專利名稱：水稻冠根控制基因crl3及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于植物基因工程領域。具體的說，本發(fā)明涉及一種利用圖位克隆技術克隆的水稻CRL3(crown rootless3)基因，以及轉基因互補功能實驗鑒定該基因；還涉及利用該基因物調控水稻冠根發(fā)生能力從而調節(jié)水稻的根系結構提高農作物的產量。
背景技術：
水稻根系由種子根和大量的冠根以及側根組成，冠根是其最重要的組成部分。冠根為胚后發(fā)育的器官，在水稻的莖節(jié)位產生。正常發(fā)育過程中，在水稻的各個節(jié)位都有冠根原基發(fā)生，但是一般只有在未伸長的基部節(jié)位的冠根原基才能發(fā)育并突破表皮形成冠根。水稻冠根的發(fā)生發(fā)育過程可以劃分為12個連續(xù)的階段(Kawata and Harada，1975)，冠根原基起始于幾個中柱鞘細胞平周分裂，產生內外兩層細胞，外層細胞發(fā)育為表皮、內皮層、皮層和根冠，而內層形成維管組織，進一步的平周分裂，外層細胞分化為表皮、內皮和根冠，邊緣部分的細胞分化為皮層，并不斷分裂增加皮層數目，到這個階段冠根原基基本形成，包括除維管束的全部組織。在形態(tài)結構上，冠根與主根和側根構造幾乎完全相同，包括表皮、皮層、維管柱等結構，具有根冠、分生區(qū)、伸長區(qū)和成熟區(qū)等特征。
水稻是世界上最重要的糧食作物之一，冠根是其起固著、養(yǎng)分、水分吸收的主要器官，因此也是決定水稻生長與產量的重要因子。通過生物技術調節(jié)水稻的冠根數目，進行分子育種研究有著非常良好的應用前景。盡管冠根對水稻生長發(fā)育有非常重要的作用，但是對于控制冠根發(fā)生發(fā)育的相關基因和分子機制仍不清楚。對水稻冠根發(fā)生發(fā)育遺傳機制的研究也是非常有限，目前僅有Inukai和Miwa報道的水稻冠根數目減少的突變體crl1，crl2(crl，crown rootless)。尚無有關控制冠根發(fā)生的基因的報道。

發(fā)明內容
針對現(xiàn)有技術中存在的技術問題，本發(fā)明提供一種能使水稻具有良好根系結構的蛋白質及其基因，以及由此獲得的轉基因植物細胞，和利用所述基因對水稻冠根進行改造的方法。
本發(fā)明為達到以上目的，是通過這樣的技術方案來實現(xiàn)的提供一種水稻冠根控制基因CRL3編碼的蛋白質，其具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
作為本發(fā)明的一種改進上述氨基酸序列還包括在Seq ID No.2所示的氨基酸序列中添加、取代、插入和缺失一個或多個氨基酸生成的衍生物。
本發(fā)明還提供一種編碼上述兩種蛋白質或其功能類似物的基因，其具有Seq ID No.1所示的核苷酸序列。
作為本發(fā)明的一種改進上述核苷酸序列還包括在Seq ID No.1所示的核苷酸序列中添加、取代、插入和缺失一個或多個核苷酸生成的突變體、等位基因和衍生物。
本發(fā)明還提供一種包含上述兩種核酸的轉基因植物細胞。
本發(fā)明還提供一種對水稻冠根進行改造的方法，包括用具有Seq ID No.1所示的核苷酸序列的基因轉化水稻細胞，再將轉化后的水稻細胞培育成植株。
進一步具體的說本發(fā)明的目的是提供一種從水稻突變體crl3中克隆的新基因CRL3，如圖6和Seq ID No.1所示的DNA序列，也包括與Seq ID No.1所示的DNA序列至少有70％同源性的基因序列。本發(fā)明中的Seq ID No.2和圖7所示的蛋白質屬于LBD基因家族，其中進行一個或幾個替換，插入或缺失所獲得的功能類似物。另外，也包括在Seq ID No.1中添加、取代、插入或缺失一個或多個核苷酸而生成的突變體、等位基因或衍生物，具有相同功能的序列也能達到本發(fā)明的目的。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種用CRL3基因進行高效的植物轉化的方法，具體地說，本發(fā)明提供了具有Seq ID No.1和圖6所示的序列的基因或基因部分片段的載體，其中，如圖5所示的pc5-5和pc-RNAi，該載體可以表達有上述核苷酸序列編碼的多肽或其同源類似物。
本發(fā)明還提供了一種利用植物表達載體轉化植物細胞影響水稻冠根發(fā)生能力的方法。
實現(xiàn)本發(fā)明的具體技術步驟如下一、水稻冠根缺失突變體crl3的分離和遺傳分析通過大量篩選突變體，本發(fā)明獲得了一個水稻冠根缺失突變體crl3，通過與野生水稻正反交實驗，我們獲得了一個符合單基因控制的遺傳規(guī)律的隱性突變體，如圖1所示。
