專利名稱：一種控制水稻根系發(fā)育的基因OsZRL的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域，特別涉及一種控制水稻根系發(fā)育的基因及其在水稻性狀改良中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
水稻根系是吸收水分、礦物質(zhì)和感受土壤環(huán)境的橋梁，又是氨基酸、多種激素同化、合成的場(chǎng)所，根系狀況直接影響著地上部分的生長發(fā)育及產(chǎn)量的形成，是制約水稻產(chǎn)量潛力進(jìn)一步發(fā)揮的關(guān)鍵因素。但由于植物根系隱藏于地下，其發(fā)育的形態(tài)和生理學(xué)觀察不易進(jìn)行，相應(yīng)分子機(jī)制的研究也較其他植物器官滯后。雖然，近年在雙子葉模式植物擬南芥根的發(fā)育方面有了比較大的進(jìn)展(Benfey等，Plant J, 2010)，但由于單、雙子葉植物根系的不同，如在擬南芥中有主根，然后順序分生出側(cè)根，而水稻、玉米等則是形成龐大而復(fù)雜的不定根系(Osmont等，Annu Rev Plant Biol, 2007) 0所以，谷類作物還沒有一套具體的根系形態(tài)、生理特征改良指標(biāo)，對(duì)根系發(fā)育的分子調(diào)控機(jī)制也了解不多。在已知的水稻根發(fā)育相關(guān)基因研究中，CRLl {CROWN ROOTLESS 1)和 WOXll {WUSCHEL-related homeobox gene)基因分別通過介導(dǎo)生長素信號(hào)傳導(dǎo)或生長素/ 細(xì)胞分裂素信號(hào)整合調(diào)控水稻不定根的生長發(fā)育(Inukai等，Plant Cell, 2005 ；Zhao 等，Plant Cell, 2009)基因通過茉莉酸信號(hào)途徑促進(jìn)水稻根的發(fā)育、彎曲和卷曲 (Jang等，Plant cell Environment, 2007)，而bHLH (basic helix—loop—helix)轉(zhuǎn)錄因子基因7P5Z4 {ROOT HAIR DEFECTIVE 6-LIKE 4)可以控制根部細(xì)胞生長的大小(Yi等，Nature genetics, 2009)。鋅指蛋白(zinc-finger protein)是轉(zhuǎn)錄因子中研究得比較深入的一個(gè)類型(楊致榮等，遺傳，2004)。鋅指蛋白中有單個(gè)或成簇出現(xiàn)的鋅指結(jié)構(gòu)域，可以結(jié)合DNA而調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄、染色質(zhì)重構(gòu)等(Gamsjaeger等，Trends Biochem Sci, 2007)。在植物中普遍存在鋅指蛋白，有些鋅指蛋白是植物所特有，并廣泛參與植物各個(gè)時(shí)期的生長發(fā)育調(diào)控、脅迫應(yīng)答等。但總體來說，在單子葉植物中相應(yīng)研究還較少，尤其是在根系發(fā)育調(diào)控方面，而這對(duì)于水稻等重要糧食作物田間農(nóng)藝性狀調(diào)控來說尤為重要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是在于提供一個(gè)新的控制水稻根系發(fā)育的基因，所述基因的過量表達(dá)可明顯抑制水稻的根系發(fā)育，而該基因的下調(diào)可以促進(jìn)根系的生長發(fā)育，因而發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用。本發(fā)明的技術(shù)方案如下
本發(fā)明所述控制水稻根系發(fā)育的基因，命名為《sZTPZ {Oryza sativa Zinc-finger Tfooi^^s)，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO :1所示，所編碼蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO :2所示，其編碼序列在第211-233位氨基酸有一個(gè)C2H2型鋅指 (zinc-finger)結(jié)構(gòu)域，第298-320位氨基酸有一個(gè)C2HC型鋅指結(jié)構(gòu)域。該基因的克隆 根據(jù)GenBank中水稻mRNA序列(登錄號(hào)NM_001062214，CI472510)，利用引物設(shè)計(jì)軟件 Primer Premier 5. 0設(shè)計(jì)了 2對(duì)巢式PCR特異引物。從水稻葉子中提取總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄PCR (RT-PCR)技術(shù)從水稻中分離到OsZRL基因編碼序列。本發(fā)明所述OsZRL基因過表達(dá)真核重組質(zhì)粒，是將SEQ ID NO 1所述基因全長編碼序列插入到真核表達(dá)載體中獲得。本發(fā)明所述OsZRL基因RNA干涉真核重組質(zhì)粒，由序列表中SEQ ID NO 1所示核苷酸序列中的基因片段和真核表達(dá)載體構(gòu)成，所述基因片段是位于起始密碼子下游1112bp 至1546bp的核苷酸序列，將所述基因片段正向和反向插入真核表達(dá)載體，正向插入的基因片段與反向插入的基因片段之間存在有150bp的內(nèi)含子序列。本發(fā)明所述真核重組質(zhì)粒的制備方法，其特征在于制備步驟如下
(1)在序列表中SEQID NO :1所示核苷酸序列中選擇一段基因片段，所選擇的基因片段是位于起始密碼子下游1112bp至1546bp的核苷酸序列，將所述基因片段正向插入到質(zhì) SpSK載體上形成中間載體，再將該基因片段反向插入已含正向插入基因片段的pSK中間載體，正向插入的基因片段與反向插入的基因片段之間存在有150bp的內(nèi)含子序列；
