攜帶tPA信號(hào)肽及密碼子優(yōu)化的SFTSV糖蛋白Gn基因序列及其核酸疫苗的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及攜帶tPA信號(hào)肽及密碼子優(yōu)化的SFTSV糖蛋白Gn基因序列及其核酸疫苗。所涉及的嚴(yán)重發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒糖蛋白Gn核酸疫苗由密碼子優(yōu)化的嚴(yán)重發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒糖蛋白Gn基因序列和真核表達(dá)載體pJW4303組成，其5’端連接tPA信號(hào)肽序列。相對(duì)于野生型狀態(tài)下的核酸疫苗，該核酸疫苗在體外表達(dá)中可更高效地表達(dá)目的蛋白且可將目的蛋白有效地分泌到胞外，在免疫哺乳動(dòng)物后可有效地刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生較好的體液免疫應(yīng)答。
【專利說明】
攜帶tPA信號(hào)化及密碼子優(yōu)化的SFTSV糖蛋白Gn基因序列及其 核酸疫苗
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，設(shè)及攜帶巧A信號(hào)膚及密碼子優(yōu)化的嚴(yán)重發(fā)熱伴 血小板減少綜合征病毒氨基端糖蛋白Gn基因序列及其核酸疫苗。
【背景技術(shù)】
[0002] 嚴(yán)重發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒（severe fever with th;romboc5ftopenia 3711化加1日￥；[1'113,5。了5\0是我國(guó)學(xué)者在2010年首次發(fā)現(xiàn)并鑒定的一種新型病毒。發(fā)熱伴血 小板減少綜合征(SFTS)是由SFTSV感染引起的一種W發(fā)熱、血小板減少、白細(xì)胞減少為主要 特征的新發(fā)傳染病，病情嚴(yán)重者可出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)損傷、隧血細(xì)胞現(xiàn)象、多器官功能衰竭等， 病死率可達(dá)12%-16.3%，甚至有報(bào)道為30%。
[0003] SFTSV屬于布尼亞病毒科白略病毒屬。基因組序列分析顯示，其基因組為單股負(fù)鏈 RNA，由大片段L、中片段Μ和小片段SS個(gè)片段構(gòu)成，分別編碼RNA依賴的RNA聚合酶(RdRp)， 氨基端糖蛋白（Gn)和簇基端糖蛋白（Gc)，核蛋白（NP)和非結(jié)構(gòu)蛋白（NSs)。作為一種新發(fā)現(xiàn) 的病毒，其基因組編碼的各種蛋白尤其是Gn的生物學(xué)特性、在疾病發(fā)生發(fā)展過程中的作用、 W及免疫學(xué)特點(diǎn)還知之甚少；同時(shí)，從流行病學(xué)及臨床診療過程的需求來看，亟需開發(fā)SFTS 相關(guān)的預(yù)防用疫苗、診斷用抗體及治療性抗體。
[0004] 核酸疫苗，又稱DNA疫苗，其作用機(jī)制主要有W下Ξ種:DNA編碼的抗原通過體細(xì)胞 經(jīng)MHC I類途徑遞呈給CD8巧細(xì)胞;DNA免疫直接轉(zhuǎn)染專職的抗原遞呈細(xì)胞(如樹突狀細(xì)胞） 經(jīng)MHC 1/ Π 類途徑將抗原遞呈給CTL、CD4巧細(xì)胞，并激活B細(xì)胞應(yīng)答;被轉(zhuǎn)染的體細(xì)胞被抗 原遞呈細(xì)胞吞隧后，發(fā)生交叉激活，將抗原遞呈給T細(xì)胞。它具有如下優(yōu)點(diǎn)：能夠充分模擬自 然感染狀態(tài)，在動(dòng)物體內(nèi)合成具有相應(yīng)空間構(gòu)象的蛋白，不僅可W激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生體液免疫 反應(yīng)還能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性的細(xì)胞免疫反應(yīng);和重組蛋白免疫相比，核酸疫苗可在DNA水平 對(duì)密碼子進(jìn)行優(yōu)化、修飾，能更好的保證抗原蛋白的純度，而且成本低廉，穩(wěn)定性好，同時(shí)可 W避免蛋白免疫原半衰期短的缺陷而建立更有效的長(zhǎng)期免疫應(yīng)答;基因免疫通過擴(kuò)增的基 因序列來編碼蛋白抗原，能夠避免直接接觸危險(xiǎn)性較高的病原體。
[0005] 但核酸疫苗也存在著諸多缺點(diǎn)，其中最主要的是核酸疫苗研究和應(yīng)用的對(duì)象主要 為真核生物，而目的基因絕大多數(shù)來自于病毒或細(xì)菌等原核生物，而原核生物與真核生物 在密碼子使用偏好上存在明顯差異，運(yùn)就導(dǎo)致了核酸疫苗的外源基因在真核細(xì)胞內(nèi)不能高 效地表達(dá)，不能有效地刺激機(jī)體的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生應(yīng)答。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于克服上述缺陷，提供一種密碼子優(yōu)化的SFTSV糖蛋白Gn基因序 列。
