專利名稱：結核分支桿菌診斷及耐藥分析芯片及其制備工藝和使用方法
技術領域：
本發(fā)明涉及醫(yī)學體外診斷技術，具體的講是一種基因芯片及其制備工藝和使用方法。
背景技術：
由結核分支桿菌(TB)引起的結核病是現(xiàn)今世界上最普遍的人類傳染病之一，雖然已在世界范圍內(nèi)實行疫苗預防，偏遠地區(qū)和生活水平低下的地區(qū)，甚至某些城市還可以發(fā)現(xiàn)它的蹤跡，結核的防治仍是一個全球性健康問題。我國現(xiàn)有結核病人約600多萬，每年還至少有113萬新生結核病例發(fā)生，每年因結核病死亡人數(shù)高達25萬，且75％的結核病例發(fā)生在15-50歲的青壯年當中，嚴重影響了我國國民經(jīng)濟和人口素質發(fā)展。治療結核需長期用藥，日益嚴重的結核菌耐藥性給臨床治療帶來極大困難，自90年代初，結核菌多耐藥株的報告漸有增加，人力和財力的浪費不可避免。有資料表明，結核分支桿菌特定基因變異于耐藥有很大相關性。因此，對病毒性肝炎快速、有效的診斷是預防和治療肝炎的必要條件。
目前檢測結核主要依賴于從患者的分泌物和組織中分離或培養(yǎng)出結核桿菌，并結合臨床癥狀做出診斷。但由于結核桿菌的生物特性和檢測技術的限制，鏡檢簡單快速，卻需要有相當數(shù)量的結核菌，而且要用特殊的染色技術；結核菌培養(yǎng)的時間和技術要求都限制了這種方法的進一步發(fā)展。放免法也被用于對結核菌的檢測，雖然迅速，卻不能達到很高的靈敏度。長期以來，很多研究人員都致力于發(fā)明一種高效，高靈敏度，高特異性的結核菌檢測方法。

發(fā)明內(nèi)容
1、發(fā)明目的本發(fā)明提供了一種結核分支桿菌診斷及耐藥分析芯片及其制備工藝和使用方法，其目的在于解決目前檢測結核桿菌需要有相當數(shù)量的結核菌，而且要用特殊的染色技術及不能達到高效，高靈敏度等方面存在的問題。
2、技術方案本發(fā)明是通過以下技術方案來加以實現(xiàn)的一種結核分支桿菌診斷及耐藥分析芯片及其制備工藝和使用方法，其特征在于該芯片為玻璃基片上分布有多個不同區(qū)域的微陣列，在每個微陣列區(qū)域中，分別固定有結核分支桿菌型及不同型的特異性探針。
在該芯片的微陣列中，設有質控探針和多個耐藥分析探針。
探針的大小為15-25個堿基，設計75個探針，質控探針9個，所設計的探針序列見下文；本發(fā)明制備工藝按如下步驟進行(1)、設計結核特異性探針和引物；從數(shù)據(jù)庫中獲得可靠的結核分支桿菌病毒基因序列以及耐藥特征序列，根據(jù)所述的探針序列設計探針；從數(shù)據(jù)庫中獲得可靠的結核分支桿菌病毒基因序列以及耐藥特征序列，為準確鑒別不同基因型結核病原體，用引物F3、R385、F25、R568對提取的結核DNA作常規(guī)PCR或巢式PCR，擴增不同類型結核桿菌16S-18S間隔區(qū)序列，篩選47個寡核苷酸探針，鑒別不同的結核桿菌類型；選擇對乙胺丁醇、異煙肼、利福平耐藥的變異菌株特征序列，用引物F418、R621進行擴增，選擇579和579-1探針鑒別多藥耐藥基因菌株；用引物F2465、R2748擴增對喹諾酮、環(huán)丙沙星耐藥菌株的變異區(qū)核酸序列，用寡核苷酸探針n2553 m2567 n2568 m2574 m2576n2585 m2585t m2585c m2585a m2586g m2586c m2589c鑒別野生型和耐喹諾酮、環(huán)丙沙星藥型菌株；用引物F7769、R7921擴增對乙胺丁醇耐藥菌株的變異區(qū)核酸序列，用寡核苷酸探針n7855 m7868g m7870a m7870t m7870c鑒別野生型和乙胺丁醇耐藥型菌株；用引物F34、R308擴增對吡嗪酰胺耐藥菌株的變異區(qū)核酸序列，用寡核苷酸探針n169、m169鑒別野生型和吡嗪酰胺藥型菌株；(2)、合成探針；(3)、制備芯片；用去離子水將合成的探針溶解，濃度為200mmol/l，在玻璃基片上進行點樣；點好的芯片于37℃下水化3天，然后在80℃下烘干2小時；以探針緩沖液及蒸餾水沖洗玻片，吹干；以封閉液封閉玻片，之后洗滌3次，吹干備用。
對待測樣品的預處理過程中，PCR擴增引物序列見下文；探針5’端加氨基修飾。
點樣從幾十點到上千點，點的大小為50-100微米左右。
探針緩沖液為1xSSC，0.1％SDS；封閉液為1％BSA，PH＝7 0.01mol/l PB。
使用方法按如下步驟進行(1).處理樣品；取病人腦脊液少量，分別提取DNA，備用；如需長時間放置，在-20℃下凍存；(2).PCR擴增在反應管中加入擴增反應混合物——Taq酶，相應的處理好的樣品和引物，足量的dNTP以及熒光素Cy3標記的dUTP；擴增條件如下
