一種檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌耐藥基因的試劑盒及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌耐藥基因的試劑盒及其應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng) 域。
【背景技術(shù)】
[0002] 結(jié)核病是單一致病菌感染導(dǎo)致死亡率最高的感染性疾病。目前，全球約有1/3的 人感染了結(jié)核桿菌，每年死于結(jié)核病的人數(shù)達(dá)到300萬(wàn)。我國(guó)是全球22個(gè)結(jié)核病流行嚴(yán)重 的國(guó)家之一，位居全球第2位。第五次全國(guó)結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查顯示，全國(guó)15歲及以 上人群肺結(jié)核的患病率為459/10萬(wàn)，肺結(jié)核患者耐多藥率為6. 8%。結(jié)核病與艾滋病等疾 病伴發(fā)以及多藥耐藥等現(xiàn)象致使我國(guó)結(jié)核病的防控形勢(shì)嚴(yán)峻。
[0003] 結(jié)核分枝桿菌耐藥性的機(jī)制大致有三種類型：即降低細(xì)胞膜的通透性和外排泵機(jī) 制，產(chǎn)生降解或滅活酶類，藥物靶位的改變。結(jié)核桿菌無(wú)法通過(guò)質(zhì)粒的介導(dǎo)從其他細(xì)菌獲得 耐藥性，因此染色體介導(dǎo)的耐藥性是MTB(結(jié)核分枝桿菌）產(chǎn)生耐藥的主要基礎(chǔ)。目前對(duì) MTB耐藥分子機(jī)制的研宄主要集中在藥物的作用靶位及其相關(guān)基因的突變上。
[0004] 利福平作用于結(jié)核桿菌DNA依賴的RNA聚合酶亞基|3亞單位（RNApolymerase Bsubunit，rpoB)，從而抑制mRNA的轉(zhuǎn)錄。結(jié)核分枝桿菌對(duì)利福平耐藥是結(jié)核病化療失敗 的主要原因，當(dāng)rpoB高度保守核心區(qū)域（RRDR)發(fā)生突變時(shí)利福平不能與RNA聚合酶0亞 單位結(jié)合，抑制轉(zhuǎn)錄。主要的突變集中在編碼27個(gè)氨基酸的81個(gè)堿基范圍內(nèi)（Hillemann Detal.UseOftheGenotypeMTBDRassayforrapiddetectionofrifampinand isoniazidresistanceinMycobacteriumtuberculosiscomplexisolates[J].J.Clin. Mierobiol，2005,43 :3699-3703.)。其中，以 531TCG-TTG、526CAC-GAC、CAC-TAC、 CAC-CGC和CAC-CTC的突變最為常見(jiàn)（崔振玲等.基因芯片檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌利福 平和異煙肼耐藥性研宄[J].中華結(jié)核與呼吸雜志，2004,7(27) :439-441.)，除上述兩位點(diǎn) 外，511、516、533、522位點(diǎn)也有突變。
[0005] 結(jié)核分枝桿菌對(duì)抗結(jié)核化療藥物異煙肼（INH)的耐藥機(jī)制較為復(fù)雜，約92%的 INH耐藥菌與katG，inhA和ahpC三個(gè)基因突變有關(guān)。其中katG和inhA基因是主要的耐 藥基因。katG的丟失或突變導(dǎo)致其編碼的過(guò)氧化氫-過(guò)氧化物酶活性喪失或下降，而inhA 基因突變減弱了異煙肼對(duì)分枝桿菌酸生物合成的抑制作用。katG基因常見(jiàn)突變發(fā)生在315 位點(diǎn)上即315AGC-AAC或者AGC-ACC，inhA基因的突變位點(diǎn)為-15C-T。