[0007] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種攜帶tPA信號(hào)膚并進(jìn)行密碼子優(yōu)化的SFTSV Gn的 核酸疫苗。
[000引本發(fā)明的目的通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0009] 一種含有野生型信號(hào)膚(WSP)的SFTSV糖蛋白Gn的原始基因序列，序列為SEQ ID N0.1。
[0010] 一種密碼子優(yōu)化的SFTSV糖蛋白Gn的基因序列，序列為SEQ ID NO.2。
[00川一種SFTSV糖蛋白Gn的核酸疫苗，由序列為SEQ ID NO. 1的SFTSV Gn的基因序列插 入到真核表達(dá)載體化nd虹和BamH I酶切位點(diǎn)之間所得。
[0012] 一種SFTSV糖蛋白Gn的核酸疫苗，由序列為SEQ ID NO.2的SFTSV Gn基因序列插入 到真核表達(dá)載體化e I和BamH I酶切位點(diǎn)之間所得，其5'端連接tPA信號(hào)膚序列。
[0013] 所述的真核表達(dá)載體為PJW4303。
[0014] 本發(fā)明提供的基因修飾的SFTSV糖蛋白Gn基因序列及其核酸疫苗的構(gòu)建步驟如 下：
[001引（1)含WSP信號(hào)膚的SFTSV Gn原始序列基因片段的獲得
[0016] WSFTSV皿29株為參考序列（GenBank:HM745931.1)，選取含WSP信號(hào)膚的糖蛋白 Gn編碼基因（即優(yōu)化前的原始序列SEQ ID NO.1)，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成并 裝入載體pUC57，即pUC57-WSP-Gn。設(shè)計(jì)引物WSP-Gn-F: CCCAAGCTTATGATGAAAGTCATCTGG(沈Q ID NO.3) ；WSP-Gn-R：GAGCTCGGATCCC TAT TACTCAATCCTAACATCATC(SEQ ID 側(cè).4)。通過口0? 擴(kuò)增，分別引入化nd虹和Ba恤I酶切位點(diǎn)。擴(kuò)增產(chǎn)物用化nd虹和BamH I雙酶切，并用DNA凝 膠回收試劑盒（Omega Agarose Gel DNA化rification Kit,美國(guó)Omega公司）回收純化目 的片段，該片段為含有WSP信號(hào)膚的原始序列的SFTSV糖蛋白Gn基因序列，兩端分別連接有 Hind虹和BamH I酶切位點(diǎn)，W便于核酸疫苗pJW4303-WSP-Gn的構(gòu)建。
[0017] (2)密碼子優(yōu)化的SFTSV糖蛋白Gn基因序列的設(shè)計(jì)和合成
[0018] WSFTSV皿29株為參考序列（GenBank:HM745931.1)，首先選取含WSP信號(hào)膚基因 的SFTSV Gn基因，全長(zhǎng)1605bp，然后運(yùn)用軟件化timumGene?分析其基因序列，找出其密碼子 使用偏好同時(shí)找出與哺乳動(dòng)物密碼子使用偏好不同的密碼子位點(diǎn)，用哺乳動(dòng)物偏好的密碼 子替代SFTSV糖蛋白Gn基因中使用偏好不同的密碼子，然后設(shè)計(jì)出密碼子優(yōu)化的SFTSV Gn 基因序列，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成并裝入載體pTC57,即pU巧7-WSP-Gn-opt。 密碼子優(yōu)化的基因序列所編碼的蛋白質(zhì)氨基酸序列與原有的氨基酸序列保持一致。密碼子 優(yōu)化后的SFTSV Gn基因序列為沈Q ID NO.2。
[0019] (3)攜帶tPA信號(hào)膚并密碼子優(yōu)化后的SFTSV Gn基因片段的獲得
[0020] 對(duì)南京金斯瑞生物科技有限公司提供的含有目標(biāo)序列的重組載體pU巧7-WSP-Gn- opt，設(shè)計(jì)引物巧A-Gn-opt-F:GTCACTTCGCTAGCGACAGTGGACCTATTATCTGCG(SEQ ID NO.5)； tPA-Gn-〇pt-R:GAGCTCGGATCCCTATTACTCAATCCGCACATCGTCC(WQ ID NO. 6)。通過PCR擴(kuò)增， 在優(yōu)化Gn序列的5 '端和3 '端分別引入酶切位點(diǎn)Nhe巧郵amH I，將Gn-opt基因序列連在質(zhì) 粒PJW4303的巧A信號(hào)膚序列下游。擴(kuò)增產(chǎn)物用Nhe巧郵amH I雙酶切，并用DNA凝膠回收試 劑盒(Omega Agarose Gel DNA化rification Kit,美國(guó)Omega公司）回收純化目的片段，該 片段為優(yōu)化的SFTSV Gn基因序列，兩端分別連接有化e巧郵amH I酶切位點(diǎn)，W便于核酸疫 苗 pJW4303-tPA-Gn-〇pt 的構(gòu)建。
[0021] (4)將步驟（1)得到的基因片段克隆到真核表達(dá)載體PJW4303中，得到重組質(zhì)粒 pJW4303-WSP-Gn。將步驟(3)得到的基因片段克隆到真核表達(dá)載體PJW4303中，得到重組質(zhì) ?？?￥4303-*?4-611-〇9*。經(jīng)對(duì)重組質(zhì)粒抽提、酶切、測(cè)序后，確定得到了與預(yù)期相符的質(zhì)粒， 即為本發(fā)明所述的SFTSV糖蛋白Gn核酸疫苗。
[0022] 本發(fā)明的有益成果：
