皮后，伸長受抑制，不定根數(shù)目減少且伸長受抑制，葉綠素降低至正常的三成左右，葉色變淡。
[0008]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于水稻根系發(fā)育和葉色形成的控制基因OsERVl及編碼的蛋白質(zhì)，該控制基因OsERVl的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示;我們研究表明OsERVl具有控制水稻根系發(fā)育，與側(cè)根伸長、不定根數(shù)目及根系伸長有關(guān)，O si? W V I具有控制水稻葉色形成，與葉片中葉綠素含量有關(guān)，可以為水稻的根系及葉色改良和雜交育種或轉(zhuǎn)基因植物的開發(fā)創(chuàng)造條件。
【附圖說明】
[0009]圖1是正常型秈稻(WT)和OsERVl突變體秈稻(起始密碼子ATG后第20個堿基為A，Oservl)正常水培7天的水稻根系表型比較圖，a為野生型和突變體全株系比較，b、c為WT水稻根莖結(jié)合部和側(cè)根局部放大圖，d、e為Oservl突變體水稻根莖結(jié)合部和側(cè)根放大圖。
【具體實施方式】
[0010]
以下結(jié)合附圖實施例對本發(fā)明作進一步詳細描述。
[0011]實施例1
我們選取正常型秈稻(WT，0ryza Sativa L.ssp indica)品種和該秈稻經(jīng)甲基磺酸乙酯誘變的秈稻中篩選到的OsERVl突變的水稻突變體Oservl，其中WT中控制基因OsERVl的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其所編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。Oservl中控制基因OsERVl的核苷酸序列在起始密碼子ATG后第20個堿基發(fā)生突變，從鳥嘌呤(G)突變成腺嘌呤(A)，經(jīng)培育得到種子。
[0012]實施例2
將上述選取的WT種子和Oservl種子發(fā)芽后漂浮于水稻培養(yǎng)液的尼龍網(wǎng)紗上同時培育7天，觀察它們的根系和葉片，它們的根系比較如圖1所示，從中可以看出WT的根系要比Oservl的根系發(fā)達，且側(cè)根和不定根的長度也要長得多，說明基因OsERVl與根系發(fā)育有關(guān)。而它們的葉片同樣明顯，WT的葉片要比Oservl的葉片綠得多，0servl的葉片明顯缺綠。
[0013]實施例3
水稻突變體O serW的基因定位和序列分析:以突變體Oser VI為父本，與野生型Kasalath雜交，獲得子一代Fi植株與野生型Kasalath完全一致，說明Oservl為隱性突變;Fi代自花授粉所得的F2*，正常植株與短根植株的分離比為152/48=3.17，正常植株與突變植株的比例符合一對基因控制的3:1分離比，表明該突變體是隱性單基因突變體。從突變體OsERVl后代F2中分離出突變個體，利用基因圖位克隆法(Map-based Cloning)對F2突變基因進行定位，初定位(30個？2突變個體)，將突變基因定位在第3條染色體SSR標記為RM6038和RM1022之間，之后，擴大定位群體，并在該區(qū)間內(nèi)發(fā)展了5對有多態(tài)的新的STS分子標記，分別命名為STSl，STS2，STS3，STS4，STS5和序列如下:
STS1U-5， AGGATTGAGAAATGAATCAA 3，
STS1L-5’ GCATAATATGTAGGGCACC 3’
STS2U-5’ CCTTCCTTTTGGCATCCCAG 3’
STS2L-5’ CACAAGCTGCCTGTTGATTG 3’
STS3U-5’ CAGGTGTCGTCTCCGTCATC 3’
STS3L-5’ TACTGAACCGCAGAAGTTAC 3’
STS4U-5’ CAGTGAGCCCATTGGAAGAG 3’
STS4L-5’ GCTTATTGTACCATGAATGC 3’
STS5U-5’ TACTAAACAGTCTCATATAC 3’
STS5L-5， AAGTATAAATGAAGCACAC 3， 最終將基因鎖定在STS標記為STS3和STS4(第3染色體上具體物理位置分別為5，544，833 bp和5，680，643bp)之間，重組子分別為1/500和1/500，且重組的號碼不同。該區(qū)間有135.8kb 大小。根據(jù) TIGR(http://www.tigr.0rg/tdb/e2kl/osal/)的水稻基因注釋信息，對定位的染色體區(qū)段內(nèi)基因預(yù)測分析，該區(qū)間共有22個預(yù)測的基因，用Kasalath野生型和Oservl突變體DNA模板對候選的其中15個有功能注釋的基因進行擴增，擴增產(chǎn)物分別測序，測序結(jié)果進行比對分析，發(fā)現(xiàn)基因號為L0C_0s03gl0850(巰基氧化酶)基因的起始密碼子ATG后第20個堿基發(fā)生突變，從G突變成A，形成終止密碼子TAG，導(dǎo)致該基因翻譯提前終止，命名該基因為OsERVl。
