一種快速檢測利福平耐藥結(jié)核分枝桿菌的分子信標(biāo)探針和試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種分子信標(biāo)探針，具體設(shè)及一種快速檢測利福平耐藥結(jié)核分枝桿菌 的分子信標(biāo)探針和試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 根據(jù)中國衛(wèi)生部組織的第四次全國結(jié)核病流行病抽樣調(diào)查(2000年)得出的結(jié)果， 我國有4億人感染過結(jié)核菌，現(xiàn)有的傳染性結(jié)核病人達(dá)200萬人，結(jié)核病的人數(shù)位居世界第 二，僅次于印度。耐藥結(jié)核病的發(fā)生和流行是當(dāng)今及今后一段時間內(nèi)結(jié)核病防治工作的難 題和最大挑戰(zhàn)。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展和結(jié)核菌對抗結(jié)核藥物耐藥機制在基因水平的 逐漸闡明，建立分子生物學(xué)的檢測耐藥方法可提高檢測的速度。盡快初篩耐藥結(jié)核病人和 制定最佳治療方案，防止耐藥菌株在人群中的擴(kuò)散，降低原發(fā)性耐藥，是臨床上迫切需要解 決的問題。
[0003] 利福平是主要的抗結(jié)核一線藥物，利福平通過與結(jié)核分枝桿菌RNA聚合酶亞單位 相結(jié)合，干擾結(jié)核分枝桿菌RNA的合成，從而達(dá)到抗菌的效果。結(jié)核分枝桿菌RNA聚合酶亞單 位由ro地基因編碼，95% W上利福平耐藥結(jié)核分枝桿菌都與ro地基因的突變有關(guān)。
[0004] 當(dāng)前臨床上檢測利福平耐藥結(jié)核分枝桿菌常用的方法有細(xì)菌培養(yǎng)法和PCR法。其 中細(xì)菌培養(yǎng)法是檢測利福平耐藥結(jié)核分枝桿菌的金標(biāo)準(zhǔn)，但該方法需要進(jìn)行藥敏實驗，通 常需要15-20天才能看到最終的檢測結(jié)果，檢測成本高、檢測周期長;利用PCR方法可在短時 間內(nèi)使特定的核酸序列拷貝數(shù)幾何級數(shù)增加，有很高的靈敏度和特異性，但缺點是假陽性 率高，另一方面，樣本中有往往含有抑制PCR反應(yīng)的成分，運又會導(dǎo)致假陰性的出現(xiàn)，運兩方 面的缺點限制了PCR檢測的臨床應(yīng)用。由此可見，利福平耐藥結(jié)核分枝桿菌感染的臨床診 斷，急需更簡潔、靈敏的檢測方法。
[0005] 分子信標(biāo)探針(Molecular beacon probe),具有靈敏度高、特異性強、只有和革己序 列雜交上了才會發(fā)出巧光等優(yōu)點，被應(yīng)用于巧光原位雜交。本發(fā)明通過對大量利福平耐藥 結(jié)核分枝桿菌和非耐藥菌株的基因序列進(jìn)行比對，挑選利福平耐藥結(jié)核分枝桿菌特有的基 因ro地基因作為檢測祀點，并針對該祀位點設(shè)計、合成S條分子信標(biāo)探針(Beacon ROPBl， Beacon R0PB2和Beacon R0PB3)，通過運S條探針的聯(lián)合作用，提高檢測的巧光信號強度， 達(dá)到檢測利福平耐藥結(jié)核分枝桿菌的效果。本發(fā)明還建立了穩(wěn)定的分子信標(biāo)原位雜交檢測 利福平耐藥結(jié)核分枝桿菌的反應(yīng)體系，克服了利福平耐藥結(jié)核分枝桿菌當(dāng)前臨床檢測的諸 多問題，為利福平耐藥結(jié)核分枝桿菌感染的診斷、預(yù)防和控制提供新的檢測方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的不足之處而提供了一種快速檢測利福平 耐藥結(jié)核分枝桿菌的分子信標(biāo)探針、試劑盒和方法。
[0007] 為實現(xiàn)上述目的，所采取的技術(shù)方案：一種快速檢測利福平耐藥結(jié)核分枝桿菌的 分子信標(biāo)探針，所述分子信標(biāo)探針包括Beacon ROPB UBeacon R0PB2和Beacon R0PB3,所 述Beacon ROPB 1的堿基序列如SEQ ID NO. 1所示，所述Beacon ROPB 2的堿基序列如SEQ ID NO.2所示，所述Beacon ROPB 3的堿基序列如沈Q ID NO.3所示。