[0006] 最近的研宄表明結(jié)核分枝桿菌耐乙胺丁醇與阿拉伯糖基轉(zhuǎn)移酶的編碼基因。 embABC操縱子突變或emb蛋白表達(dá)增高有關(guān)，該操縱子由embC、embA和embB三個(gè)基 因組成，其中embB基因（尤其是306位密碼子）突變是耐乙胺丁醇產(chǎn)生的主要分子機(jī) 制。約47%_65%的耐￡]\?菌株與611^13基因突變有關(guān)（1^11^8￥31117 3 6七31.]\1〇16(31113『 geneticanalysisofnucleotidepolymorphismsassociatedwithethambutol resistanceinhumanisolatesofMycobacteriumTuberculosis[J]?AntimicrobAnents Chemother. 2000,44 (2) :32.)，常見(jiàn)突變位點(diǎn)為 306ATG-ATA或ATG-GTG。
[0007] 鏈霉素是抗結(jié)核治療中常用的氨基糖苷類抗生素，鏈霉素主要作用于結(jié)核分枝桿 菌的核糖體，誘導(dǎo)遺傳密碼的錯(cuò)誤，抑制mRNA轉(zhuǎn)譯的開始，干擾轉(zhuǎn)譯過(guò)程中的校對(duì)，從而 抑制蛋白質(zhì)合成（HonoreN，ColeST.Streptomycinresistanceinmycobactefia[J]. AnlimiorobAgentsChemother，1994,38(2):238.)。最近研宄認(rèn)為鏈霉素耐藥是由于其核 糖體S12蛋白編碼基因rpsL或16SrRNA編碼基因rr8突變所致，80%耐鏈霉素結(jié)核分枝桿 菌臨床分離株可見(jiàn)rpsL突變（李國(guó)利.結(jié)核分枝桿菌耐藥分子機(jī)制及耐藥基因檢測(cè)方法 研宄進(jìn)展[J].中國(guó)醫(yī)師雜志，2002,4(4) :338-340.)。rpsL基因最常見(jiàn)的是43位密碼子 AAG-AGG的突變和88位密碼子AAG-AGG的突變。
[0008] 氟喹諾酮類藥物的作用靶位是細(xì)菌的DNA旋轉(zhuǎn)酶，阻抑DNA的復(fù)制，最終導(dǎo)致菌體 死亡。喹諾酮類耐藥結(jié)核菌中，突變大多發(fā)生在gyrA基因保守區(qū)67-106位的密碼子區(qū)。常 見(jiàn)94位GAC-GGC的突變位點(diǎn)，90位GCG-GTG的突變位點(diǎn)。
[0009] 卡那霉素（Kanamycin，KAN)和阿米卡星（Amikacin，AMK)是氨基糖苷類 抗生素，它們結(jié)合到細(xì)菌核糖體30S亞基的16SrRNA，干擾甲酰甲硫氨酰tRNA(. formyl-methionyl-tRNA)與30SrRNA的連接，阻斷細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成，從而達(dá)到抑菌的作 用。
[0010] 卷曲霉素（Capreomycin,CAP)為多肽復(fù)合物，對(duì)結(jié)核分枝桿菌起抑制作用，但作 用機(jī)制尚不明確，可能與抑制細(xì)菌蛋白合成有關(guān)。
[0011] 耐阿米卡星（AK)、卡那霉素的結(jié)核桿菌中，16SrRNA基因突變率為67. 4%，最常 見(jiàn)的突變型是1401(A-G)的單堿基置換（60. 5% )。少數(shù)分離株為1402(C-T或A)， 1484(G-T)，這些突變主要發(fā)生于高水平耐藥株，還有32. 6 %的耐卡那霉素分離株未發(fā)現(xiàn) 16SrRNA基因突變，可能還存在其他耐藥機(jī)制。
[0012] 卷曲霉素耐藥與相關(guān)基因突變關(guān)系密切，包括16SrRNA基因和tlyA基因，但是， 最主要的耐藥基因是16SrRNA基因，大約78-80%的卷曲霉素耐藥性與該基因的突變相 關(guān)，特別是1401(A-G)的單堿基置換，突變率約為72%，但此突變型僅造成卷曲霉素低度 耐藥，1402(C-T)和1484(G-T)的突變率較低，約為5-6%，但它們可導(dǎo)致菌株對(duì)卷曲霉 素高度耐藥。