(2)利用限制性內(nèi)切酶切下pSK中間載體上含有正向插入與反向插入的基因片段的部分，然后連接到真核表達(dá)載體上，即獲真核重組質(zhì)粒。本發(fā)明所述真核重組質(zhì)粒及其制備方法中，所述真核表達(dá)載體為pHB、 pCAMBIA1301、pTCK303 中的一種。將上述過表達(dá)、RNA干涉重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化水稻，獲得轉(zhuǎn)基因植株。實(shí)驗(yàn)表明相比于野生型植株，過量表達(dá)OsZRL基因的轉(zhuǎn)基因陽性植株根系生長受到明顯抑制，而OsZRL下調(diào)轉(zhuǎn)基因植株根系發(fā)達(dá)，莖桿、植株粗壯。因此，本發(fā)明所述基因?qū)λ靖蛋l(fā)育具有負(fù)調(diào)控作用，并可在水稻性狀改良中應(yīng)用。本發(fā)明具有以下有益效果
1、本發(fā)明為研究水稻等單子葉禾本科作物的根系發(fā)育調(diào)控和性狀改良提供了一種新的基因。2、本發(fā)明所用的基因?yàn)樗颈旧碜杂械幕?，所以轉(zhuǎn)基因水稻的安全性能高。3、本發(fā)明所述基因的克隆和植物轉(zhuǎn)基因均為常規(guī)方法，所需材料易于獲取。


圖1是從水稻cDNA中擴(kuò)增OsZRL基因編碼序列的第二輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果。圖2是AsZ見基因過表達(dá)真核重組質(zhì)粒(pHB-OsZRL)的示意圖。圖3是重組質(zhì)粒pHB-OsZRL酶切鑒定圖。圖中所示為pHB_0sZRL質(zhì)粒歷III、 Sac I雙酶切結(jié)果。圖4是AsZTPZ轉(zhuǎn)基因植株表型。A 轉(zhuǎn)基因小苗從生根培養(yǎng)基移入土壤前的生長情況，從左至右依次為OX-I OX-4、0X-8、0X-9 ；B 轉(zhuǎn)基因小苗0X_4、0X-9移入土壤一周后的生長情況；C 轉(zhuǎn)基因小苗0X-5、0X-6持續(xù)在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)三周后的生長情況。
圖5是轉(zhuǎn)基因水稻植株中篩選標(biāo)記潮霉素抗性基因(Z^i)PCR擴(kuò)增結(jié)果電泳圖。 圖中，1-5泳道PCR模板為轉(zhuǎn)基因植株0X-5 0X-9基因組DNA ；6泳道陽性對(duì)照，PCR模板為重組質(zhì)粒pHB-OsZRL ； 7泳道陰性對(duì)照，PCR模板為野生型植株；M =DNA marker, DL2000。圖6是AsZTPZ轉(zhuǎn)基因植株實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)結(jié)果。從左至右依次為5個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)基因植株(0X-5 0X-9)、野生型(WT)。圖7是AsZ見基因RNA干涉真核重組質(zhì)粒(pHB_0sZRLRi)的示意圖。圖8是重組質(zhì)粒pHB-OsZRLRi酶切鑒定圖。圖中，1_3泳道為pHB_0sZRLRi質(zhì)粒損ο l+Hind III^coTP l+Sac I 禾ΠSaMl l+Sac I 雙酶切結(jié)果；M :DNA marker, DL2000。圖9是OsZRL基因RNA干涉轉(zhuǎn)基因植株表型。A 野生型(WT)、轉(zhuǎn)基因成體植株 (Ri-I)生長情況；B 野生型(WT)、轉(zhuǎn)基因植株(Ri-I)根系生長情況；C 野生型(WT)、轉(zhuǎn)基因植株(Ri-I)莖桿。圖10是轉(zhuǎn)基因水稻植株中篩選標(biāo)記潮霉素抗性基因(Z^i)PCR擴(kuò)增結(jié)果電泳圖。圖中，1-3泳道PCR模板為轉(zhuǎn)基因植株Ri-I Ri-3基因組DNA ；4泳道陽性對(duì)照，PCR 模板為重組質(zhì)粒pHB-OsZRLRi ；5泳道陰性對(duì)照，PCR模板為野生型植株；M =DNA marker, DL2000。圖11 IOsZRL RNA干涉轉(zhuǎn)基因植株半定量PCR檢測(cè)結(jié)果。從左至右依次為野生型(WT)、3個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)基因植株(Ri-I Ri-3)。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。下述實(shí)施例中，凡未注明具體實(shí)驗(yàn)條件的，均為按照本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)條件，例如Sambrook，Russell的分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條件。 實(shí)施例1 水稻OsZRL基因的克隆 1、試劑
植物RNA提取試劑盒購于北京天根生化有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于Toyobo公司； pEASY Blunt載體、高保真DNA聚合酶購于北京全式金生物技術(shù)有限公司；引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成；其余試劑均為進(jìn)口分裝或國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。2、大腸桿菌菌株和植物材料
大腸桿菌克隆菌株為五coli DH5 α，購于北京全式金生物技術(shù)有限公司；水稻粳稻品種日本晴(Oiyza sative L. Nipponbare)種子由重慶大學(xué)農(nóng)學(xué)及生命科學(xué)研究院試驗(yàn)基地提供。3、培養(yǎng)基和溶液
LB培養(yǎng)基胰蛋白胨10 g /L，酵母粉5 g /L,NaCl 10 g/L。用NaOH調(diào)pH至7. 0， 高壓滅菌。SOB 培養(yǎng)基胰蛋白胨 20 g/L，酵母粉 5 g/L, NaCl 0. 58 g/L, KCl 0. 19 g/L, IOOXMg2+ 10 mL。用 NaOH 調(diào) pH 至 7. 0，高壓滅菌。SOC 培養(yǎng)基SOB + 20 mM 葡萄糖。
TB buffer (臨用前配置)1 M KCl 4 mL,0. 45 M MnCl2 2.4 mL,0. 50 M CaCl2 0. 6 mL，0. 50 M K-MES 0. 5 mL, ddH20 12. 5 mL (總體積 20 mL)。100 X Mg2+溶液20. 33 g MgCl2. 6H20 禾口 24. 65 g MgSO4. 7H20 定容于 100 mL H2O,