二、圖位克隆控制水稻冠根的CRL3基因1)、CRL3基因的初步定位為了分離CRL3基因，本發(fā)明采用圖位克隆的方法，首先創(chuàng)建了一個F2定位群體，由crl3雜合體(粳稻中花-11號)為母本，選用秈稻Kasalath為父本雜交獲得的F2中的隱性個體組成。并利用SSLP分子標記對CRL3位點進行初步定位見圖2。定位結果表明，CRL3初步定位在第3染色體短臂介于RM6301和RM6883兩個標記之間。
2)、CRL3基因的精細定位通過對RM6301和RM6883兩個標記之間的BAC序列分析，發(fā)展新的STS標記將CRL3精確定位于BAC OSNJBb0050N02上STS9標記附近20kb范圍之內(圖3)，通過分析此區(qū)段開放閱讀框(ORF)推測候選基因。
3)、CRL3基因的鑒定和功能分析通過轉基因技術，結果表明本發(fā)明獲得了使突變體恢復正常功能的轉基因水稻(圖5)，證明了本發(fā)明正確克隆了CRL3基因(圖6)，氨基酸序列分析表明CRL3蛋白屬于LBD基因家族(圖7)。
三、抑制CRL3基因在水稻中的表達通過RNAi和轉基因技術抑制CRL3基因在水稻中的表達，獲得了冠根數目減少的轉基因水稻，冠根數目與CRL3基因的表達量相關，證明CRL3基因表達能夠調節(jié)冠根的數目。(圖8)我國目前存在耕地面積減少，水分及不可再生化肥資源短缺的危機。迫切需要培育高產高效水稻品種，良好的根系結構是決定水稻產量和水分養(yǎng)分吸收效率的基礎，基因工程技術的發(fā)展使得應用CRL3基因調整水稻根系結構和組成成為可能。本發(fā)明的crl3(crown rootless3)突變體，是單基因隱性突變，符合孟德爾方式遺傳規(guī)律。Crl3突變體由本發(fā)明者分離獲得。本發(fā)明通過圖位克隆技術獲得控制水稻冠根性狀的基因CRL3，并通過轉基因功能互補實驗鑒定了該基因的功能。因而，本發(fā)明能使水稻具有良好的根系結構，從而促進水分養(yǎng)分吸收效率，最終能提高水稻產量。


圖1是水稻冠根缺失突變體crl3的表型；圖2是CRL3基因在水稻第3染色體上的初步定位圖；圖3是CRL3基因的精細定位；圖4是pc5-5和pc-RNAi載體圖譜；圖5是功能互補實驗T1代轉基因水稻的表型。1中花11；2crl3；3T1-1；4T1-2；圖6是CRL3基因的DNA序列；圖7是CRL3基因編碼的氨基酸序列；圖8是RNAi(CRL3)轉基因水稻的冠根數。
具體實施例方式
實施例11、水稻(Oryza sativa ssp.zhonghual1)突變體crl3(crown rootless 3)，原始野生材料為中花11。
2、水稻材料的培養(yǎng)條件水稻種子用蒸餾水洗凈，放于培養(yǎng)皿中，37℃黑暗條件下浸種至露白(1天)，然后轉移至濕潤濾紙上30℃培養(yǎng)2天；將發(fā)芽的種子轉移至尼龍紗網上，生長7天(生長條件同上)。將生長7天的幼苗小心的從紗網上取下，移栽到PVC板的海綿球上繼續(xù)在水稻營養(yǎng)液中培養(yǎng)。
水稻培養(yǎng)條件
光溫可控水稻培養(yǎng)室溫度控制白天28-30℃，夜晚20-22℃光照時間7:00-19:00光照強度250-300umol.m-2.s-1水稻培養(yǎng)液PH5.0，每天調節(jié)一次，培養(yǎng)液每4天更換一次。
水稻培養(yǎng)液母液配方(國際水稻所) 使用時，每4L培養(yǎng)液中加1號-6號貯備液，各5ml。
3、分析和定位群體雜合體(crl3)和原始野生型品種中花11進行正交和反交，F(xiàn)1代自交，在F2代水稻溶液培養(yǎng)14天后，統(tǒng)計野生型和冠根缺失表型個體的數目，并用統(tǒng)計學方法計算分離比例。F2定位群體是由雜合體(crl3)[粳稻]和秈稻品種kasalath雜交獲得的，總共鑒定出1880個冠根缺失表型的F2個體，取0.1克左右的嫩葉，用來提取總DNA。
4、通過SSLP和STS標記定位CRL3基因采用水稻微量DNA的快速提取方法從水稻葉片中提取用于基因定位的基因組DNA。取大約0.1g水稻幼嫩葉片，經液氮冷凍，在1.5ml的離心管中將葉片磨成粉末，提取總DNA，獲得的DNA溶解于200μl無菌水中。每個SSLP和STS反應用2μl DNA樣品。
在CRL3基因的初步定位試驗中，對94個F2個體進行SSLP分析。根據公布的粳稻和秈稻創(chuàng)建的分子遺傳圖譜，選取近似均勻分布于各條染色體上的SSLP引物，根據已知的反應條件進行PCR擴增，然后在6％的丙烯酰胺凝膠電泳分離，檢測PCR產物的多態(tài)性。
