Rv的DNA適配子及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及一種結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv的DNA適配子及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium Tuberculosis，MTB)感染引起的慢性傳染性疾病，是國內(nèi)外面臨的嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題，被列為我國重大傳染病之一。結(jié)核病是歷史上患病率和死亡率最高的疾病之一。2013年全球結(jié)核病感染患者約為900萬，而因結(jié)核病死亡的人數(shù)達(dá)到150萬；我國是全球結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家之一，因此建立一種準(zhǔn)確快速的檢測結(jié)核分枝桿菌的方法對(duì)結(jié)核病早期診斷治療有著重大意義。
[0003]目前，結(jié)核分枝桿菌的細(xì)菌學(xué)檢測是結(jié)核病實(shí)驗(yàn)診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。痰涂片直接鏡檢法是結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室最基本的細(xì)菌學(xué)檢查方法，其特點(diǎn)是簡便、快速、價(jià)廉，但無法辨別死菌活菌；敏感性低，特異性差，各種抗酸桿菌均可著色。但仍具有實(shí)用性，對(duì)結(jié)核病早期診斷起到重要作用；目前國內(nèi)外使用較多的細(xì)菌學(xué)檢測方法如羅氏培養(yǎng)基時(shí)間較長、培養(yǎng)陽性率低。如今使用快速培養(yǎng)系統(tǒng)檢測結(jié)核分枝桿菌雖能縮短培養(yǎng)時(shí)間、提高培養(yǎng)陽性率，但仍需4-6周，無法滿足臨床快速診療需求。分子生物學(xué)診斷雖然能滿足速度快、特異性高、涂陽標(biāo)本檢出率高等要求。但其高成本，并且操作復(fù)雜，對(duì)實(shí)驗(yàn)條件和技術(shù)人員要求高，限制了其在臨床檢驗(yàn)中的普及應(yīng)用。
[0004]當(dāng)前結(jié)核病的診斷存在耗時(shí)長、靈敏度低等問題，探索快速簡便的診斷方法一致是國內(nèi)外學(xué)者研宄的焦點(diǎn)。指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(Systematic evolut1n ofligand by exponential enrichment，SELEX)是 Ellington 與 Szostak (1990)最先報(bào)道使用，是一種新型體外篩選技術(shù)。該技術(shù)的基本原理是利用寡核苷酸分子可在空間形成多種多樣的三維結(jié)構(gòu)，通過構(gòu)建的隨機(jī)寡核苷酸文庫，從中篩選出與目標(biāo)靶分子有特異識(shí)別作用的高親和力的寡核苷酸分子，再經(jīng)擴(kuò)增、反復(fù)篩選，使該類寡核苷酸分子得到富集，該富集的寡核苷酸分子稱為適配子。與抗體蛋白相比，適配子具有分子識(shí)別能力強(qiáng)、穩(wěn)定性高、制備簡單、經(jīng)濟(jì)、快速等優(yōu)點(diǎn)。該技術(shù)已成功運(yùn)用于許多靶分子的篩選，包括金屬離子、有機(jī)染料、蛋白質(zhì)、細(xì)胞，藥物、氨基酸以及各種細(xì)胞因子等，可用于相應(yīng)靶分子的檢測識(shí)別。目前該技術(shù)在在人類病原微生物檢測方面得到了廣泛的應(yīng)用。
[0005]已有研宄通過SELEX技術(shù)篩選到相應(yīng)靶物質(zhì)的適配子作為拮抗劑，適用于腫瘤生長時(shí)的血管內(nèi)皮生長因子、血栓生成因子、一些毒素蛋白和促生長因子等，已達(dá)到治療目的。在微生物檢測方面，特別是對(duì)一些未知的致病性細(xì)菌或病毒的研宄，雖然不知道其內(nèi)部結(jié)構(gòu)、功能以及這些物質(zhì)的表位，但將其作為靶物質(zhì)，通過SELEX過程篩選到與其相對(duì)應(yīng)的適配子，檢測靶物質(zhì)，已成為該領(lǐng)域的研宄探索熱點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]為了解決上述現(xiàn)有技術(shù)中的問題，本發(fā)明提供了一種結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv的DNA適配子及其制備方法。