高壓滅菌。20%葡萄糖溶液20g葡萄糖定容于100 mL H2O,過濾除菌。IM KCl 溶液7. 45 g KCl 定容于 100 mL H2O,高壓滅菌。0. 45M MnCl2 溶液8. 9 g MnCl2. 4H20 定容于 100 mL H2O,高壓滅菌。0. 50M CaCl2 溶液7. 35 g CaCl2. 2H20 定容于 100 mL H2O,高壓滅菌。0. 50M K-MES 溶液9. 76 g MES 定容于 100 mL H2O,用 KOH 調(diào) pH 至 6. 3，過濾除菌，分裝成0. 5 mL每管，-20°C儲(chǔ)存。DMSO分裝 200 μ L 新鮮 DMSO，-20°C儲(chǔ)存。4、方法
4. 1水稻葉片RNA提取
RNA提取試劑盒購自北京天根生物有限公司，RNA提取過程按照生產(chǎn)商建議程序進(jìn)行。1)將50-100 mg水稻葉片在液氮中迅速研磨成粉末，加入450 μ L RL (使用前加入β -巰基乙醇4. 5 μ L)，渦旋劇烈震蕩混勻；在56°C孵育1-3 min使水稻組織裂解；
2)將所有溶液轉(zhuǎn)移至過濾柱CS上，12000rpm離心5min，小心吸取收集管中的上清至 RNase-free的離心管中，洗頭盡量避免接觸收集管中的細(xì)胞碎片沉淀；
3)緩慢加入0.5倍體積的無水乙醇，混勻，將得到的溶液和沉淀一起轉(zhuǎn)入吸附柱CR3 中，12000 rpm離心60 s，棄去收集液，將吸附柱CS3放回收集管中；
4)向吸附柱CS3中加入350μ L去蛋白液RW1，12000 rpm離心60 s，棄去收集液，將吸附柱CS3放回收集管中；
5)DNaseI工作液的配置取10 μ L DNase I儲(chǔ)存液于RNase-free離心管中，加入70 μ L RDD溶液，輕柔混勻；
6)向吸附柱CS3中央加入80μ L的DNase I工作液，室溫放置15 min ；
7)向吸附柱CR3加入350μ L去蛋白液RW1，12000 rpm離心60 s，棄去收集液，將吸附柱CR3放回收集管中；
8)向吸附柱CR3中加入500μ L漂洗液RW (使用前加入乙醇，12 mL Rff原液中加入無水乙醇48 mL)。室溫靜置2 min, 12000 rpm離心60 s，棄去收集液，將吸附柱CS3放回收集管中；
9)重復(fù)步驟8；
10)12000rpm離心2 min，棄去收集液。將吸附柱CS3置于室溫?cái)?shù)分鐘，徹底晾干吸附材料中殘留的漂洗液；
11)將吸附柱CR3放入一個(gè)新的RNase-free離心管，在柱的中央加入30-100μ L洗脫緩沖液，室溫放置2分鐘。12000 rpm離心2 min,洗脫RNA。RNA樣品在-70° C中保存。4. 2 RT-PCR 4. 2. 1 RT
1)取 1 μ g 總 RNA 與 1 μ L 25 pmol oligo dT 引物混合，用 RNase-free ddH20 補(bǔ)足到12. 75 μ L，輕輕混勻；2)65° C保溫5 min，立即轉(zhuǎn)移至冰浴中，放置2 min ；
3)加入5 X 反應(yīng)緩沖液 4 μ L，IOmM dNTP 2 μ L，RNA 抑制劑 0. 25 μ L (40 U/ μ L)， ReverTra Ace 反轉(zhuǎn)錄酶 1 μ L (100U/μ L), 42° C 保溫 30 min，合成第一鏈 cDNA ；
4)95°C加熱5 min，失活反轉(zhuǎn)錄酶，終止合成反應(yīng)。
4. 2. 2 PCR
水稻OsZRL基因的克隆
將200 μ 1 EP管放置于冰上，加入以下各種試劑
5XPrimeStar Buffer10 μ L
dNTP Mixture (各 2· 5 mM )4 μ L
RT產(chǎn)物1 μ L
OsZRL-Fl1 μ L
OsZRL-Rl1 μ L
ddH2032. 5 μ L
PrimeStar0. 5 μ L
按以下程序進(jìn)行擴(kuò)增98°C 2 min (預(yù)變性)；98°C 10 s (變性)，56°C 10 s (復(fù)性)， 72°C 80 s (延伸)，所述變性-復(fù)性-延伸30個(gè)循環(huán)；72°C 5 min (終延伸)。以上述PCR產(chǎn)物為模板，以引物0sZRL_F2和0sZRL_R2進(jìn)行第二輪高保真PCR，復(fù)性溫度58°C，延伸時(shí)間75 s，其它條件同上。引物序列如下
OsZRL-Fl 5’ - CGTCGGCATAAAGCAGTCTC -3， OsZRL-Rl 5' - GCTGCTTCACTGCCTTTAGC _3， 0sZRL-F2 5’ - AAGCTTTCGAGCTGAAGTAGGGATGG -3’ 0sZRL-R2 5’ - GAGCTCTTGCATTTTGTGTGGGTGTG -3’ 通過上述操作，獲得了 OsZRL基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(圖1)。4.3高保真PCR產(chǎn)物和克隆載體pBLUNT-EASY連接
第二輪高保真PCR產(chǎn)物與克隆載體pBLUNT-EASY按摩爾分子數(shù)比2 1連接(25 °C， IOmin)，連接體系如下
pBLUNT-EASY (50 μ g/ μ 1)IyL
PCR 產(chǎn)物( 150 μ g/μ 1)2 yL
4. 4大腸桿菌轉(zhuǎn)化 4. 4. 1感受態(tài)細(xì)胞的制備
1)接種大腸桿菌單菌落于2mL SOB培養(yǎng)液中，37°C過夜培養(yǎng)；
2)轉(zhuǎn)接0.5mL過夜培養(yǎng)物至50 mL SOB培養(yǎng)液中，18°C劇烈震蕩18 24 h至A_ ^ 0. 55 ；
3)將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入50mL離心管中，冰浴10 min, 4°C 4000 rpm離心10 min ；
4)去上清，加16mL預(yù)冷的TB緩沖液懸浮細(xì)胞(注意輕輕旋轉(zhuǎn)，不要用振蕩器或吹吸混勻)，冰浴 10 min, 40C 4000 rpm 離心 10 min ；
5)去上清，加4mL預(yù)冷的TB緩沖液懸浮細(xì)胞，加入280 μ 1的DMS0，輕柔混勻，冰浴 10 min ；6)分裝于預(yù)冷得1. 5 mL EP管中，液氮凍存。4.4.2 轉(zhuǎn)化
1)從液氮中取出一管感受態(tài)細(xì)胞冰浴解凍；