在精細定位CRL3基因時，對由1880F2個體組成的群體進行STS分析。根據分子標記RM6301和RM6883之間的BAC序列和公布的kasalath BAC末端序列，我們設計了3個STS分子標記(STS1，STS7，STS9)，引物序列為STS1U-5’AGTTATGGTGAAATGTGCTTG3’，STS1L-5’AAATCTCTTTAAAAGAACTCG3’；STS7U-5’ACTTCGGAGAGAGTTCATACC3’，STS7L-5’TAACTTGGCGAATCAG3’；STS9U-5’GGGAAGGTATTTATTTGAAGTTT3’，STS9L-5’TTCATAACTAATATGTGTAGCGTG3’。
利用這3個STS分子標記對1880F2個體進行連鎖分析。
5、基因預測和比較分析根據精細定位的結果，CRL3基因位于BAC克隆OSNJBb0050N02上STS9標記附近20kb范圍之內。根據BAC克隆OSNJBb0050N02序列，設計20對引物，采用PCR方法分別從crl3和野生型中花11的基因組中擴增出這20kb(共20個DNA片段)，進行測序分析。發(fā)現(xiàn)第18對引物擴增的產物突變體crl3比野生型中花11缺少20bp。將這結果重復驗證兩次，發(fā)現(xiàn)突變體crl3基因組都缺少這20bp。根據BAC克隆OSNJBb0050N02序列的基因注釋信息(NCBI)，發(fā)現(xiàn)20bp缺失位于一個具有LOB結構域的LBD基因。
實施例2植物轉化將BAC克隆OSNJBb0050N02用HindIII不完全酶切，電泳分離后，割取5-10kb的DNA片段連接到pCAMBIA2301中，測序分析發(fā)現(xiàn)一個5.4kb的片段包括CRL3完整的ORF區(qū)，3.7kb的上游序列連接到pCAMBIA2301，所以獲得了用于轉化的質粒pC5-5(圖4)。這個質粒通過電擊的方法轉入農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)株系EHA105中轉化水稻。將F3個體[F2中的突變個體單株收獲F3個體，F(xiàn)3個體早期(3周內)仍然缺少冠根]的成熟種子脫殼、消毒，經過誘導培養(yǎng)基培養(yǎng)3周后，挑選生長旺盛愈傷用作轉化的受體。用含有雙元質粒載體的EHA105菌株侵染水稻愈傷，在黑暗、25℃條件下培養(yǎng)3天后，在含有150mg/L G418的選擇培養(yǎng)基上篩選抗性愈傷和轉基因植株。將G418抗性植株，轉到溶液培養(yǎng)2周后，轉到水田栽培收獲T1代(圖5)。
以上所述僅為本發(fā)明的若干個具體實施方式
，應當指出，對于本領域的普通技術人員能從本發(fā)明公開的內容直接導出或聯(lián)想到的所有變形，均應認為是本發(fā)明的保護范圍。
序列表SEQ ID NO1atgacgggat ttggatcgcc gtgcggcgcg tgcaagtttc tgcggcgcaa gtgcgtgcgc60gggtgcgtgt tcgcgccata cttctgccac gagcaagggg cggcgcactt cgccgccatc120cacaaggtgt tcggcgccag caacgtgtcc aagctgctcg cccacctgcc gctcgccgac180cgccccgagg ccgccgtcac tatctcctac gaggcgcagg cccgcctccg cgaccccatc240tatggctgcg tcgcccacat cttcgccctc cagcagcagg tgatgacgct gcaggcgcag300ctggcgtcgc tcaaggcggc ggcggcgcaa gggatacacc accaggacgt cggcgccacc360accaagggcg gctacatgag cgccgccgcc accgccgccg acgaccaatt agggtacggc420ggctacaacc agtggtgcgg cagcaatggg ggcggcgcgc cggcggcgtc gcagccgggc480gcgtatagca gcaatggcgg cgccggccac ggccacgact ccatcaccgc gctgctggcg540gccgggtcgg actacatgca gcactcgctg taccacgcgt tcgagcactc ggagggcgcc600ggcgccgtgg acgacgggca cgcggccgcc gcggccttcg aggcggcggc ggagtcgtcg660tcgtgcggca tggcggcgtc gttcgccgcc gacgagagcg tgtggaggtc gtcgtcgtcg720ggataccaag attgcgagga tctccagagc gtcgcctacg cttaccttaa ccgctcgtaa780SEQ ID NO2Met Thr Gly Phe Gly Ser Pro Cys Gly Ala Cys Lys Phe Leu Arg Arg15 10 15Lys Cys Val Arg Gly Cys Val Phe Ala Pro Tyr Phe Cys His Glu Gln20 25 30Gly Ala Ala His Phe Ala Ala Ile His Lys Val Phe Gly Ala Ser Asn35 40 45