[000引本發(fā)明的技術(shù)要點或原理：巧光原位雜交（Flourescence in situ Hybridization, FI甜)是一種應(yīng)用標(biāo)記有巧光物質(zhì)的探針，通過雜交的方法來檢測細(xì)胞或 組織內(nèi)特異性DNA或RNA的方法;分子信標(biāo)探針是一種具有獨特"發(fā)夾"空間結(jié)構(gòu)的探針，在 未與祀序列結(jié)合時，分子信標(biāo)呈"發(fā)夾"結(jié)構(gòu)，有一環(huán)序列（loop)和一莖序列(stem),其中環(huán) 序列是與祀位點互補的堿基序列，而莖序列是與祀位點無關(guān)的互補序列；在探針的兩端分 別標(biāo)記有巧光基團(tuán)和巧光巧滅基團(tuán)，當(dāng)探針處于發(fā)卡結(jié)構(gòu)時，巧光基團(tuán)和巧滅基團(tuán)相鄰，產(chǎn) 生能量共振轉(zhuǎn)移效應(yīng)，使得巧光基團(tuán)被巧滅，不能產(chǎn)生巧光信號，而當(dāng)探針與祀位點結(jié)合 時，發(fā)夾結(jié)構(gòu)被打開，巧光基團(tuán)和巧滅基團(tuán)分開，產(chǎn)生巧光信號，通過巧光顯微鏡可W檢測 到該巧光信號。
[0009] 本發(fā)明通過對大量利福平耐藥結(jié)核分枝桿菌和非耐藥結(jié)核菌株的基因序列進(jìn)行 比對，挑選利福平耐藥結(jié)核分枝桿菌最常見的ro地突變基因作為檢測祀點，并針對該祀位 點設(shè)計、合成=條分子信標(biāo)探針(Beacon ROPBl ,Beacon R0PB2和Beacon R0PB3)。
[0010] 優(yōu)選地，所述Beacon ROPB UBeacon R0PB2和Beacon R0PB3的5'端用相同的巧光 基團(tuán)標(biāo)記，所述Beacon ROPB UBeacon R0PB2和Beacon R0PB3的3'端用相同的巧光澤滅基 團(tuán)標(biāo)記。
[0011] 優(yōu)選地，所述巧光基團(tuán)為FITC、FAM和切3中的一種，所述巧光澤滅基團(tuán)為DABCTL、 BDH、B冊1和TANRA中的一種。，巧光基團(tuán)或巧光巧滅基團(tuán)可W根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)進(jìn)行添加。
[0012] 優(yōu)選地，所述巧光基團(tuán)為切3,所述巧光澤滅基團(tuán)為BHQl。在運里Beacon ROPBl: 5'-CY3-CACTGCCACTCCTACCAACGTTCCAGTG-BHQl-3'；Beacon R0PB2:5'-CY3-CACTGGCTCCGAAGAGAAAGCCCAGTG-BHQl-3Beacon R0PB3：5'-CY3-CACTGCTAACATGTGTTAATTACTCCAGTG-BHQl-3' ；所述CY3巧光基團(tuán)激發(fā)波長為552nm，檢測波 長為570nm。
[0013] 本發(fā)明提供了一種快速檢測利福平耐藥結(jié)核分枝桿菌的試劑盒，所述試劑盒包括 重懸液，雜交液，洗涂液和上述所述的分子信標(biāo)探針。
[0014] 優(yōu)選地，所述分子信標(biāo)探針中Beacon ROPBUBeacon R0PB2和Beacon R0PB3的使 用濃度均為lOnM。
[001引優(yōu)選地，所述重懸液包括:0.1~0.5M乙酸錠和5~50mM his-肥l，pH值為4~7;
[0016] 所述雜交液包括：5~20 % (w/v)硫酸葡聚糖，100~1000 mM焦憐酸鋼，0 . Ol %~ 0.5%聚薦糖，0.01 %~0.5%聚乙締化咯燒酬，0.01 %~0.5%聚乙二醇，10~40% (v/v)去 離子甲酯胺，5mM Na沈DTA，0.01 ~l%(v/v)TritonX-100和5~200mM pH 7.5的his-HCl;