[0007]為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明的一種結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv的ssDNA適配子，DNA適配子的核苷酸序列為:
[0008]5’ -GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAACGGATTAGTCAATAGACTGGTGGCTTTGTGTGGTGTTCGACATGAGGCCCGGATC-3，
[0009]本發(fā)明的另一個(gè)目的是應(yīng)用上述適配子于細(xì)菌學(xué)檢測，尤其是檢測臨床菌株，菌株包括結(jié)核分枝桿菌(MTB)，非結(jié)核分枝桿菌(Non-Tuberculosis Mycobacteria, NTM)和非分枝桿菌。
[0010]本發(fā)明的還提供一種結(jié)核分枝桿菌檢測試劑盒，試劑盒中包含有上述的DNA適配子。
[0011]另一方面，本發(fā)明還提供上述結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv的DNA適配子的制備方法，包括以下步驟:
[0012]步驟1，構(gòu)建隨機(jī)單鏈寡核苷酸文庫:設(shè)計(jì)合成78堿基對(duì)的隨機(jī)單鏈DNA文庫:5’ -GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAA-N35-TTCGACATGAGGCCCGGATC-3’，其中 N 代表堿基 AGCT 中的任意一個(gè)，文庫的容量為1014-1015，并進(jìn)一步得到純化的單鏈SSDNA文庫用于結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv適配子的SELEX技術(shù)篩選；
[0013]步驟2，利用SELEX技術(shù)篩選H37Rv適配子:用包被緩沖液將結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv包被于微孔板中，同時(shí)設(shè)空白反篩孔，非結(jié)核分枝桿菌和非分枝桿菌反篩孔；ssDNA文庫和SELEX結(jié)合緩沖液混勻后先與空白反篩孔進(jìn)行孵育；然后轉(zhuǎn)移到H37Rv包被孔進(jìn)行孵育，SELEX沖洗緩沖液洗滌，甩干后加入SELEX洗脫緩沖液洗脫與H37Rv結(jié)合的ssDNA，產(chǎn)物經(jīng)酚氯仿抽提、乙醇沉淀純化，PCR擴(kuò)增后，進(jìn)行10輪篩選，篩選后的飽和文庫，經(jīng)克隆測序，獲得單個(gè)適配子。
[0014]為進(jìn)一步優(yōu)化上述的制備方法，本發(fā)明采取的措施還包括:
[0015]步驟I中還包括對(duì)結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv和其他細(xì)菌的培養(yǎng)，收集，磨菌和比濁。
[0016]步驟2 中使用 SELEX 結(jié)合緩沖液為:20mmol/L H印es，pH值 7.35，120mmol/L NaCl，5mmol/L KCl，lmmol/LCaCl2, lmmol/LMgCl2。
[0017]步驟2中使用SELEX沖洗緩沖液為:SELEX結(jié)合緩沖液+0.05% Tween20。
[0018]步驟2中使用SELEX洗脫緩沖液為:20mmol/L Tris-HCl，4mol/L異硫氰酸胍，lmmol/L DTT，pH 值8.3。
[0019]最后一方面，本發(fā)明還提供應(yīng)用上述結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv的ssDNA適配子進(jìn)行三明治夾心ELISA的檢測方法，選擇本發(fā)明的適配子與其他合適的適配子組合構(gòu)建基于適配子的三明治夾心ELISA檢測體系。
[0020]本發(fā)明的結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv的ssDNA適配子親和性、特異性高，其用于細(xì)菌學(xué)檢測能高特異性地檢測出結(jié)核分枝桿菌和非分枝桿菌，可以為結(jié)核病的實(shí)驗(yàn)室診斷提供有利依據(jù)。
【附圖說明】
[0021 ] 圖1是本發(fā)明的結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv適配子的二級(jí)結(jié)構(gòu)圖譜；
[0022]圖2是結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv與本發(fā)明的適配子熒光顯微鏡結(jié)果圖；
[0023]圖3是非結(jié)核分枝桿菌與本發(fā)明的適配子熒光顯微鏡結(jié)果圖；
[0024]圖4是非分枝桿菌與本發(fā)明的適配子熒光顯微鏡結(jié)果圖；