[0013] 結(jié)核分枝桿菌的臨床檢測(cè)一直以來(lái)主要依靠藥物藥敏試驗(yàn)，但傳統(tǒng)的在固體培養(yǎng) 基上進(jìn)行的藥物敏感試驗(yàn)周期長(zhǎng)、敏感性低，嚴(yán)重影響了患者的早期診斷和治療。
[0014] 因此，建立一種操作簡(jiǎn)便、快速的檢測(cè)耐藥基因多點(diǎn)突變方法對(duì)指導(dǎo)結(jié)核病的治 療和控制具有極其重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0015] 本發(fā)明的目的是提供一種檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌耐藥基因的試劑盒及其應(yīng)用。
[0016] 本發(fā)明提供一組檢測(cè)或輔助檢測(cè)樣品中結(jié)核分枝桿菌的基因是否發(fā)生耐藥性突 變的探針，該組探針包含序列為如下（1)_(20)任意所示序列的探針中的至少一個(gè)：
[0017] (l)SEQIDNo. 13 所示的序列；
[0018] (2)SEQIDNo. 14 所示的序列；
[0019] (3)SEQIDNo. 15 所示的序列；
[0020] (4)SEQIDNo. 16 所示的序列；
[0021] (5)SEQIDNo. 17 所示的序列；
[0022] (6)SEQIDNo. 18 所示的序列；
[0023] (7)SEQIDNo. 19 所示的序列；
[0024] (8)SEQIDNo. 20 所示的序列；
[0025] (9)SEQIDNo. 21 所示的序列；
[0026] (10)SEQIDNo. 22 所示的序列；
[0027] (11)SEQIDNo. 23 所示的序列；
[0028] (12)SEQIDNo. 24 所示的序列；
[0029] (13)SEQIDNo. 25 所示的序列；
[0030] (14)SEQIDNo. 26 所示的序列；
[0031] (15)SEQIDNo. 27 所示的序列；
[0032] (16)SEQIDNo. 28 所示的序列；
[0033] (17)SEQIDNo. 29 所示的序列；
[0034] (18)SEQIDNo. 30 所示的序列；
[0035] (19)SEQIDNo. 31 所示的序列；
[0036] (20)SEQIDNo. 32 所示的序列；
[0037] 所述基因?yàn)閞poB基因、katG基因、inhA基因、rpsL基因、embB基因、gyrA基因和 /或rrs基因。
[0038] 所述基因?yàn)閞poB基因、katG基因、inhA基因、rpsL基因、embB基因、gyrA基因和 /或rrs基因。
[0039] 上述任一所述的探針中，所述rpoB基因?yàn)槟屠Ｆ降幕颍?br>[0040] 所述katG或inhA基因?yàn)槟彤悷熾碌幕颍?br>[0041] 所述rpsL基因?yàn)槟玩溍顾氐幕颍?br>[0042] 所述embB基因?yàn)槟鸵野范〈嫉幕颍?br>[0043] 所述gyrA基因?yàn)槟头Z酮類的基因；
[0044] 所述rrs基因?yàn)槟涂敲顾亍⒚卓ㄐ?、卷曲霉素基因?br>[0045] 所述突變?yōu)樗鰎poB基因的rpoB526CAC-GAC、rpoB526CAC-TAC、rpoB 531TCG-TGG、rpoB516GAC-GTC、rpoB511CTG-CCG、rpoB526CAC-CTC、rpoB 533CTG-CCG和 / 或rpoB526CAC-CGC突變；
[0046] 和/或，所述突變?yōu)樗鰇atG基因的katG315AGC-AAC和/或katG 315AGC-ACC突變；
[0047] 和/或，所述突變?yōu)樗鰅nhA基因的inhA-15C-A突變；
[0048] 和/或，所述突變?yōu)樗鰎psL基因的rpsL88AAG-AGG和/或rpsL43AAG-AGG 突變；
[0049] 和/或，所述突變?yōu)樗鰁mbB基因的embB306ATG-ATA和/或embB 306ATG-GTG突變；
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