專利名稱：一種用于耐藥結(jié)核血清學診斷的Rv1793重組蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于結(jié)核病血清學診斷技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于多耐藥結(jié)核桿菌的血清學診斷的重組蛋白。
背景技術(shù)：
結(jié)核分枝桿菌對臨床常用的抗結(jié)核一線藥物包括異煙胼(isoniazid，INH)、利福平(rifampin, RFP)、吡嗪酰胺(pyrazinamide, PZA)、鏈霉素(str印tomycin, SM)和乙胺丁醇(ethambutol，EMB)等均存在耐藥現(xiàn)象，甚至是對多種藥物同時產(chǎn)生耐藥的情況，即出現(xiàn)MDR-TB。MDR-TB是指結(jié)核病患者排出的結(jié)核分枝桿菌對至少包括INH和RFP在內(nèi)的 2種或2種以上藥物產(chǎn)生耐藥。據(jù)WHO估計全球有5000萬人感染耐藥結(jié)核桿菌，其中中國最多，占到11%，耐藥甚至耐多藥的結(jié)核桿菌的爆發(fā)流行已成為世界范圍內(nèi)的嚴重的公共衛(wèi)生問題。由于對耐藥結(jié)核桿菌沒有有效的治療藥物，在治療中只能選用毒副作用更大的二線藥物，這不僅極大地增加了治療的成本和時間，而且死亡率也很高。因此對于耐藥結(jié)核病的早期診斷和早期治療成為控制耐藥結(jié)核病的重要手段。目前臨床正在使用和研究的耐藥結(jié)核桿菌的檢測方法大體可分為表型檢測和基因檢測兩大類。表型檢測是基于結(jié)核桿菌培養(yǎng)的方法，該方法是結(jié)核桿菌診斷的金標準，但耗時長，如加上藥敏試驗，從病人就診到得到藥敏結(jié)果約需要10周的時間，遠不能滿足臨床診治的需要。表型檢測另一種是BACTECT 方法，這一方法雖然較快但由于設備昂貴，難以在臨床推廣?；驒z測如DNA序列測定、基因芯片技術(shù)等指的是測定耐藥相關(guān)基因突變位點的方法，但是由于耐藥位點很多，而且很多耐藥相關(guān)基因未知，因此不能檢測所有的突變類型。另外，基因檢測方法對實驗技術(shù)要求高，影響因素也很多。因此，這些方法目前不足以用于臨床標本的直接檢測。結(jié)核分枝桿菌的血清學診斷具有簡便、快速、價格便宜、標本容易獲得、不需要特殊的大型檢測設備等優(yōu)點。目前在研的幾種結(jié)核分枝桿菌診斷抗原主要包括結(jié)核菌素、 CFPlO、38 kD 蛋白、Ag85、ESAT-6、MPT64、Mtb8.4、LAM、TB4。但每一種抗原只能檢出一部分的感染者，并且對于耐藥性結(jié)核迄今為止仍未找到特異性高、敏感性強的診斷抗原。本發(fā)明找到了特異性和敏感性較高的耐藥結(jié)核血清學診斷的生物標志物Rvl793蛋白。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種用于耐藥結(jié)核血清學診斷的重組蛋白，并提供該重組蛋白在耐藥結(jié)核血清學診斷中的應用。本發(fā)明提供的用于耐藥結(jié)核血清學診斷的重組蛋白，是一種Rvl793重組蛋白，該重組蛋白由如下步驟獲得將Rvl793插入到pET28a EcoRl和歷'/^III酶切位點之間形成重組質(zhì)粒，然后轉(zhuǎn)化到五coli BL21 (DE!3)中形成重組五cWi，表達該蛋白。該重組蛋白可用作耐藥結(jié)核血清學診斷的生物標志物。本發(fā)明還涉及一種重組質(zhì)粒，該重組質(zhì)粒中含有Rvl793蛋白的編碼序列。
本發(fā)明還涉及所述重組蛋白的制備方法，具體包括以下步驟
(1)擴增AW7幻基因；
(2)用和歷ii/III酶雙酶切AV77幻基因序列，并與原核載體pET28a相連，形成重組質(zhì)粒；
(3)將步驟(2)獲得的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化、擴增并表達，即獲得Rvl793重組蛋白。本發(fā)明還提供該重組蛋白作為生物標志物用于耐藥結(jié)核血清學診斷的具體方法， 其具體步驟為