2)將10μ L連接產(chǎn)物與感受態(tài)細(xì)胞輕輕混勻，冰浴30 min ；
3)42°C熱沖擊90 s，立即冰浴1-2 min ；
4)加0.8 mL的S0C,混勻，37°C溫和振蕩培養(yǎng)1 h ；
5)室溫13000rpm離心1 min，倒掉一部分上清液，留約200 μ L的上清液，用槍頭將上清液與細(xì)胞混勻，涂布LB+Amp (100 μ g/mL)平板，37°C培養(yǎng)過夜。4. 5細(xì)胞快速裂解法鑒定重組子
1)挑取單個(gè)轉(zhuǎn)化子接種于500μ L含有抗生素Amp (100 μ g/mL)的LB培養(yǎng)液中，37°C 振蕩培養(yǎng)至A6tltl為0. 6 0. 8 ；
2)取200μ L菌液至0.5ml EP管中，13000 rpm離心1 min，去上清，留約20 μ L上
清；
3)加20 μ L 2Χ 快速裂解液(0. 2 mol/L NaOH 50mL + SDS 0. 5g,蔗糖 27. 2 g,加雙蒸水至200 mL)，劇烈振蕩；
4)13000 rpm 離心 15min ；
5)取5μ L上清直接電泳。與對(duì)照比，電泳帶滯后的即可能是重組載體。4. 6菌落PCR鑒定重組質(zhì)粒
經(jīng)過快速裂解法鑒定的重組載體再做菌落PCR以確定插入片段是目標(biāo)片段，反應(yīng)體系
如下
10XPCR Buffer2 yL
dNTP Mixture (各 2· 5 mM)1. 6 μ L
菌液1 μ L
0sZRL-F20. 5 μ L
0sZRL-R20. 5 μ L
ddH2014. 2 μ L
Taq DNA 聚合酶0. 2 μ L
反應(yīng)條件94°C 3 min (預(yù)變性)；94°C 30 s (變性)，58°C 30 s (復(fù)性)，72°C 90 s (延伸)，所述變性_復(fù)性_延伸26個(gè)循環(huán)；72°C 5 min (終延伸)。對(duì)菌落PCR確定的重組載體進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明，獲得了 OsZRL基因全長編碼序列。實(shí)施例2 ,OsZRL基因過表達(dá)重組質(zhì)粒的構(gòu)建 1、試劑
質(zhì)粒提取試劑盒、瓊脂糖膠回收試劑盒購于北京全式金生物技術(shù)有限公司；限制性內(nèi)切酶、T4連接酶購于TaKaRa公司。其它進(jìn)口分裝、常規(guī)試劑與實(shí)施例1相同。2、農(nóng)桿菌菌株和植物表達(dá)載體
用于轉(zhuǎn)基因的農(nóng)桿菌菌株為■州斤購自Clontech公司；真核表達(dá)載體pHB由重慶大學(xué)農(nóng)學(xué)及生命科學(xué)研究院提供。
3、培養(yǎng)基
YEB培養(yǎng)基酵母提取物1 g/L，牛肉膏5 g/L，蛋白陳5 g/L，蔗糖5 g/L， MgSO4. 7H20 0. 5 g/L。用 NaOH 調(diào) pH 至 7. 0，高壓滅菌。4、方法
4. 1質(zhì)粒微量提取
提取已測(cè)序、連接于PEASY-Blimt克隆載體的AsZTPZ基因重組質(zhì)粒，質(zhì)粒提取過程按照生產(chǎn)商建議程序進(jìn)行。1)將帶有克隆載體質(zhì)粒的五coli DH5a接種于裝有5 mL LB培養(yǎng)液(含有抗生素 Amp, 100 μ g/mL)的試管中，37° C 培養(yǎng) 12-16 h ；
2)取1.5-5mL菌液，室溫下10000 g離心1 min。盡量吸盡上清。加入250 μ L無色溶液RB (含RNase Α)，漩渦振蕩使細(xì)胞完全重新懸?。?br> 3)加入250μ L藍(lán)色溶液LB，溫和翻轉(zhuǎn)混合4-6次，使菌體充分裂解，形成藍(lán)色透亮溶
液；
4)加入350μ L黃色溶液ΝΒ，輕輕混合5-6次，直至形成緊實(shí)的黃色凝集塊，室溫靜置 2 min ；
5)15000 g離心5 min，小心吸取上清加入吸附柱中；
6)15000 g離心1 min，棄去收集液；
7)加入650μ L溶液WB，15000 g離心1 min，棄去收集液；
8)15000 g離心2 min，徹底去除殘留的WB ；
9)將吸附柱置于一干凈的離心管中，在柱的中央加入30-50UL EB溶液，室溫靜置1
min ；
10)10000 g離心1 min，洗脫DNA。DNA溶液于-20° C保存。4. 2 DNA片段酶切回收
用限制酶歷fli/ III,Sac I分別雙酶切PEASY-Blunt重組質(zhì)粒和pHB植物表達(dá)載體，然后進(jìn)行膠回收。DNA回收過程按照生產(chǎn)商建議程序進(jìn)行。1)切取瓊脂糖凝膠中的DNA片段，放入干凈的離心管中；
2)加入3倍體積溶液GSB，于55°C水浴6-10 min確保膠塊完全融化。當(dāng)膠塊完全融化后，觀察溶液顏色，如顏色為紫色，加入適量3 M醋酸鈉(pH 5. 2)，調(diào)整顏色和GSB顏色相同(黃色)；
3)待融化的凝膠溶液降至室溫(高溫時(shí)吸附柱結(jié)合DNA能力弱)，加入吸附柱中靜置 1 min, 10000 g離心1 min，棄去收集液；
4)加入650μ L溶液WB，10000 g離心1 min，棄去收集液;
5)10000 g離心2 min，去除殘留的WB;
6)將吸附柱開蓋靜置1min，使殘留乙醇揮發(fā)干凈，在柱的中央加入60-70° C預(yù)熱 30-50 uL EB溶液，室溫靜置1 min ；
7)10000 g離心1 min，洗脫DNA。將洗脫出的DNA于-20° C保存。4. 3 DNA片段酶切回收
對(duì)回收片段進(jìn)行連接、大腸桿菌轉(zhuǎn)化，操作步驟同實(shí)施例1中4. 4。經(jīng)酶切鑒定，獲得 OsZRL基因過量表達(dá)重組質(zhì)粒，命名為pHB-OsZRL (圖2、圖3)。
4. 4農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備
1)挑取農(nóng)桿菌單菌落于2mL的YEB液體培養(yǎng)基(含有Rif 50yg/mL)中，28°C振蕩培養(yǎng)過夜；
2)取過夜培養(yǎng)液500μ L轉(zhuǎn)接于50 ml YEB (含Rif 50 μ g/mL)液體培養(yǎng)基中，28°C 振蕩培養(yǎng)至OD6tltl = 0. 5 ；