[0023] SFTSV是一種新發(fā)現(xiàn)的病原體，目前對(duì)其基因組編碼的各種蛋白尤其是Gn的生物 學(xué)特性、在疾病發(fā)生發(fā)展過程中的作用、其抗體是否合適臨床及流行病學(xué)運(yùn)用等都尚不清 楚。此外，由于自然界生物體存在密碼子的偏好性，從病原體來源的SFTSV Gn基因克隆在異 源宿主體內(nèi)難W有效表達(dá)，因此就不能有效的刺激異源宿主的免疫系統(tǒng)，使之產(chǎn)生較好的 免疫保護(hù)作用。為了提高異源基因在哺乳動(dòng)物中的表達(dá)效率，往往需要對(duì)核巧酸編碼序列 進(jìn)行優(yōu)化。由于目前對(duì)核巧酸序列的優(yōu)化尚沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)或原則。因此針對(duì)相同的氨基 酸序列，不同的研究人員完全會(huì)設(shè)計(jì)出不同的核巧酸序列用于目標(biāo)多膚或蛋白的表達(dá)和制 造，相應(yīng)地表達(dá)效率也可能存在差異。發(fā)明人WSFTSV皿29株的SFTSV Gn基因?yàn)榛A(chǔ)，設(shè)計(jì) 了多條密碼子優(yōu)化后的SFTSV Gn序列，并通過實(shí)驗(yàn)篩選出表達(dá)效率最高的一條。同時(shí)，發(fā)明 人將SFTSV Gn原有信號(hào)膚(WSP)置換為tPA。與野生型基因相比，經(jīng)過tPA信號(hào)膚引入及密碼 子優(yōu)化的基因中哺乳動(dòng)物細(xì)胞偏好的密碼子出現(xiàn)頻率增加，但是其編碼的SFTSV Gn氨基酸 序列不變。利用體外基因重組將目的蛋白的基因序列克隆入真核表達(dá)載體PJW4303構(gòu)建了 SFTSV 的核酸疫苗 pJW4303-WSP-Gn、pJW4303-tPA-Gn-〇pt。
[0024] 通過體外轉(zhuǎn)染的方法研究Gn的表達(dá)，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)核酸疫苗pJW4303-WSP-Gn、 pJW4303-tPA-Gn-〇pt均能夠在真核細(xì)胞293T細(xì)胞中表達(dá)，但pJW4303-tPA-Gn-〇pt的目的蛋 白Gn表達(dá)量更高，且僅pJW4303-tPA-Gn-〇pt可W將Gn可W分泌到293T細(xì)胞外。由此可見，相 較于野生型狀態(tài)的pJW4303-WSP-Gn，經(jīng)過我們的基因改造后的pJW4303-tPA-Gn-〇pt更適于 在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的蛋白表達(dá)。
[0025] 通過DNA免疫動(dòng)物的方法研究Gn的體液免疫原性，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)核酸疫苗PJW4303- WSP-Gn、pJW4303-tPA-Gn-〇pt均能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性體液免疫應(yīng)答，但pJW4303-tPA- Gn-opt能更快地誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答且產(chǎn)生的特異性抗體滴度更高。由此可見，相 較于野生型狀態(tài)的pJW4303-WSP-Gn，經(jīng)過我們的基因改造后的pJW4303-tPA-Gn-〇pt核酸疫 苗具有更好的體液免疫原性。
【附圖說明】
[0026] 圖1野生型和密碼子優(yōu)化的SFTSV糖蛋白Gn基因序列的密碼子偏好性比較結(jié)果
[0027] 其中，圖1A和1B分別為密碼子適應(yīng)指數(shù)(CAI)和最優(yōu)密碼子使用頻率，兩圖左側(cè)部 分均為優(yōu)化后的結(jié)果，右側(cè)部分均為未經(jīng)優(yōu)化的野生型結(jié)果，圖1A和1B提示密碼子優(yōu)化后 SFTSV糖蛋白Gn基因序列編碼區(qū)同義密碼子與哺乳動(dòng)物細(xì)胞中密碼子最佳使用的符合程度 及所使用的最優(yōu)密碼子比例明顯提高；圖1C為GC含量的調(diào)整，提示經(jīng)密碼子優(yōu)化后的SFTSV 糖蛋白Gn基因序列中堿基組分未見明顯變化，保證了基因合成過程中均勻的退火溫度，保 證了動(dòng)物體內(nèi)mRNA的表達(dá)水平；圖1D為限制性內(nèi)切酶及順式作用元件的優(yōu)化，提示原本會(huì) 影響質(zhì)粒構(gòu)建的特定基因序列通過密碼子優(yōu)化有效清除；圖化為重復(fù)序列的優(yōu)化，提示密 碼子優(yōu)化后的基因序列不能形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，從而保證了核糖體與核巧酸序列的有效結(jié)合及 mRNA的穩(wěn)定。
[002引圖2目的片段WSP-Gn、tPA-Gn-optPCR擴(kuò)增后雙酶切電泳圖
[0029] A圖：1，化b DNA ladder;2，WSP-Gn經(jīng)Hind虹和BamH I雙酶切產(chǎn)物；3，100bp DNA ladder;
[0030] B圖：l，tPA-Gn-〇pt經(jīng)Nhe 巧PBamH I雙酶切產(chǎn)物；2，100bp DNA ladder;3,化b DM ladder。
[0031] 圖3 pJW4303-WSP-Gn、pJW4303-tPA-Gn-〇pt的酶切電泳圖