[0014]實施例4
根據(jù)OsERVl基因的CDS序列信息，設(shè)計擴增完整CDS的引物，引物序列如下(加下劃線的為酶切位點):
上游引物:AAAGGTACCATGCCGCCTCCAGCGTGG
下游引物:AAAGGATCCTCATCTATTTGGGATGATGTCGTT
采用上海生工RNA提取試劑盒(SK1321)提取水稻kasalash葉片總RNA，以01igo(dt)-18為引物，以所提取的總RNA為模板進行反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA。以此cDNA為模板，利用PrimeSTAR HS DNA Polymerase擴增全長0RF，PCR條件:98°C預(yù)變性10s，然后進入循環(huán)反應(yīng)(980C 1s,580C 108，72°(:，308)，循環(huán)數(shù)為30，最后再延伸51^11結(jié)束。瓊脂糖電泳割膠回收PCR產(chǎn)物，連A尾純化并連接到pMD19-T載體。連接產(chǎn)物熱擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞，37°C培養(yǎng)16h后挑陽性單克隆測序，測序鑒定序列無誤后用KpnI和BamHI在37°C雙酶切過夜，連入經(jīng)同樣雙酶切的PCAMBIA1300改(35S)載體中，命名為35S-0sERVl-0VER。連接產(chǎn)物以相同的方法熱擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)，涂布在含有kan抗性的LB平板培養(yǎng)16h后挑取單克隆，搖菌抽提質(zhì)粒雙酶切并通過瓊脂糖膠檢測正確后電擊轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105。酶切檢測正確的質(zhì)粒通過農(nóng)桿菌株系EHA105介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化體系導(dǎo)入到突變體Oservl中，經(jīng)過侵染、共培養(yǎng)、篩選具有潮霉素抗性的愈傷、分化、生根、練苗移栽，得到轉(zhuǎn)基因植株。農(nóng)桿菌(EHA105)介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化體系主要應(yīng)用Hiei等人(1994)報道的方法基礎(chǔ)上進行優(yōu)化。該轉(zhuǎn)基因植株中分離的Oservl突變體的根系長度回復(fù)成野生型，說明Oservl的表型確實是有OsERVl突變引起的。為了檢測表型回復(fù)的轉(zhuǎn)基因陽性植株是否超表達了OsERVl基因，采用Trizol法分別提取Kasalath、Oservl和2個轉(zhuǎn)基因回復(fù)株系葉片的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。半定量反應(yīng)時，各樣品的cDNA模板量先通過OsActin基因的表達量調(diào)成一致(擴增條件:56 °C，28個循環(huán))，再擴增目的基因的上游引物序列(5 ’ -3 ’)為:ACACCATCGCAGCGCAGTT ；下游引物序列(5 ’ -3 ’)為:ATTCGGGATGATGTCGTTGGA。PCR反應(yīng)條件為:94 °C預(yù)變性4min，然后進入循環(huán)反應(yīng)即94°C，30s ; 56°C，30s; 72°C，30s，28個循環(huán)。最后再延伸5min結(jié)束。轉(zhuǎn)基因回復(fù)驗證結(jié)果= Kasalath和2個轉(zhuǎn)基因回復(fù)株系葉色、不定根數(shù)、不定根長與側(cè)根相當，確認突變性狀是由O sfT? K 2基因的突變所引起。半定量RT-PCR結(jié)果:Kasalath和2個轉(zhuǎn)基因回復(fù)株系葉片的葉綠素含量基本相當，Oservl葉片的葉綠素含量約只有3成左右。
【主權(quán)項】
1.水稻根系發(fā)育和葉色形成的控制基因OsERVl，其特征在于該控制基因OsERVl的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。2.權(quán)利要求1所述的水稻根系發(fā)育和葉色形成的控制基因OsERVl編碼的蛋白質(zhì)，其特征在于該蛋白質(zhì)的氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。
【文檔編號】C12N9/02GK106011156SQ201610533402
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年7月6日
【發(fā)明人】朱世華, 丁沃娜, 鄭文娟, 項顯波
【申請人】寧波大學(xué)