3)40C 5000 rpm離心5 min收集菌體，加10 ml 0. 15 M的NaCl溶液懸浮菌體，冰浴 10 min ；
4)40C 5000 rpm離心5 min收集菌體，用1 ml預(yù)冷的20 mM CaCl2溶液懸浮菌體，冰浴 10 min ；
5)制備好的細(xì)胞立即使用，或分裝成2001117管，液氮中速凍1!^11，置-80°C保存4. 5農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化
1)取200μ L感受態(tài)細(xì)胞，冰上解凍；
2)加1μ g pHB-OsZRL重組載體，輕彈混勻，冰浴30 min ；
3)液氮中速凍1min，37°C水浴5min，然后加入ImL YEB培養(yǎng)基，28°C慢速振蕩培養(yǎng)4
h；
4)將培養(yǎng)物涂布于含50μ g/mLKan和50 μ g/mL Rif的Y^平板上，28°C培養(yǎng)約48h。4. 6農(nóng)桿菌陽性克隆的鑒定
挑取平板上長出的單菌落，接種于含50 μ g/mL Kan和50 μ g/mL Rif的YEB液體培養(yǎng)基中，28°C振蕩培養(yǎng)過夜，以菌液為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定。鑒定結(jié)果表明，獲得了用于轉(zhuǎn)基因的AsZTPZ過表達(dá)陽性農(nóng)桿菌克隆。實(shí)施例3 -.OsZRL過表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻植株的獲得 1、試劑
DNA提取試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。Real-time PCR試劑盒購自 TaKaRa公司。其余試劑均為進(jìn)口分裝或國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。2、培養(yǎng)基
常規(guī)用組織培養(yǎng)基組分MS基本培養(yǎng)基(g/L)B5基本培養(yǎng)基(g/L)N6基本培養(yǎng)基(g/L)大量元素KNO31. 9000002. 5000002. 830000NH4NO31. 650000n/an/a(NH4)2SO4n/a0.134000. 463000MgS04-7H200. 3700000.2500000.185000CaCl20.3320200.1132400.125330KH2PO40.170000n/a0.400000NaH2PO4-H2On/a0.150000n/a微量元素MnSO4-H9O0.0169000.0100000.003330H3BO30.0062000.0030000.001600ZnS04-7H200.0086000.0020000.001500NaMo04-2H200.0002500.000250n/aCuSO40.0000250.000025n/aKI0.0008300.0007500.000800COC1-6H200.0000250.000025n/a鐵鹽FeS04-7H200.0278000.0278000.027800Na2-EDTA0.0373000.0373000.0373000有機(jī)成分肌醇0. 1000000. 100000n/a甘氨酸0.002000n/a0.002000煙酸0.0005000.0010000.000500鹽酸吡哆醇0.0005000.0010000.000500鹽酸硫胺素0.0001000.0100000.001000其它蔗糖302050瓊脂888PH5. 85. 55. 8
(1)誘導(dǎo)培養(yǎng)基=NB + 2 mg/L 2，4_D，pH 5. 8 5. 9 ； (2)共培養(yǎng)培養(yǎng)基=NB + 2 mg/L 2,4-D + 100 ymol/L 乙酰丁香酮，pH 5. 2 ； (3)篩選培養(yǎng)基NB + 2 mg/L 2，4_D + 250 mg/L羧芐青霉素+ 30 50 mg/L潮霉素，pH 5. 8 5. 9 ； (4)分化培養(yǎng)基NB + 10 mg/ L KT + 0. 4 mg/L NAA + 250 mg/L 羧節(jié)青霉素，pH 5. 8 5. 9 ； (5)生根培養(yǎng)基1/2 MS，pH 5. 8 5. 9。3、方法
3. 1農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化水稻 3. 1. 1胚性愈傷組織的誘導(dǎo)及繼代
水稻日本晴成熟種子手工去殼，75%乙醇消毒1 min，25%次氯酸鈉溶液中振蕩消毒25 min，滅菌蒸餾水再?zèng)_洗3次，然后接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。27°C暗培養(yǎng)條件下誘導(dǎo)愈傷組織形成，并繼代2次。3. 1. 2農(nóng)桿菌的培養(yǎng)及處理
從一 80°C低溫凍存管中刮取少量農(nóng)桿菌陽性克隆菌液，在含有Kan 50mg/L和Rif 50mg/L的YEB固體培養(yǎng)基劃線，然后在28°C暗培養(yǎng)36-72 h活化。取活化平板上的單菌落轉(zhuǎn)接劃菌，28°C培養(yǎng)兩天后，懸浮于20 mL含有100 μΜ/L乙酰丁香酮培養(yǎng)基中，劇烈搖動(dòng)1 min后,靜置1 h。3. 1. 3 共培養(yǎng)
選取自然分散、顏色鮮黃、直徑約為2-3 mm的顆粒狀愈傷于滅菌的培養(yǎng)瓶中，加入上述處理的農(nóng)桿菌菌液，略微搖動(dòng)后靜置15 min，于無菌濾紙上晾干愈傷后接種于共培養(yǎng)基， 25°C暗培養(yǎng)2 d0
3. 1. 4洗除農(nóng)桿菌
挑取共培養(yǎng)后的愈傷于廣口培養(yǎng)瓶中，用無菌水沖洗3-5次，每次搖動(dòng)數(shù)次，直至水中不見絲狀菌體。最后一次用含250 mg/L羧卞青霉素的無菌水靜置1 h，然后置于無菌濾紙上晾干，移至含有潮霉素的篩選培養(yǎng)基。3. 1. 5愈傷組織的篩選
轉(zhuǎn)化愈傷在篩選培養(yǎng)板上生長，每兩周轉(zhuǎn)板1次。3. 1. 6抗性愈傷組織的繼代與植株的再生