[0032] A圖：l，化bDNAladder;2，pJW4303-WSP-Gn經(jīng)Hind虹和BamHI雙酶切產(chǎn)物；
[0033] B圖：1，化b DM ladder;2，pJW4303-tPA-Gn-〇pt經(jīng)Mie I和BamH I雙酶切產(chǎn)物。
[0034] 圖4 pJW4303、pJW4303-WSP-Gn、pJW4303-tPA-Gn-〇pt轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后目的蛋白Gn 表達(dá)的Western Blot結(jié)果
[OO%] 1，PJW4303轉(zhuǎn)染 293T 細(xì)胞上清；2，pJW4303 轉(zhuǎn)染 293T 細(xì)胞裂解液；3，pJW4303-WSP- Gn 轉(zhuǎn)染 293T 細(xì)胞上清；4，P JW4303-WSP-Gn 轉(zhuǎn)染 293T 細(xì)胞裂解液；5，P JW4303-tPA-Gn-〇pt 轉(zhuǎn) 染293T細(xì)胞上清；，6，pJW4303-tPA-Gn-〇pt轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞裂解液。一抗為1:300稀釋的 P JW4303-tPA-Gn-〇pt 免疫 BALB/c 小鼠血清。
[0036] 圖 5 PJW4303、PJW4303-WSP-Gn、PJW4303-tPA-Gn-〇pt免疫BALB/c小鼠后血清中特 異性IgG應(yīng)答時(shí)間曲線
[0037] PJW4303表示空載體PJW4303免疫BALB/c小鼠后的特異性IgG抗體時(shí)間曲線，共7 只；
[003引 pJW4303-WSP-Gn表示pJW4303-WSP-Gn免疫BALB/c小鼠后的特異性IgG抗體時(shí)間曲 線，共7只；
[0039] PJW4303-巧 A-Gn-opt 表示 pJW4303-tPA-Gn-〇pt 免疫 BALB/c 小鼠后的特異性 IgG 抗 體時(shí)間曲線，共7只。
[0040] 圖6 PJW4303、PJW4303-WSP-Gn、PJW4303-tPA-Gn-〇pt免疫BALB/c小鼠后第 10周特 異性IgG抗體滴度
[0041 ] PJW4303表示空載體免疫BALB/c小鼠后的特異性IgG滴度，共7只；
[0042] pJW4303-WSP-Gn 表示 pJW4303-WSP-Gn 免疫 BALB/c小鼠后的特異性 IgG 滴度，共7 只；
[0043] pJW4303-tPA-Gn-〇pt 表示 pJW4303-tPA-Gn-〇pt 免疫 BALB/c 小鼠后的特異性 IgG 滴 度，共7只。
【具體實(shí)施方式】
[0044] 實(shí)施例1.密碼子優(yōu)化的SFTSV核蛋白基因序列的設(shè)計(jì)與合成
[0045] 用軟件化timumGene?分析編碼SFTSV糖蛋白Gn的基因序列沈Q ID N0.1，找出其密 碼子使用偏好W及與哺乳動(dòng)物使用偏好不同的位點(diǎn)。對(duì)于使用偏好不同的密碼子位點(diǎn)，用 哺乳動(dòng)物細(xì)胞偏好的密碼子替代，設(shè)計(jì)篩選出密碼子優(yōu)化的SFTSV糖蛋白Gn基因序列SEQ ID NO.2。上述密碼子優(yōu)化的基因序列所編碼的蛋白質(zhì)氨基酸序列與其原有的氨基酸序列 一致。上述密碼子優(yōu)化的基因序列由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，裝入載體pU巧7， 構(gòu)建成重組質(zhì)粒pU巧7-WSP-Gn-opt。經(jīng)測(cè)序證實(shí)合成的序列正確。
[0046] 為了明確顯示進(jìn)行密碼子優(yōu)化的位點(diǎn)，現(xiàn)將密碼子優(yōu)化后的核酸序列WSP-Gn-opt 與密碼子優(yōu)化前的核酸序列WSP-Gn進(jìn)行對(duì)比。比較結(jié)果如下(*為終止密碼子）：




[0化2] 上述密碼子優(yōu)化的SFTSV糖蛋白Gn基因序列與野生型序列比較密碼子偏好性發(fā)生 了改變。從圖1中由軟件化timumGene?模擬出的結(jié)果可W看出，與野生型基因序列相比，密 碼子優(yōu)化的基因中哺乳動(dòng)物細(xì)胞偏好的密碼子出現(xiàn)頻率增加，但是它們所編碼的氨基酸序 列不變，從而使SFTSV糖蛋白Gn更適于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的蛋白表達(dá)。
[0化3] 實(shí)施例2.真核表達(dá)載體pJW4303-WSP-Gn、pJW4303-tPA-Gn-〇pt的構(gòu)建
[0054] (1)目的片段和載體的獲得
[005引1 )WSP-Gn片段、質(zhì)粒PJW4303線性大片段的獲得：WpUC57-WSP-Gn為模板，用引物 WSP-Gn-F(CCCAAGCTTATGATGAAAGTCATCTGG)和WSP-Gn-R(GAGCTCGGATCCCTATTAC TCAATCCTAACATCATC)PCR擴(kuò)增SFTSV糖蛋白Gn基因序列，擴(kuò)增產(chǎn)物用Hind虹和BamH I雙酶 切。并用化nd虹和BamH I雙酶切載體質(zhì)粒PJW4303。酶切反應(yīng)體系為：10XBuffer Tango? 4 yl，pJW4303或相應(yīng)PCR產(chǎn)物 10yl，Hind虹 2yl，BamH I 化1，補(bǔ)水至40yl，37°C，2h。
