專利名稱：一種水稻根系長度相關(guān)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及水稻的蛋白和基因，具體涉及一種水稻根系長度相關(guān)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
根系是植物從土壤中吸收水分和氮、磷、鉀等各種養(yǎng)分的主要器官。根系能合成氨基酸、植物激素等生物活性物質(zhì)，如ΙΑΑ、ABA、乙酰膽堿等，這些物質(zhì)除了參與根系發(fā)育外， 還能調(diào)節(jié)地上部的生長和發(fā)育。此外，根系所具有的分泌有機酸、酶、生物堿等物質(zhì)的能力， 影響其對土壤中的礦物質(zhì)的吸收和根際微生物的種類和數(shù)量。而根系的長度是根構(gòu)型的一個重要指標，根系長度影響了許多重要的性狀，如養(yǎng)分吸收、抗倒伏性、抗旱性和產(chǎn)量等。β-1，4-葡聚糖內(nèi)切酶(ii-U-endoglucanase，EGase)屬于糖苷鍵水解酶 (GlycosideHydrolases, GH)大類的第九家族(GH9)的A亞類，最早歸為纖維素酶，其主要作用是水解可溶性纖維素衍生物內(nèi)的糖苷鍵(Molhoj, 2001 ；Urbanowicz et al.，2007)。 β-1，4-葡聚糖內(nèi)切酶在植物的生長發(fā)育中有重要作用，能影響擬南芥下胚軸的細胞壁的形成與細胞的伸長(Nicol et al. ,1998)；與擬南芥細胞的伸長和細胞壁纖維素的合成相關(guān)，并與溫度相關(guān)(Sato S，2001)，在水稻中，與節(jié)間細胞伸長和細胞壁纖維素的合成相關(guān) (Zhouet al.，2006)。KSRl在水稻中的克隆，將有助于闡明葡聚糖內(nèi)切酶在水稻根系伸長方面的作用，在水稻根系育種中具有一定的應(yīng)用價值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種水稻根系長度相關(guān)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用，該蛋白屬β-1，4-葡聚糖內(nèi)切酶，在氨基酸取代或缺失等情況下，能抑制水稻根系的伸長，使水稻出現(xiàn)短根現(xiàn)象，可以為水稻的根系改良和雜交育種或轉(zhuǎn)基因植物的開發(fā)創(chuàng)造了條件。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為提供一種水稻根系長度相關(guān)蛋白，命名為KSRl，來源于水稻，KSRl是如下a)或b)的蛋白a)由序列表中SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；b)在序列表SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列中經(jīng)過取代和/或缺失和/或添加一個或幾個氨基酸且與水稻根系長度相關(guān)的由a)衍生的蛋白質(zhì)。SEQ ID NO :2氨基酸序列由623個氨基酸殘基組成，屬于β _1，4葡聚糖內(nèi)切酶家族，與根系長度相關(guān)。上述b)中的KSRl可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進行生物表達得到。上述b)中的KSRl的編碼基因可通過將序列表中SEQ ID NO :1所示的DNA序列中缺失一個或幾個氨基酸殘基的密碼子，和/或進行一個或幾個堿基對的錯義突變。編碼所述KSRl的基因也屬于本發(fā)明的保護范圍。KSRl基因具體可分為1)或2)或3)的基因
1)其核苷酸序列是序列表中SEQ ID NO=I所示的DNA分子；2)在嚴格條件下可與序列表SEQ ID NO 1限定的DNA序列雜交且編碼上述與根系長度相關(guān)蛋白的DNA分子；3)與1)的基因有90%以上的同源性，且編碼上述與根系長度相關(guān)蛋白的DNA分子。SEQ ID NO 1序列由1872個堿基組成，自5端第1_3位為起始密碼子，編碼具有序列表中SEQ ID NO :2所示的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)；該氨基酸序列為β _1，4葡聚糖內(nèi)切酶類，具有四個外顯子和三個內(nèi)含子。若基因的堿基序列的1591bp位的鳥嘌呤(G)被胸腺嘧啶(T)取代，編碼的氨基酸殘基序列的531位甘氨酸(Gly)突變?yōu)樯彼?Trp)；若 1546bp位的鳥嘌呤被胸腺嘧啶取代，編碼的β -1,4-葡聚糖內(nèi)切酶的516位甘氨酸(Gly) 突變?yōu)榫彼?Arg)，若178bp位腺嘌呤被胸腺嘧啶取代，導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成的提前終止。含有KSRl基因的重組載體、轉(zhuǎn)基因細胞系和重組菌也屬于本發(fā)明的保護范圍。