轉(zhuǎn)化愈傷在篩選培養(yǎng)板上生長約三周后即可見瘤狀鮮黃色抗性愈傷從褐化干癟的愈傷中長出。待愈傷長大后挑選抗性愈傷的一部分轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基上，約2周或更長時(shí)間后愈傷開始轉(zhuǎn)綠，3周或更長時(shí)間后分化出幼苗。將幼苗移至生根培養(yǎng)基上，待幼苗生根長成后，移出培養(yǎng)瓶，洗凈根上的培養(yǎng)基后，移至溫室盆栽。3. 2轉(zhuǎn)基因植株的鑒定
3. 2. 1水稻基因組DNA的提取
分別取野生型、轉(zhuǎn)基因植株葉片提取基因組DNA，提取過程按照生產(chǎn)商建議程序進(jìn)行。1)取新鮮水稻組織100 mg,加入液氮充分研磨；
2)加入250μ 溶液RB1，振蕩混勻，使樣品完全懸??；
3)加入30μ 10%SDS, 15 μ RNase A至裂解液中，充分混勻；
4)55°C水浴孵育15min;
5)12000 rpm離心15 min，輕輕吸取上清于干凈的離心管中；
6)加入100PL溶液PBl中，充分混勻，冰浴5 min, 12000 rpm離心5 min ；
7)輕輕吸取上清于干凈的離心管中，加入375μ 溶液BBl (使用前加入無水乙醇)，充分混勻；
8)取全部混合液加入吸附柱中，12000rpm離心30 s，棄去收集液；
9)加入500μ 溶液CB，12000 rpm離心30 s，棄去收集液；
10)加入500PL溶液WB (使用前加入無水乙醇)，12000 rpm離心30 s，棄去收集液；
11)重復(fù)步驟10；
12)12000 rpm離心2 min，徹底去除殘留的WB ；
13)將吸附柱置于一個(gè)干凈的離心管中，在柱的中央加入100ML預(yù)熱(60° C)的EB 溶液，室溫靜置1 min，12000 rpm離心1 min，洗脫DNA。DNA溶液于-20° C保存。3.2.2陽性轉(zhuǎn)基因植株鑒定
分別以野生型、轉(zhuǎn)基因植株基因組DNA為模板，對(duì)水稻潮霉素抗性標(biāo)記基因QlPt~)進(jìn)行 PCR擴(kuò)增。潮霉素抗性基因特異引物為 HPTF 5' -TCGTTATGTTTATCGGCACTTTG-3，
HPTR 5' -GCGTCTGCTGCTCCATACAAG-3' 按以下程序進(jìn)行擴(kuò)增94°C 3 min (預(yù)變性)；94°C 30 s (變性)，58°C 30 s (復(fù)性)， 720C 20 s (延伸)，所述變性-復(fù)性-延伸30個(gè)循環(huán)；72°C 5 min (終延伸)。3. 2. 3轉(zhuǎn)基因植株表型分析
將轉(zhuǎn)基因陽性鑒定植株與同期生長野生型植株進(jìn)行比較、表型觀察。
3. 2. 4 轉(zhuǎn)基因植株 real-time PCR 檢測(cè)
分別取野生型、轉(zhuǎn)基因植株葉片液氮研磨后提取RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，操作步驟如實(shí)施例 1所述。分別取野生型、轉(zhuǎn)基因植株cDNA，以水稻內(nèi)參基因UCTim為對(duì)照進(jìn)行實(shí)時(shí)定量 PCR分析。OsZRL基因定量PCR擴(kuò)增引物為RTZRLF和RTZRLR MCTJtV基因RT-PCR擴(kuò)增引物為RTACTF和RTACTR。引物序列如下
RTZRLF :5’ - GGATGAAGAAGACGATGATGACG -3’ RTZRLR :5’ - CGATCCCTCGCTATGTACTTGC -3’ RTACTF :5’ -AGTGATTGCACCACCAGAAAGA -3’ RTACTR 5' -CAGGACCAGATTCATCATACTCG -3，
實(shí)時(shí)定量反應(yīng)條件95° C 30 s ；95° C 5 s,60° C 20 s，40個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增后，樣品在95° C保持15 s,60° C保持1 min，然后每15 s上升0.5° C進(jìn)行溶解曲線分析。每個(gè)樣品重復(fù)三次。PCR 反應(yīng)在 Applied Biosystems Step-One RT-PCR system 上運(yùn)行。4、結(jié)果
4. 1轉(zhuǎn)基因水稻植株表型觀察
經(jīng)組織培養(yǎng)和抗性篩選獲得40株再生水稻植株，其中共有7株轉(zhuǎn)基因小苗因根系不能正常發(fā)育。圖4A顯示OX-I 0X-4轉(zhuǎn)基因植株根系發(fā)育不良，植株整體褪綠發(fā)白。將 OX-I 0X-4植株移入土壤生長約一周后萎蔫死亡(圖4B)。0X-5 0X-7持續(xù)在封閉培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，雖然有較多幼莖、葉生長，但由于始終只有極少根系發(fā)育，影響植株地上部分生長，莖葉褪綠發(fā)白，部分開始萎蔫死亡(圖4C)。4. 2轉(zhuǎn)基因植株鑒定 4.2.1轉(zhuǎn)基因陽性植株鑒定
禾IJ用潮霉素抗性標(biāo)記基因(φ )序列對(duì)轉(zhuǎn)基因、野生型水稻葉片基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)。陽性轉(zhuǎn)基因植株擴(kuò)增出φ 目標(biāo)條帶(560bp)，而野生型植株未能擴(kuò)增出目標(biāo)條帶。檢測(cè)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因根系不發(fā)育植株(0X-5 0X-7)、根系發(fā)育正常植株(0X-8、0X-9) 均為陽性轉(zhuǎn)基因植株(圖5)。4. 2. 2轉(zhuǎn)基因水稻陽性植株OsZRL基因表達(dá)分析
Real-time PCR分析結(jié)果顯示，AsZ見過表達(dá)水稻轉(zhuǎn)基因陽性植株中，3個(gè)獨(dú)立的根系不發(fā)育植株(0X-5 見基因較根系發(fā)育植株(0X-8、0X-9)及野生型顯著提高(圖 6)。由此表明，ifeZTPZ基因在水稻根系發(fā)育中具有負(fù)調(diào)控作用，其表達(dá)量升高將會(huì)明顯抑制水稻的根系發(fā)育。實(shí)施例4 ,OsZRL基因RNA干涉重組質(zhì)粒的構(gòu)建 1、試劑
Taq DNA聚合酶、pMD18_T載體購于TaKaRa公司，其它試劑與實(shí)施例2相同。2、農(nóng)桿菌菌株和植物表達(dá)載體與實(shí)施例2相同。3、培養(yǎng)基