[0056] 2HPA-Gn-〇pt片段、質(zhì)粒PJW4303線性大片段的獲得：WpUC57-WSP-Gn-〇pt為模 板，用引物巧 A-Gn-opt-F(GTCACTTCGCTAGCGACAGTGGACCTATTATCTGCG)和巧 A-Gn-opt-R (GAGCTCGGATCCCTATTACTCAATCCGCACATCGTCC) PCR擴(kuò)增密碼子優(yōu)化的 SFTSV糖蛋白 Gn基因序 列，擴(kuò)增產(chǎn)物用化e巧郵amH I雙酶切。并用Nhe I和Ba恤I雙酶切載體質(zhì)粒PJW4303。酶切 反應(yīng)體系同1)。
[0057] (2)酶切產(chǎn)物純化:TAE緩沖液制作1 %瓊脂糖凝膠，酶切產(chǎn)物進(jìn)行電泳，100V，化； 稱重空1.5παΕρ管，紫外燈下切下含目的DM的凝膠置入化管;切碎膠塊，分析天平稱膠塊的 質(zhì)量，按l〇〇mg= 10化1進(jìn)行計(jì)算膠塊的體積;加入至少1倍等體積的Binding Buffer;把混 合物置于55°C~65°C水浴中溫浴7min至凝膠完全融化，其間每隔2-3分鐘混勻一次;轉(zhuǎn)移 700μ1冷卻的DNA-瓊脂糖溶液到一個(gè)化BindTM DNA柱子，并把柱子裝在一個(gè)干凈的2ml收集 管內(nèi)，室溫下，10，000 X g離屯、Imin，棄去液體;將柱子重新套回收集管中，加300μ1 Binding Buffer至化Bind DNA柱子中，室溫下，10，000 X g離屯、1分鐘，棄去濾出液;將柱子重新套回 收集管中，加入700μ1 SPW Wash buffer至HiBind DNA柱子中，室溫下，10,000Xg離屯、1分 鐘，棄濾出液;重復(fù)洗涂一次，將空柱子重新套回收集管中，10，000 X g離屯、Imin W甩干柱基 質(zhì)殘余的液體;把柱子裝在一個(gè)干凈的1.5ml離屯、管上，加入30~50μ1洗脫液或滅菌水上柱 子膜上，10，000 X g離屯、1分鐘，離屯、管中的溶液就是純化的DNA產(chǎn)物，測(cè)定DNA濃度并保存 于-2(TC。
[0058] (3)連接反應(yīng):用T4DNA連接酶將各目的片段與相應(yīng)的質(zhì)粒PJW4303線性大片段連 接，得到91巧4303-胖5?-611、91胖4303-1?4-611-〇91重組表達(dá)質(zhì)粒，即為本發(fā)明所提供的5。了5￥ 糖蛋白Gn的核酸疫苗。連接反應(yīng)體系為：10XT4DNA Ligase Buffer化1，線性化的PJW4303 化1，純化的Gn相關(guān)目的片段化1，T4DNA Ligase化1，混勻，4°C放置16h。連接物轉(zhuǎn)化皿101 感受態(tài)細(xì)胞。
[0化9]實(shí)施例 3.重組質(zhì)粒 pJW4303-WSP-Gn、pJW4303-tPA-Gn-〇pt 的鑒定
[0060] 3.1 pJW4303-WSP-Gn、pJW4303-tPA-Gn-〇pt 分別轉(zhuǎn)化皿 101 感受態(tài)細(xì)胞
[0061 ] 1)無菌條件下，將化 1 的pJW4303-WSP-Gn、pJW4303-tPA-Gn-〇pt分別加入到100μΙ 大腸桿菌皿101感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰浴30min。
[0062] 2)將含細(xì)胞懸浮液的化管置于42°C水浴熱擊90s。
[0063] 3)熱沖擊處理后細(xì)胞迅速置于冰上2~3min。
[0064] 4)加入不含氨節(jié)青霉素的LB培養(yǎng)液80化1，置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中，37°C，100rpm， 培養(yǎng)50min。
[00化]5)用移液器取0.2ml pJW4303-WSP-Gn、pJW4303-tPA-Gn-〇pt轉(zhuǎn)化菌液涂布于含 lOOμg/ml氨節(jié)青霉素的瓊脂培養(yǎng)板上。
[0066] 6)將培養(yǎng)皿正面朝上并置于室溫20min左右，待涂布的菌液干燥后倒置放于隔水 式恒溫箱中，37 °C培養(yǎng)過夜。
[0067] 3.2篩選陽性克隆
[0068] 按照QIAGEN公司的Mini Plasmid Purification Kit質(zhì)粒小量提取試劑盒說明書 操作。
[0069] 1)細(xì)菌接種:挑取pJW4303-WSP-Gn、pJW4303-tPA-Gn-〇pt轉(zhuǎn)化平皿上的單菌落接 種于5ml含l(K)μg/ml氨節(jié)青霉素的LB培養(yǎng)液中，37°C，180巧m，過夜培養(yǎng)。
[0070] 2)將小搖過夜的細(xì)菌在無菌超凈臺(tái)中緩慢吸到1.5ml離屯、管中，培養(yǎng)試管中剩下 少量菌液保存于4°C。
[0071] 3)菌體收集:離屯、管中菌液，常溫下13，OOOg離屯、Imin，棄上清。
[0072] 4)懸浮菌體:加入25化1 buffer P1充分懸浮細(xì)菌沉淀。
[0073] 5)堿變性:加入25化1 buffer P2,溫和顛倒5-6次，形成透明溶液。
[0074] 6)復(fù)性:加入40化1 4°C預(yù)冷的buffer N3,溫和顛倒5-6次，然后室溫靜置2min。
[00巧]7)質(zhì)粒與蛋白、基因組核酸的分離:室溫13,OOOg，離屯、lOmin。