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于一種水稻根系長度相關(guān)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用，該蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO :2所示，屬于β _1，4葡聚糖內(nèi)切酶家族， 與根系長度相關(guān)；該蛋白的編碼基因如序列表SEQ ID NO :1所示的堿基序列，該堿基序列若發(fā)生突變，如1591bp位的鳥嘌呤被胸腺嘧啶取代，編碼的蛋白的531位Gly變?yōu)門rp，如 1546bp位的鳥嘌呤被胸腺嘧啶取代，編碼的蛋白的516位Gly變?yōu)锳rg，如178bp位腺嘌呤被胸腺嘧啶取代，導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成的提前終止，這樣該蛋白就抑制節(jié)間細胞的伸長和細胞壁纖維素合成，具體在植株表現(xiàn)為短根系，突變體根長只有正常野生型根長的20%左右。該蛋白及其編碼基因的應(yīng)用，可以為水稻的根系改良和雜交育種或轉(zhuǎn)基因植物的開發(fā)創(chuàng)造了條件。


圖1水稻短根突變體KSRl的表型，左邊為野生型，右邊為突變體KSRl ；A表示植株表型，B表示根系表型。
具體實施例方式以下結(jié)合附圖、實施例對本發(fā)明作進一步詳細描述。實施例1突變體的表型及遺傳分析/AEMS(ethyl methylsulfonate) 白勺_山禾g (Oryza Sativa L. ssp indica) ηππ 種Kasalath突變體庫中篩選到一個水稻短根突變體ksrl。取生長于32°C條件下6天的的幼苗進行觀察，發(fā)現(xiàn)突變體ksrl的地上部與野生型沒有顯著差異，ksrl不定根和單位根長的側(cè)根數(shù)目與野生型沒有顯著的差異，但不定根和側(cè)根均比野生型短，突變體ksrl根長為3. 12士0. 38cm，野生型根長為15.16cm，突變體ksrl根長只有野生型的20%左右 (圖 1)。以突變體ksrl為父本，與野生型Kasalath雜交，獲得子一代F1植株與野生型 Kasalath完全一致，說明ksrl為隱性突變。F1代自花授粉所得的F2中，正常植株與短根植株的分離比為264/81 = 3. 26，卡方檢測結(jié)果為0. 44 < X2a05 = 3. 84，正常植株與短根植株的比例符合一對基因控制的3 1分離比，表明該突變體是隱性單基因突變體，命名該基因為 KSRl。實施例ISRl基因的粗定位利用篩選到多態(tài)性標記對21個F2的突變單株進行初定位分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)相關(guān)基因與第4染色體的標記RM1223表現(xiàn)緊密連鎖，21個單株全部擴增出與Kasalath對照相同的帶型，說明突變相關(guān)基因KSRl與標記RM1223連鎖，且距離較近。實施例ISRl基因的精細定位在初定位的基礎(chǔ)上，根據(jù)Gramene (http://www. gramene. org)網(wǎng)站上提供的數(shù)據(jù)，合成了 RM1223附近的20對引物，其中有8對在水稻品種Kasalath和Nipponhare間表現(xiàn)多態(tài)性。利用這些多態(tài)性的標記，我們分析了 735個F2單株，將KSRl基因定位于分子標記RM17169和RM17182之間約245kb的范圍內(nèi)，與RM17169有2重組子，與RM17182有1個重組子。為了進一步縮小范圍，我們利用在這個區(qū)域內(nèi)公布的水稻品種Nipponbare和9311 的序列，分析他們的差異，用引物設(shè)計軟件I^rimerfremier 5. O設(shè)計了 7對InDel引物。經(jīng)過多態(tài)性篩選，其中有2對表現(xiàn)多態(tài)性，分別為44472 和4-M856K。序列為4-24725KU-5’ TTGAGATTACATGCGAAATG3 ’4-24725KL-5，TATCAACCAGTACATCGTCTAC3，4-24856KU-5，AGTTGGTGACAATCTCATTGAAC3，4-24856KU-5，GCTTTACTGAAACGCCATTG3，。用這2對引物我們對F2定位群體進行擴增，分別篩選出2個和O個重組個體，且標記44472 和RM17169的重組子是相同的，這樣把基因KSRl定位在了標記44472 和 RM17182之間約155kb范圍內(nèi)。實施例4KSR1基因克隆和鑒定通過精細定位，將基因定位到了 1551Λ的區(qū)間內(nèi)，這個區(qū)間共有21個預(yù)測的基因， 通過生物信息學(xué)分析，對NCBI登錄號為0s04g0497200基因的cDNA進行測序，最終發(fā)現(xiàn)的編碼區(qū)cDNA的鳥嘌呤(G-1591)突變成了胸腺嘧啶(T)，造成編碼的甘氨酸(Gly-531)突變?yōu)樯彼?Trp)，從而引起植株根系長度變短，定名為基因KSR1。KSRl基因全長cDNA的獲得水稻kasalash和ksrl葉片總RNA的提取采用上海生工RNA提取試劑盒(SK1321)， 以O(shè)ligo (dt)-18為引物，以所提取的總RNA為模板合成第一鏈cDNA。以此cDNA為模板，用弓丨物 primer 1 (5，一CGCAGCCACAGCCATGTAC—3，)禾口 primer 2 (5，一GACCAAACGAAC CGAAACA-3’ )進行PCR擴增反應(yīng)，反應(yīng)條件如下反應(yīng)體積20ul，其中含有模板(cDNA)primer 1 禾口 primer 2dNTP二甲基亞砜(DMSO)LA Taq DNA 聚合酶10*Taq DNA聚合酶緩沖液用雙蒸水補足至20 μ 1體積。反應(yīng)程序如下