【具體實(shí)施方式】
[0025]本發(fā)明提供了一種結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv的DNA適配子和基于該適配子的細(xì)菌學(xué)檢測方法和應(yīng)用，以及該適配子的制備方法。
[0026]本發(fā)明的一種結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv的DNA適配子，DNA適配子的核苷酸序列為:
[0027]5’ -GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAACGGATTAGTCAATAGACTGGTGGCTTTGTGTGGTGTTCGACATGAGGCCCGGATC-3，。
[0028]本發(fā)明還提供上述的DNA適配子在細(xì)菌學(xué)檢測中的應(yīng)用，特別是在檢測結(jié)核分枝桿菌中的應(yīng)用。
[0029]本發(fā)明還提供一種結(jié)核分枝桿菌檢測試劑盒，包含有上述的DNA適配子。
[0030]本發(fā)明還提供一種結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv的ssDNA適配子制備方法，包括以下步驟:
[0031]步驟1，構(gòu)建隨機(jī)單鏈寡核苷酸文庫:設(shè)計(jì)合成78堿基對(duì)的隨機(jī)單鏈DNA文庫:5’ -GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAA-N35-TTCGACATGAGGCCCGGATC-3’，其中 N 代表堿基 AGCT 中的任意一個(gè)，容量為1014-1015，并進(jìn)一步得到純化的單鏈ssDNA文庫用于標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv適配子的SELEX技術(shù)篩選；
[0032]步驟2，以微孔板為分離介質(zhì)利用適配子技術(shù)篩選H37Rv適配子:用包被緩沖液將H37Rv包被于微孔板中，同時(shí)設(shè)空白反篩孔，非結(jié)核分枝桿菌和非分枝桿菌反篩孔；ssDNA文庫和SELEX結(jié)合緩沖液混勻后先與反篩孔進(jìn)行孵育；然后轉(zhuǎn)移到H37Rv包被孔進(jìn)行孵育，SELEX沖洗緩沖液洗滌，甩干后加入SELEX洗脫緩沖液洗脫與H37Rv結(jié)合的ssDNA，產(chǎn)物經(jīng)酚氯仿抽提、乙醇沉淀純化，PCR擴(kuò)增后，進(jìn)行10輪篩選，篩選后的飽和文庫，經(jīng)克隆測序，獲得單個(gè)適配子。
[0033]應(yīng)用上述結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv的ssDNA適配子進(jìn)行三明治夾心ELISA檢測的方法，選擇上述適配子或適配子組合構(gòu)建基于適配子的三明治夾心ELISA檢測體系。
[0034]本發(fā)明在獲得H37Rv適配子后，可通過選擇H37Rv適配子或適配子組合構(gòu)建基于適配子的三明治夾心ELISA檢測體系來進(jìn)行臨床菌株的檢測。
[0035]本發(fā)明將SELEX技術(shù)引進(jìn)結(jié)核分枝桿菌的研宄領(lǐng)域，以H37Rv為靶物質(zhì)，篩選獲得H37Rv的適配子，為進(jìn)一步利用適配子技術(shù)進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌的診斷檢測提供依據(jù)。
[0036]下面將通過本發(fā)明應(yīng)用的具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行解釋。
[0037]實(shí)施例1
[0038]在本實(shí)施例中，首先制備結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv的的ssDNA適配子，然后利用其進(jìn)行細(xì)菌學(xué)檢測，包括以下步驟:
[0039]步驟1:
[0040](I)待測菌株制備:
[0041]將結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv和15種非結(jié)核分枝桿菌(NTM)轉(zhuǎn)種至含有10%OADC (含油酸、白蛋白、葡萄糖和過氧化氫酶)營養(yǎng)添加劑的米氏7H9液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期，轉(zhuǎn)至1.5ml離心管中，12000rpm離心5min，I X PBS洗滌兩遍，80°C水浴，滅火30min。滅火后轉(zhuǎn)至磨菌管，磨菌后調(diào)整池度至lmg/ml。
[0042]8種非分枝桿菌均從血平板上刮取生長良好的菌落，用上述同樣的方法處理