[0076] 8)質(zhì)粒的吸附：Spin Column安置于Collection化be上，將步驟7中上清液加入到 Spin Column中，13000g離屯、Imin，棄濾液。
[0077] 9)充分去除蛋白：將500μ1 buffer PB加入Spin Column中，13,000g離屯、30s，棄濾 液。
[007引 10)洗涂：將700μ1 wash buffer加入Spin Column中，13,000g離屯、30s，棄濾液。
[00巧]11)重復(fù)洗涂一次:重復(fù)步驟10。
[0080] 12)將Spin Column安置在1.5ml化上，在膜中央滴加50μ1的滅菌蒸饋水，室溫靜 置Imin。
[0081 ] 13) 13000g離屯、Imin，洗脫液即為含有質(zhì)粒的溶液。
[0082] 3.3酶切鑒定質(zhì)粒 pJW4303-WSP-Gn、pJW4303-tPA-Gn-〇pt
[0083] pJW4303-WSP-Gn用Hind虹和BamH I進(jìn)行雙酶切，pJW4303-tPA-Gn-〇pt用Nhe 巧口 BamHI進(jìn)行雙酶切，總反應(yīng)體系（10μl):10XBuffe;rTango?]_μl，質(zhì)粒（約0.20μg/μl)ail， 化e I或化nd虹0.5yl，BamH I 0.扣1，用滅菌dd出0補(bǔ)足反應(yīng)體系至10μ1η37°(：，解育化，加 入化110 X Loading buff er終止酶切反應(yīng)，lOg/L瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果，酶切后電泳圖 譜見圖3。圖3顯示兩種核酸疫苗的克隆均構(gòu)建正確。將酶切鑒定正確的細(xì)菌克隆連續(xù)劃Ξ 次平板，然后送上海生工生物公司測(cè)序，測(cè)序正確的單克隆細(xì)菌于-80°C保存。
[0084] 實(shí)施例4.pJW4303-WSP-Gn、pJW4303-tPA-Gn-〇pt的大量制備（質(zhì)粒大提試劑盒為 QIAGEN Plasmid Mega Kit(5)，Qiagen公司）
[0085] 1)吸取鑒定正確的細(xì)菌保存液10μ1接種于5ml含l(K)μg/ml氨節(jié)青霉素的LB培養(yǎng)液 中，37°C，180巧m，過夜生長(zhǎng)。
[0086] 2)按1:500將前一天培養(yǎng)菌液接種于500ml含10化g/ml氨節(jié)青霉素的LB培養(yǎng)液中， 371：，180巧111，過夜生長(zhǎng)。
[0087] 3)第二天將細(xì)菌移到250ml離屯、瓶中，4°C、6,000g離屯、15min，棄上清，收集細(xì)菌。
[0088] 4)加入50ml緩沖液P1，反復(fù)振搖，直至細(xì)菌全部重懸于溶液中。
[0089] 5)加入50ml緩沖液P2,溫和顛倒5-6次，溶液呈均勻藍(lán)色，靜置5min。
[0090] 6)加入50ml緩沖液P3，溫和顛倒5-6次，藍(lán)色溶液消失，溶液分層，上層為結(jié)實(shí)的乳 白色團(tuán)塊，下層為清亮液體，冰上放置30min。
[0091] 7)4°C，21，000g離屯、30min，將上清轉(zhuǎn)移至另一離屯、瓶，該條件下再將上清液離屯、 10min〇
[0092] 8)取緩沖液地T 35ml平衡提取柱。
[0093] 9)將(7)中得到的上清加入到提取柱內(nèi)，自然過柱，棄去濾過液體。
[0094] 10)加入洗涂緩沖液QC 200ml，自然過柱，棄去濾過液體。
[00M] 11)加入洗脫緩沖液QF 35ml，自然過柱，收集濾過液體。
[0096] 12)在收集液體中加入24.5ml異丙醇，4°C，16,000g離屯、30min，棄上清。
[0097] 13)7ml 70%乙醇重懸離屯、管中沉淀，4°C，16,000g離屯、lOmin。
[0098] 14)將有沉淀的離屯、管于超凈臺(tái)內(nèi)自然驚干，1ml Elution Buffer溶解沉淀。
[0099] 15)紫外分光光度法測(cè)定抽提所得溶液中的質(zhì)粒濃度及260/280比值，分裝后凍存 于-7(TC。
[0100] 實(shí)施例5.細(xì)胞轉(zhuǎn)染
[0101] 293T細(xì)胞用含lOOU/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素及10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng) 基在37 °C，5 % C〇2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，用2.5g/L膜酶消化后，W 5.0 X 1〇6 個(gè)細(xì)胞(6mL)接種于10cm培養(yǎng)皿中，待生長(zhǎng)至80 %融合時(shí)，依據(jù)PEI轉(zhuǎn)染法進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。取 陽I 75yl，pJW4303-WSP-Gn、pJW4303-tPA-Gn-〇pt 20yg，加含lOOU/ml青霉素、100μg/ml鏈 霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基至82扣1，充分混勻，室溫解育15min，然后將上述混合液加到培養(yǎng)皿 中并輕輕搖動(dòng)使混合均勻，同時(shí)WpJW4303空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞作為陰性對(duì)照。