[0017] 所述洗涂液包括：5~50mMTris，10~100mM化Cl，0.01~0.2%(v/v)TritonX-100 和 0.01 ~0.2%(￥八）505，口巧直為6~10。
[0018] 本發(fā)明提供了一種快速檢測利福平耐藥結(jié)核分枝桿菌的方法，所述方法是采用上 述所述的分子信標(biāo)探針進(jìn)行檢測的。
[0019] 本發(fā)明提供了一種快速檢測利福平耐藥結(jié)核分枝桿菌的方法，所述方法是采用上 述所述的試劑盒進(jìn)行檢測的。
[0020] 優(yōu)選地，所述方法包括W下步驟：
[0021] (1)吸取ImL待測樣本，12000巧m離屯、1分鐘，棄上清，5化L重懸液重懸沉淀；
[0022] (2)吸取10化重懸后的樣本滴在載玻片上，50°C W上溫度烘干，使樣本中細(xì)菌固定 在載玻片上；
[0023] (3)將載玻片浸入無水乙醇中，浸泡5分鐘；
[0024] (4)在樣本上加入20化雜交液，W及Beacon ROPBUBeacon R0PB2和Beacon R0PB3,所述Beacon ROPBUBeacon R0PB2和Beacon R0PB3的終濃度均為lOnM，置于雜交儀 上42~58°C雜交10分鐘；
[0025] (5)在42~58°C下用洗涂液洗涂樣本1分鐘；
[0026] (6)將樣本烤干后滴加封片劑后，用巧光顯微鏡鏡檢，用10 X物鏡掃視和計數(shù)，用 40 X或100 X物鏡觀察細(xì)菌形態(tài)。
[0027] 本發(fā)明通過大量實驗，確定巧光原位雜交的最佳溫度為42-58°C，甲酯胺最佳濃度 為10-40%，分子信標(biāo)最佳濃度為lOnM。
[0028] 本發(fā)明的分子信標(biāo)探針能夠用于檢測的樣本范圍廣泛，包括但不限于：血液、體 液、脈液、尿液、組織切片、食物樣本、來自±壤、空氣和水的樣本，W及它們的培養(yǎng)物。運些 樣本經(jīng)相應(yīng)處理后，原則上是只要保持細(xì)胞形態(tài)完整并且祀核酸未被破壞，均可使用本發(fā) 明的分子信標(biāo)探針檢測。運些樣本的處理方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所掌握的。
[0029] 本發(fā)明的有益效果在于:本發(fā)明提供了一種快速檢測利福平耐藥結(jié)核分枝桿菌的 分子信標(biāo)探針，本發(fā)明的通過=條分子信標(biāo)探針信號協(xié)同作用，分別W結(jié)核分枝桿菌的 ropB基因為祀點，從而檢測利福平耐藥結(jié)核分枝桿菌。當(dāng)本發(fā)明所述的Beacon ROPBl、 Beacon R0PB2和Beacon R0PB3聯(lián)合使用時，可W達(dá)到較好的巧光信號強度，并且特異性高， 可W有效、快速地檢測利福平耐藥結(jié)核分枝桿菌。
【具體實施方式】
[0030] 下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明的實施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但下列實施例僅用于說明 本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造 商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可W通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn) 品。
[0031 ]實施例1:分子信標(biāo)探針及寡聚核巧酸序列的設(shè)計與合成
[0032] 選擇出能特異性地檢測利福平耐藥結(jié)核分枝桿菌的ropBABC操縱子基因序列，在 運些基因序列上根據(jù)熱力學(xué)特征和高級結(jié)構(gòu)，設(shè)計與其完全互補的分子信標(biāo)探針：
[0033] Beacon ROPBl：
[0034] 5 '-CY3-CACTGCCACTCCTACCAACGTTCCAGTG-B冊1-3 '；
[0035] Beacon R0PB2：
[0036] 5 '-CY3-CACTGGCTCCGAAGAGAAAGCCCAGTG-B冊1-3 '；
[0037] Beacon R0PB3：
[0038] 5 '-CY3-C