5
2 μ 1 (2ng) 終濃度各0. 2 μ M 終濃度各150 μ M 1 μ 1 IU
2μ 1
940C，變性3分鐘；然后94°C變性30秒，61 °C退火30秒，72°C延伸2分鐘，擴增洲個循環(huán)；最后在72°C下延伸10分鐘。擴增產(chǎn)物用上海生工的DNA凝膠回收試劑盒(BBI，BS354)按產(chǎn)品說明書進行純化，然后與PMD18-T載體(TaKaRa，D101A，市售)在16°C下連接5小時，構(gòu)建重組載體 PMD18-KSR1。42°C熱激90秒將重組載體pMD18_KSRl轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α (市售)，轉(zhuǎn)化物在含有氨芐青霉素的LB平板培養(yǎng)基(市售)上生長，挑取克隆，提取質(zhì)粒，送交上海生工測序。測序結(jié)果表明，擴增到的片段的核苷酸序列如序列表1所示，將該片段命名為KSRl基因，KSRl基因全長1872bp，其編碼的氨基酸序列見序列表中序列2所示。實施例5KSR1等位基因克隆和鑒定在圖位克隆其他短根突變體基因過程中，發(fā)現(xiàn)了兩個與KSRl基因等位的突變體， 分別為ksr98和ksrl09。與ksrl不同，ksr98在cDNA編碼區(qū)的鳥嘌呤(G-1M6)變成了胸腺嘧啶(T)，造成編碼的甘氨酸(Gly-516)變?yōu)榫彼?Arg) ；ksrl09在cDNA編碼區(qū)的腺嘌呤(A-178)變成了 T，造成編碼賴氨酸(Lys-60)的密碼子成終止密碼子(TAG)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成的提前終止。ksrl突變體由野生型的甘氨酸(Gly-531)突變?yōu)樯彼?Trp)，ksr98突變體由野生型的甘氨酸(Gly-516)突變?yōu)榫彼?Arg)，這些單核苷酸的突變都可能引起蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化，導(dǎo)致蛋白質(zhì)失活；ksrl09腺嘌呤(A-178)被突變成了 T，造成編碼賴氨酸 (Lys-60)密碼子成終止密碼子(TAG)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成的提前終止。這三個突變體都表現(xiàn)為相同的短根表型，因此KSRl蛋白序列的改變或KSRl基因的堿基序列改變都可能導(dǎo)致水稻根系長度變短，呈現(xiàn)如圖1所示的短根表型。
權(quán)利要求
1.一種水稻根系長度相關(guān)蛋白，其特征為如下a)或b)的蛋白a)由序列表中SEQID NO :2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；b)在序列表SEQID NO :2所示的氨基酸序列中經(jīng)過取代和/或缺失和/或添加一個或幾個氨基酸且與水稻根系長度相關(guān)的由a)衍生的蛋白質(zhì)。
2.編碼權(quán)利要求1所述的一種水稻根系長度相關(guān)蛋白的基因，其特征為所述基因是如下1)或2)或3)的基因1)其核苷酸序列如序列表中SEQID NO 1所示DNA分子；2)在嚴格條件下可與序列表SEQID NO :1所示的核苷酸序列雜交且編碼所述根系長度相關(guān)蛋白的DNA分子；3)與1)的基因有90%以上的同源性，且編碼所述根系長度相關(guān)蛋白的DNA分子。
3.含有權(quán)利要求3所述的基因的重組表達載體。
4.含有權(quán)利要求3所述的基因的轉(zhuǎn)基因細胞系或重組菌。
5.權(quán)利要求2所述的水稻根系長度相關(guān)蛋白的編碼基因在改變水稻根系長度中的應(yīng)
全文摘要
本發(fā)明公開了一種水稻根系長度相關(guān)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用，該蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO2所示，屬于β-1,4葡聚糖內(nèi)切酶家族，與根系長度相關(guān)；該蛋白的編碼基因如序列表SEQ ID NO1所示的堿基序列，該堿基序列若發(fā)生突變，如1591bp位的鳥嘌呤被胸腺嘧啶取代，編碼的蛋白的531位Gly變?yōu)門rp，如1546bp位的鳥嘌呤被胸腺嘧啶取代，編碼的蛋白的516位Gly變?yōu)锳rg，如178bp位腺嘌呤被胸腺嘧啶取代，導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成的提前終止，這樣該蛋白就抑制節(jié)間細胞的伸長和細胞壁纖維素合成，具體在植株表現(xiàn)為短根系，突變體根長只有正常野生型根長的20%左右。該蛋白及其編碼基因的應(yīng)用，可以為水稻的根系改良和雜交育種或轉(zhuǎn)基因植物的開發(fā)創(chuàng)造了條件。
文檔編號C12N1/21GK102161985SQ20111005462
公開日2011年8月24日 申請日期2011年3月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月8日
發(fā)明者丁沃娜, 寧永強, 朱世華 申請人:寧波大學(xué)