與實(shí)施例2相同。4、方法4. IOsZRL基因片段的獲得 4. 1. 1 PCR
根據(jù)SEQ ID N0:1所示核苷酸序列起始密碼子下游1112bp至1546bp的基因片段設(shè)計(jì)構(gòu)建真核重組質(zhì)粒的引物如下
ZRLIFl 5’ -CTCGAGGATCCGAATCATACGCTTCGACGAC-3’ ZRLIRl 5’ -AAGCTTCGATCAATCATTAGATGCTGA-3’ ZRLIF2: 5’ -GAGCTCGAATCATACGCTTCGACGAC-3‘ ZRLIR2: 5' -GAATTCGATCAATCATTAGATGCTGA-3‘ 以ZRLIFl和ZRLIRl為正向片段擴(kuò)增引物，以ZRLIF2和ZRLIR2為反向片段擴(kuò)增引物， 按下面的PCR反應(yīng)體系以及以下程序進(jìn)行擴(kuò)增預(yù)變性94° C 4 min，變性94° C 30 s，退火溫度58° C 20 s延伸72° C 20 s，所述變性-復(fù)性-延伸30個(gè)循環(huán)；72° C 10 min (終延伸)。 10XPCR Buffer2Mg2+ (1. 5 mM)1.2 μ LdNTP Mixture (各 2· 5 mM)0.6 μ菌液1μ LZRLIF0. ^t μ LZRLIR0. ^t μ LddH2013.4 μ LTaq DNA聚合酶1μ L
4.1.2目的基因片段與克隆載體pMDIS-T的連接 PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體連接反應(yīng)體系如下 IOX ligase BufferIyL
PMD18-T (50 μ g/ μ L)IyL
PCR 產(chǎn)物( 150 μ g/μ L)3 yL
T4 Ligase (350 U/μ L)IyL
ddH204 μ L
16° C連接過夜。
4. 1. 3連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化(操作步驟見實(shí)施例1中4. 4) 4. 1. 4菌落PCR鑒定重組質(zhì)粒(操作步驟見實(shí)施例1中4. 6)
對(duì)菌落PCR確定的重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與基因序列進(jìn)行比對(duì)，確定所擴(kuò)增片段為目的基因片段。4. 2 pSK中間載體的構(gòu)建
4. 2. 1質(zhì)粒提取、DNA片段酶切回收
將測(cè)序正確的正向基因片段和PSK載體，分別提取質(zhì)粒，然后以Xho !,Hind III進(jìn)行雙酶切、DNA片段回收，操作步驟見實(shí)施例2中4. 1,4. 2。4. 2. 2正向基因片段與pSK載體的連接
將正向基因片段、PSK載體酶切回收產(chǎn)物進(jìn)行連接，連接反應(yīng)體系如下 pSK7 μ L正向基因片段 10 μ L
T4連接酶 1 μ L
10XT4連接緩沖液 2 μ L
16° C反應(yīng)12小時(shí)后進(jìn)行轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化操作步驟見實(shí)施例1中4. 4。4. 2. 3反向基因片段與已連有正向基因片段的pSK載體的連接
將測(cè)序正確的反向基因片段和已連有正向基因片段的PSK載體，以feoT I.Sac I進(jìn)行雙酶切后分別。將反向基因片段、已連有正向基因片段的PSK載體的酶切回收產(chǎn)物進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化。4. 3真核重組質(zhì)粒的獲得
將含有正向基因片段和反向基因片段的PSK中間載體用漢I.Sac I雙酶切，同時(shí)將 PHB真核表達(dá)載體用ife // I.Sac I雙酶切后，分別回收、連接，并進(jìn)行轉(zhuǎn)化。通過以上操作，獲得AsZ見基因RNA干涉真核重組質(zhì)粒，命名為pHB-OsZRLRi (如圖7、圖8所示)。4. 4農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化
將PHB-OsZRLRi重組質(zhì)粒進(jìn)行農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化、陽性克隆鑒定，操作步驟同實(shí)施例2中4. 5、 4. 6。鑒定結(jié)果表明，獲得了用于轉(zhuǎn)基因的RNA干涉陽性農(nóng)桿菌克隆。實(shí)施例5 ,OsZRL基因RNA干涉轉(zhuǎn)基因水稻植株的獲得 1、試劑
與實(shí)施例3相同。2、培養(yǎng)基
與實(shí)施例3相同。3、方法
3. 1農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化水稻實(shí)驗(yàn)步驟與實(shí)施例3中3. 1相同。3.2轉(zhuǎn)基因植株的鑒定
3. 2. 1水稻基因組DNA的提取
分別取野生型、轉(zhuǎn)基因植株葉片提取基因組DNA，實(shí)驗(yàn)步驟與實(shí)施例3中3. 2. 1相同。3.2.2陽性轉(zhuǎn)基因植株鑒定
分別以野生型、轉(zhuǎn)基因植株基因組DNA為模板，對(duì)水稻潮霉素抗性標(biāo)記基因QlPt~)進(jìn)行 PCR擴(kuò)增。實(shí)驗(yàn)步驟與實(shí)施例3中3. 2. 1相同。3. 2. 3轉(zhuǎn)基因植株表型分析
將轉(zhuǎn)基因陽性鑒定植株與同期生長野生型植株進(jìn)行比較、表型觀察。3. 2. 4轉(zhuǎn)基因植株RT-PCR檢測(cè)
分別提取野生型、轉(zhuǎn)基因水稻植株葉片的RNA、反轉(zhuǎn)錄(操作步驟如實(shí)施例1所述)，進(jìn)行RT-PCR分析，同時(shí)以水稻內(nèi)參基因UCTim做為對(duì)照。OsZRL基因RT-PCR擴(kuò)增引物為 ZRLIF :5’ -GAATCATACGCTTCGACGAC-3，