(1)包被=IOOyL /孔濃度為Syg/mL的RV1793重組蛋白4°包被過夜。(2)洗板PBST 300 μ L / 孔，3min，洗 3 次，拍干。(3)封閉1% BSA 的 PBS, 300 μ L / 孔，37°C 孵育 2 小時。(4)洗板PBST 300 μ L / 孔，3min，洗 3 次，拍干。(5)加入1:100稀釋的待測血清，IOOyL /孔，37°C孵育1小時。(6)洗板PBST 300 μ L / 孔，5min，洗 5 次，拍干。(7)加酶標二抗于各反應孔中，加入新鮮稀釋的酶標抗體(稀釋倍數(shù)按照試劑推薦)300ul。37°C孵育1小時，洗滌同(6)。(8)加底物液顯色于各反應孔中加入臨時配制的TMB底物顯色液100μ L，37°C 5
mirio(9)加終止液于各反應孔中加入50 μ L終止液。(10)在酶標儀上，于450nm處，以空白對照孔調(diào)零后測各孔OD值。本發(fā)明提供的這種新的重組蛋白用于耐藥血清學診斷的敏感性可以達到75%，遠遠大于對照CFP-10重組蛋白的耐藥診斷率53. 3%。因此，Rvl793重組蛋白將成為一種有效的新的應用于耐藥結(jié)核血清學診斷的生物標志物。


圖1為Rv 1793重組蛋白HPLC圖。圖2為Rv 1793重組蛋白純化后SDS-PAGE圖片。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員對本發(fā)明各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。將重組蛋白克隆表達純化后將能得到如附圖2所示的純化Rvl793重組蛋白，然后按照如下面實施例所示的步驟進行待測病人血清學鑒定，這樣可以檢測出75%的耐藥血清 (見表一)。
實施例將有活性的濃度為Syg/mL的重組Rvl793蛋白，IOOyL /孔包被4°過夜； 300 μ L / 孔 PBST，每次;3min，洗 3 次，拍干；用 BSA 的 PBS，300yL / 孔，37°C 孵育 2小時封閉；300 μ L /孔PBST，每次3min，洗3次，拍干；加入1 100稀釋的健康血清和待測的病人血清，IOOyL /孔，37°C孵育Ih ;300 μ L /孔PBST，每次5min，洗5次，拍干；于各反應孔中，加入新鮮稀釋的酶標抗體300ul，37°C孵育Ih ;300μ /孔PBST，每次5min， 洗5次，拍干；于各反應孔中加入TMB顯色液100 μ L，37°C 5 min ；各反應孔中加入50 μ L終止液，在酶標儀上，于450nm處，以空白對照孔調(diào)零后測各孔OD值。然后以健康對照血清的平均值加上2倍的標準偏差為準，大于此值的為陽性，反之為陰性。此結(jié)果可以檢測出75% 的耐藥血清。 表一重組Rvl793蛋白診斷耐藥病人的敏感性和特異性
權(quán)利要求
1.一種用于結(jié)核耐藥血清學診斷的重組蛋白，其特征在于為RV1793重組蛋白，該重組蛋白由如下步驟獲得將Rvl793插入到pET28a EcoRl和歷'/^III酶切位點之間形成重組質(zhì)粒，然后轉(zhuǎn)化到五coli BL21中形成重組五cWi，表達該蛋白。
2.一種重組質(zhì)粒，其特征在于，該質(zhì)粒中含有Rvl793蛋白的編碼序列。
3.如權(quán)利要求1所述的重組蛋白的制備方法，其特征在于，具體步驟為(1)擴增AW7幻基因；(2)用和歷ii/III酶雙酶切AV77幻基因序列，并與原核載體pET28a相連，形成重組質(zhì)粒；(3)將步驟(2)獲得的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化、擴增并表達。
4.一種如權(quán)利要求1所述的重組蛋白作為耐藥結(jié)核血清學診斷生物標志物的應用。
全文摘要
本發(fā)明屬于結(jié)核病診斷技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種用于多耐藥結(jié)核桿菌血清學診斷的重組蛋白。該重組蛋白為Rv1793重組蛋白，由如下步驟獲得將Rv1793插入到pET28aEcoRI和HindIII酶切位點之間形成重組質(zhì)粒，然后轉(zhuǎn)化到E.coliBL21中形成重組E.coli，表達該蛋白。這種新的重組蛋白用于耐藥血清學診斷的敏感性可以達到75%，遠遠大于對照CFP-10重組蛋白的耐藥診斷率53.3%。Rv1793重組蛋白將成為一種有效的應用于耐藥結(jié)核血清學診斷的生物標志物。
文檔編號C12N15/70GK102161695SQ20111005437
公開日2011年8月24日 申請日期2011年3月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月8日
發(fā)明者何磊, 劉丹, 張鷺, 彭超, 徐文璽, 王文婕, 王洪海, 郝科威 申請人:復旦大學