她后更換僅 含lOOU/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)4加后收獲細(xì)胞裂解物進(jìn)行 Western blot分析。其中，轉(zhuǎn)染細(xì)胞的細(xì)胞裂解產(chǎn)物收獲步驟為:棄細(xì)胞培養(yǎng)上清液，用PBS (濃度1 OmM，抑7.2)將細(xì)胞從培養(yǎng)皿中洗脫，收集細(xì)胞懸液，2，500巧m，室溫，離屯、lOmin，棄 上清，加入裂解液（50mM Tris-HCl PH7.6，150mM 化Cl，l%Triton，臨用前加入l%100mM PMSF(苯甲基橫酷氣）），冰上解育15min，12.000巧m，4°C，離屯、60min，收集上清液，-20°C凍 存。
[0102] 實(shí)施例6.Western Blot檢測(cè)pJW4303-WSP-Gn、pJW4303-tPA-Gn-〇pt的體外表達(dá)
[0103] 1)樣品的制備:PJW4303、各重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞的裂解物20μ1，加入5x上樣緩 沖液化1，100°C，煮沸8min。
[0104] 2)制備分離膠：7.5ml 30% 丙締酷胺溶液，3.7ml Tris/Cl ΡΗ8.8，150μ1 10% SDS，15化1 10 %過硫酸錠，6μ1 TEMED，灌膠，在分離膠上方加入dd出0液封，室溫下聚合 30min〇
[01化]3)制備濃縮膠:倒棄液封水，制備5%的濃縮膠(4.1ml ddH20，lml 30%丙締酷胺 溶液，750μ1 Tris/Cl ΡΗ6.8,60μ1 10%SDS，60yl 10%過硫酸錠，6μ1 TEMED)，灌膠，插入 梳齒，待膠完全凝聚后，拔下梳齒，將膠轉(zhuǎn)移固定至電泳槽中。
[0106] 4)上樣：將上述處理好的蛋白樣品加入到加樣孔中進(jìn)行電泳，先20mA化，然后 40mA繼續(xù)電泳化。
[0107] 5)轉(zhuǎn)膜：甲醇激活PVDF膜，在化is-Glycine緩沖液中平衡，W100V，化將膠上的蛋 白轉(zhuǎn)到PVD刊莫上。
[010引6)封閉：轉(zhuǎn)好的膜用5%脫脂奶粉封閉，37°Cah。
[0109] 7)用PBST洗膜兩次。
[0110] 8)解育一抗:將膜浸在1:300稀釋的BALB/c小鼠免疫血清中，4°C，解育過夜。
[0111] 9)洗膜:棄血清，PBST洗膜6次，每次1 Omin。
[0112] 10)解育二抗:棄洗涂液，加入HPR標(biāo)記的羊抗鼠 IgG(1:10.000稀釋），37 °C，化。
[0113] 11)棄二抗，用PBST洗膜6次，每次lOmin。
[0114] 12化化化學(xué)發(fā)光底物均勻加到膜上，Bio-Rad成像系統(tǒng)顯影拍照。
[0115] 結(jié)果見圖4，pJW4303-WSP-Gn、pJW4303-tPA-Gn-〇pt轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后均可在細(xì)胞裂 解液中檢出目的蛋白的表達(dá)，但PJW4303-tPA-Gn-〇pt組目的蛋白表達(dá)量更高且可同時(shí)分泌 到胞外，目的蛋白Gn表觀分子量約為61kDa。陰性對(duì)照空載體PJW4303轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞的上清 及裂解液均沒有檢出目的蛋白的存在。
[0116] 實(shí)施例7 .pJW4303-WSP-Gn、pJW4303-tPA-Gn-〇pt核酸疫苗體液免疫原性的研究
[0117] 在核酸疫苗構(gòu)建和表達(dá)成功后，對(duì)BALB/c小鼠進(jìn)行免疫，通過化ISA方法檢測(cè)其免 疫原性。7. lpJW4303-WSP-Gn、pJW4303-tPA-Gn-〇pt免疫BALB/c小鼠，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如下：
[011 引 表 1 pJW4303-WSP-Gn、pJW4303-tPA-Gn-0pt 免疫 BALB/c 小鼠
[0119]
[0120] 如表 1，用pJW4303、pJW4303-WSP-Gn、pJW4303-巧A-Gn-opt各免疫一組BALB/c小 鼠。肌肉注射l(K)yg相應(yīng)質(zhì)粒，注射后立即于注射部位用WJ-2002活體基因?qū)雰x進(jìn)行體內(nèi) 電轉(zhuǎn)染(針頭插入深度至少2mm，電轉(zhuǎn)染參數(shù):電壓50V，脈沖次數(shù)正反各3次，波寬30ms，頻率 30化），W小鼠腿部肌肉發(fā)生抖動(dòng)視為電轉(zhuǎn)染有效。于第0、2、4、8周進(jìn)行DNA免疫，于每次免 疫前、第6周、末次免疫后兩周采血。
[0121] 7.沈LISA檢測(cè)血清中Gn特異性IgG
[0122] 用化ISA方法檢測(cè)血清中特異的IgG抗體反應(yīng)，評(píng)價(jià)pJW4303-WSP-Gn、pJW4303- tPA-Gn-opt核酸疫苗在BALB/c小鼠模型中誘導(dǎo)產(chǎn)生體液免疫的能力。
[0123] 1)抗原包被：pJW4303-tPA-Gn-〇pt轉(zhuǎn)染上清作為抗原包被化ISA板（使用PBS PH7.2-7.4作為稀釋液），每孔100μ1，4Γ，過夜。