ZRLIR :5’ -CGATCAATCATTAGATGCTGA-3’ 按以下程序進(jìn)行擴(kuò)增94° C 4 min (預(yù)變性)；94° C 30 s (變性)，58° C 20s (復(fù)性)，72° C 20 s (延伸)，所述變性-復(fù)性-延伸27個(gè)循環(huán)；72° C 10 min (終延伸)。JCTJtV基因RT-PCR擴(kuò)增引物為 ACTF :5’ -AAGATCCTGACGGAGCGTGGTTAC-3’ ACTR 5' -CTTCCTAATATCCACGTCGCACTTC-3'
按以下程序進(jìn)行擴(kuò)增94° C 5 min (預(yù)變性)；94° C 30 s (變性)，59° C 30 s (復(fù)性)，72° C 20 s (延伸)，所述變性-復(fù)性-延伸27個(gè)循環(huán)；72° C 10 min (終延伸)。4、結(jié)果
4. 1轉(zhuǎn)基因水稻植株表型觀察
經(jīng)組織培養(yǎng)和抗性篩選獲得15個(gè)獨(dú)立的再生水稻植株。與野生型植株相比，基因RNA干涉下調(diào)轉(zhuǎn)基因植株根系發(fā)達(dá)，莖桿、植株粗壯。圖9顯示轉(zhuǎn)基因植株(Ri-I)的生長情況。4. 2轉(zhuǎn)基因植株鑒定 4.2.1轉(zhuǎn)基因陽性植株鑒定
禾IJ用潮霉素抗性標(biāo)記基因(φ )序列對(duì)轉(zhuǎn)基因、野生型水稻葉片基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)。陽性轉(zhuǎn)基因植株擴(kuò)增出φ 目標(biāo)條帶(560bp)，而野生型植株未能擴(kuò)增出目標(biāo)條帶 (圖 10)。4. 2. 2轉(zhuǎn)基因水稻陽性植株OsZRL基因表達(dá)分析
RT-PCR分析結(jié)果顯示，在3個(gè)根系發(fā)達(dá)，莖桿、植株粗壯的獨(dú)立轉(zhuǎn)基因植株(Ri-I Ri-3)中’ OsZRL基因表達(dá)量較野生型顯著降低(圖11)。
權(quán)利要求
1.一種控制水稻根系發(fā)育的基因《SZTPZ，其特征在于，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO :1所示；所編碼蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO :2所示，其編碼序列在第 211-233位氨基酸有一個(gè)C2H2型鋅指(zinc-finger)結(jié)構(gòu)域，第298-320位氨基酸有一個(gè) C2HC 型鋅指結(jié)構(gòu)域；命名為 OsZRL {Oryza sativa Zinc-finger Rootless)。
2.—種AsZTPZ基因的過表達(dá)真核重組質(zhì)粒，其特征在于，是將SEQ ID NO :1所述基因全長編碼序列插入到真核表達(dá)載體中獲得。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述AsZTPZ基因的過表達(dá)真核重組質(zhì)粒，其特征在于，所述真核表達(dá)載體為 pHB、pCAMBIA1301、pTCK303 中的一種。
4.一種OsZRL基因的RNA干涉真核重組質(zhì)粒，其特征在于，由序列表中SEQ ID NO 1 所示核苷酸序列中的基因片段和真核表達(dá)載體構(gòu)成，所述基因片段是位于起始密碼子下游 1112bp至1546bp的核苷酸序列，將所述基因片段正向和反向插入真核表達(dá)載體，正向插入的基因片段與反向插入的基因片段之間存在有150bp的內(nèi)含子序列。
5.如權(quán)利要求4所述OsZRL基因的RNA干涉真核重組質(zhì)粒的制備方法，其特征在于，包括如下步驟(1)在序列表中SEQID NO :1所示核苷酸序列中選擇一段基因片段，所選擇的基因片段是位于起始密碼子下游1112bp至1546bp的核苷酸序列，將所述基因片段正向插入到質(zhì) SpSK載體上形成中間載體，再將該基因片段反向插入已含正向插入基因片段的pSK中間載體，正向插入的基因片段與反向插入的基因片段之間存在有150bp的內(nèi)含子序列；(2)利用限制性內(nèi)切酶切下pSK中間載體上含有正向插入與反向插入的基因片段的部分，然后連接到真核表達(dá)載體上，即獲真核重組質(zhì)粒。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述OsZRL基因的RNA干涉真核重組質(zhì)粒，其特征在于，所述真核表達(dá)載體為 pHB、pCAMBIA1301、pTCK303 中的一種。
7.一種影響水稻根系發(fā)育的方法，其特征在于，將權(quán)利要求2或4所述真核重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化水稻，獲得轉(zhuǎn)基因植株。
8.權(quán)利要求1所述控制水稻根系發(fā)育的基因，在水稻根系發(fā)育和性狀改良中的應(yīng)用。
全文摘要
一種控制水稻根系發(fā)育的基因OsZRL，其核苷酸序列如序列表中SEQIDNO1所示。將SEQIDNO1所述基因全長編碼序列、SEQIDNO1所述基因片段正向和反向插入到真核載體中，獲得本發(fā)明所述OsZRL基因過量表達(dá)、RNA干涉真核重組質(zhì)粒。將上述真核重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化水稻，獲得OsZRL過表達(dá)、RNA干涉轉(zhuǎn)基因植株。實(shí)驗(yàn)表明本發(fā)明所述SEQIDNO1基因能夠調(diào)控水稻的根系發(fā)育；與野生型植株相比，OsZRL過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株根系發(fā)育受到明顯抑制，而OsZRL下調(diào)轉(zhuǎn)基因植株根系發(fā)達(dá)，莖桿、植株粗壯。因此，本發(fā)明所述基因?qū)λ靖蛋l(fā)育具有負(fù)調(diào)控作用，并可在水稻性狀改良中應(yīng)用。
文檔編號(hào)C07K14/415GK102286491SQ20111022261
公開日2011年12月21日 申請(qǐng)日期2011年8月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月23日
發(fā)明者劉永勝, 曾正明, 牛向麗, 玉曉紅, 苗雁文 申請(qǐng)人:重慶大學(xué)