Val Ser Lys Leu Leu Ala His Leu Pro Leu Ala Asp Arg Pro Glu Ala50 55 60Ala Val Thr Ile Ser Tyr Glu Ala Gln Ala Arg Leu Arg Asp Pro Ile65 70 75 80Tyr Gly Cys Val Ala His Ile Phe Ala Leu Gln Gln Gln Val Met Thr85 90 95Leu Gln Ala Gln Leu Ala Ser Leu Lys Ala Ala Ala Ala Gln Gly Ile100 105 110His His Gln Asp Val Gly Ala Thr Thr Lys Gly Gly Tyr Met Ser Ala115 120 125Ala Ala Thr Ala Ala Asp Asp Gln Leu Gly Tyr Gly Gly Tyr Asn Gln130 135 140Trp Cys Gly Ser Asn Gly Gly Gly Ala Pro Ala Ala Ser Gln Pro Gly145 150 155 160Ala Tyr Ser Ser Asn Gly Gly Ala Gly His Gly His Asp Ser Ile Thr165 170 175Ala Leu Leu Ala Ala Gly Ser Asp Tyr Met Gln His Ser Leu Tyr His180 185 190Ala Phe Glu His Ser Glu Gly Ala Gly Ala Val Asp Asp Gly His Ala195 200 205Ala Ala Ala Ala Phe Glu Ala Ala Ala Glu Ser Ser Ser Cys Gly Met210 215 220
Ala Ala Ser Phe Ala Ala Asp Glu Ser Val Trp Arg Ser Ser Ser Ser225 230 235 240Gly Tyr Gln Asp Cys Glu Asp Leu Gln Ser Val Ala Tyr Ala Tyr Leu245 250 255Asn Arg Ser
權利要求
1.一種水稻冠根控制基因CRL3編碼的蛋白質，其特征在于具有SEQID NO2所示的氨基酸序列。
2.根據權利要求1所述的稻冠根控制基因CRL3編碼的蛋白質，其特征在于所述氨基酸序列還包括在Seq ID No.2所示的氨基酸序列中添加、取代、插入和缺失一個或多個氨基酸生成的衍生物。
3.一種編碼權利要求1或2所述蛋白質或其功能類似物的基因，其特征在于所述基因具有Seq ID No.1所示的核苷酸序列。
4.根據權利要求3所述的編碼權利要求1或2所述蛋白質或其功能類似物的基因，其特征在于所述核苷酸序列還包括在Seq ID No.1所示的核苷酸序列中添加、取代、插入和缺失一個或多個核苷酸生成的突變體、等位基因和衍生物。
5.一種包含權利要求3或4所述核酸的轉基因植物細胞。
6.一種對水稻冠根進行改造的方法，其特征在于包括用權利要求3所述的基因轉化水稻細胞，再將轉化后的水稻細胞培育成植株。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種水稻冠根控制基因CRL3編碼、具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列的蛋白質，和具有Seq ID No.1所示的核苷酸序列的基因；還公開了一種轉基因植物細胞，和用基因轉化水稻細胞、再將轉化后的水稻細胞培育成植株的水稻冠根改造方法。本發(fā)明能利用該基因物調控水稻冠根發(fā)生能力，從而調節(jié)水稻的根系結構，提高農作物的產量。
文檔編號C12N15/29GK1587415SQ20041005357
公開日2005年3月2日 申請日期2004年8月6日 優(yōu)先權日2004年8月6日
發(fā)明者吳平, 劉洪家, 余曉波, 何曉薇, 吳運榮, 王首鋒, 金維正 申請人:浙江大學