[0124] 2)洗板:棄掉包被液，用0.05 % PBST(含0.05 % Tween-20的PBS)洗板5次。
[012引 3)封閉：1%BSA和4%怖ey(含0.05%1'"6611-20、1%854和4%怖巧的？85)，每孔200 μ1，37Γ，封閉化。
[0126] 4)洗板:棄掉封閉液，用0.05 % PBST洗板5次。
[0127] 5)加入待測(cè)樣本:加入待檢測(cè)血清，即一抗，起始稀釋度為1:200,再進(jìn)行1:2倍比 稀釋。每孔加入1〇〇μ1，37Γ，解育化(一抗稀釋液為含4%wh巧和0.5%Tween-20的PBS)。
[012引 6)洗板:棄一抗，用PBST洗板5次。
[0129] 7)加生物素標(biāo)記的二抗:生物素標(biāo)記的羊抗鼠 IgG( 1: 5，000稀釋），每孔加入10化 1，37°C，解育化(抗體稀釋液為含4%wh巧和0.5%Tween-20的PBS)。
[0130] 8)洗板:棄生物素標(biāo)記的羊抗鼠 IgG，PBST洗板5次。
[0131] 9)加 HRP-標(biāo)記的鏈親和素:HRP標(biāo)記（1:4，000稀釋），每孔加入100μΙ，37°C，解育化 (稀釋液為含4%wh巧和0.5%Tween-20的PBS)。
[0132] 10)棄HRP標(biāo)記的鏈親和素，PBST洗板5次。
[0133] 11 )TMB顯色:TMB溶液配方，TMB片劑1片，0.1M憐酸鹽/巧樣酸鹽緩沖液5ml，雙蒸水 5ml，30 %雙氧水化1。每孔加入10化1，室溫下靜置3.5min，每孔加入50μ1 1M的出S化終止顯 色。
[0134] 12)酶標(biāo)儀設(shè)定630nm為參考波長(zhǎng)，450nm為測(cè)試波長(zhǎng)，測(cè)定并記錄各孔Α450值，計(jì) 算復(fù)孔平均值，W免疫前血清吸光度值的2.1倍作為cut-off值，而且免疫后血清吸光度值 小于0.05的孔也去除。
[0135] BALB/c小鼠血清Gn特異性IgG應(yīng)答時(shí)間曲線如圖5所示。pJW4303-WSP-Gn、 pJW4303-tPA-Gn-〇pt核酸疫苗免疫組小鼠血清中均可檢測(cè)到Gn特異性IgG,且隨著免疫次 數(shù)的增加，免疫應(yīng)答強(qiáng)度逐步提高。PJW4303空載體組小鼠的血清中未能檢測(cè)到Gn特異性 IgG應(yīng)答。
[0136] BALB/c小鼠血清Gn特異性IgG抗體最高滴度如圖6所示。圖中顯示第四次免疫后2 周的BALB/c血清中，P JW4303-WSP-Gn、P JW4303-tPA-Gn-〇pt免疫組均有較高滴度的特異性 抗體，而PJW4303空載體免疫組則未檢測(cè)到抗體應(yīng)答。pJW4303-tPA-Gn-〇pt組與PJW4303- WSP-Gn組、PJW4303組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。<0.05)沖1胖4303-胖5?-611組和91胖4303組比較 具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<〇. 05)。
[0137] 本發(fā)明未設(shè)及部分均與現(xiàn)有技術(shù)相同或可采用現(xiàn)有技術(shù)加 W實(shí)現(xiàn)。
[0138] 實(shí)施例中所設(shè)及的試劑信息如下表： p'fL·酶 中國(guó)TIANGEN公司 T4 DNA連接酶 加拿乂 Fcmentas公司 TMB片劑 Sigma公司
[0139] 化b ladder DNA marker (CW0641) 北京康淆世紀(jì)生物科技有限公司 ! OObp ladder DNA marker GcncDirc 限制性內(nèi)切酶執(zhí)》?灑'I、.紐始皿、I Fermentas公司 DNA凝膠回收試劑盒 美國(guó)Omega公司 DMEM島糖培養(yǎng)基 Hyclone公司 胎牛血清 Hyctone公司 質(zhì)粒小量提取試劑盒 巧agen公司
[0140] 質(zhì)粒大量提取試劑盒 Qiagen公司 PEI InviliOgcn 公-i I'j Η民P +小 idir;J 丫:-化 ?!;? IgG So山hcmBioicch 公 wj
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種密碼子優(yōu)化的嚴(yán)重發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒（SFTSV)糖蛋白Gn基因序列， 序列為SEQ ID N0.2。2. -種SFTSV糖蛋白Gn核酸疫苗，其特征在于由序列為SEQ ID NO.2的SFTSV糖蛋白Gn 基因序列，插入到真核表達(dá)載體Nhel和BamHI酶切位點(diǎn)之間所得，其5 '端連接tPA信號(hào)肽序 列。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的SFTSV糖蛋白Gn核酸疫苗，其特征在于所述的真核表達(dá)載體為 pJW4303〇
【文檔編號(hào)】A61P31/14GK106011155SQ201610324251
【公開日】2016年10月12日
【申請(qǐng)日】2016年5月16日
【發(fā)明人】李軍, 金柯, 劉源, 徐菱遙, 韓亞萍, 劉艷, 周宜慶
【申請(qǐng)人】李軍, 金柯, 劉源, 徐菱遙, 韓亞萍, 劉艷, 周宜慶