94℃5min94℃30sec56℃30sec72℃1min72℃5min以上步驟為30個循環(huán)；(3).雜交；PCR產(chǎn)物與芯片上的探針在60℃下雜交2小時，雜交緩沖液(10xSSC，0.1％SDS)與PCR產(chǎn)物的比例為1∶1。洗滌3次。
(4).檢測；用掃描儀掃描雜交后的芯片，得到圖像并輸出結果；(5).數(shù)據(jù)分析將芯片分析結果輸出。
3、優(yōu)點及效果基因芯片是近幾年在高科技領域內(nèi)出現(xiàn)的最具時代特征的重大科技進展之一，它是物理學、化學、微電子學、精密機械與生命科學交叉綜合的高科技?；蛐酒傻牟皇请娮釉骷?，采用在位組合化學、微電子芯片光刻技術，或者利用其它方法將大量特定序列的DNA探針有序地固定在基片上，在與待測樣品DNA作用后，即可檢測到大量的生命信息，包括基因識別、基因突變和基因表達等。利用基因芯片可以快速、高效地獲取或處理大量的生命信息，它對生命科學研究、醫(yī)學診斷、新藥篩選和司法鑒定等具有革命性的推動作用。
本發(fā)明提供了一種結核分支桿菌診斷及耐藥分析芯片，將已經(jīng)合成的特異性探針矩陣固定于基片表面，通過芯片與待測樣本DNA雜交，即可獲取大量與結核分支桿菌相關的生物學信息。利用這種芯片，通過一次操作就可以同時完成結核分支桿菌型及其亞型的檢測，并對常用藥物進行耐藥特性分析。該基因芯片具有診斷準確、特異性高、信息量大的特點。如果將此芯片成功應用于臨床，必將帶來極大的經(jīng)濟效益和社會效益。
具體實施例方式本發(fā)明實施的具體步驟是1.設計結核特異性探針和引物從NCBI等數(shù)據(jù)庫獲得可靠的結核分支桿菌基因序列以及耐藥特征序列等，利用生物信息學軟件設計引物和特異性的探針。
用生物信息學相關軟件嚴格篩選引物、探針序列。為了準確鑒別不同基因型結核病原體，用引物F3、R385、F25、R568對提取的結核DNA作常規(guī)PCR或巢式PCR，擴增不同類型結核桿菌16S-18S間隔區(qū)序列，篩選47個寡核苷酸探針，鑒別不同的結核桿菌類型。選擇對乙胺丁醇、異煙肼、利福平耐藥的變異菌株特征序列，用引物F418、R621進行擴增，選擇579和579-1探針鑒別多藥耐藥基因菌株。用引物F2465、R2748擴增對喹諾酮、環(huán)丙沙星耐藥菌株的變異區(qū)核酸序列，用寡核苷酸探針n2553 m2567 n2568 m2574 m2576 n2585 m2585tm2585c m2585a m2586g m2586c m2589c鑒別野生型和耐喹諾酮、環(huán)丙沙星藥型菌株。用引物F7769、R7921擴增對乙胺丁醇耐藥菌株的變異區(qū)核酸序列，用寡核苷酸探針n7855 m7868gm7870a m7870t m7870c鑒別野生型和乙胺丁醇耐藥型菌株。用引物F34、R308擴增對吡嗪酰胺耐藥菌株的變異區(qū)核酸序列，用寡核苷酸探針n169、m169鑒別野生型和吡嗪酰胺藥型菌株。
2.合成探針由上海生物工程有限公司合成。探針5’端加氨基修飾。
3.制備芯片根據(jù)需要設定點樣程序，矩陣分布根據(jù)探針雜交動力學要求及點樣方便與否安排。用去離子水將合成的探針溶解，濃度為200mmol/l。使用CEL公司生產(chǎn)的玻璃基片，用BioRobotics公司的點樣儀按預先設定好的程序進行點樣。按照不同要求從幾十點到上千點，點的大小為50-100微米左右，點間距依點的數(shù)量而定。點好的芯片于37℃下水化3天，然后在80℃下烘干2小時。以探針緩沖液(1xSSC，0.1％SDS)及蒸餾水沖洗玻片，吹干。以封閉液(1％BSA，PH＝7 0.01mol/l PB)封閉玻片，之后洗滌3次。吹干備用。
上述結核分支桿菌診斷及耐藥分析芯片的應用方法包括以下步驟1.處理樣品取病人痰液少量，用結核桿菌PCR雜交診斷試劑盒提取DNA，備用。如需長時間放置，在-20℃下凍存。
2.PCR擴增在反應管中加入擴增反應混合物，Taq酶，處理好的樣品和引物，足量的dNTP以及熒光素(Cy3)標記的dUTP。擴增條件如下96℃5min96℃30sec
56℃30sec72℃1min72℃5min以上步驟為30個循環(huán)；3.雜交PCR產(chǎn)物與芯片上的探針在60℃下雜交2小時，雜交緩沖液(10xSSC，0.1％SDS)與PCR產(chǎn)物的比例為1∶1。洗滌3次。
4.檢測用Genomic Solutions公司的掃描儀掃描雜交后的芯片，得到圖像并輸出結果。
5.數(shù)據(jù)分析Genomic Solutions公司的掃描儀的配套分析軟件將芯片分析結果輸出。
以下結合具體的實施例對發(fā)明的技術方案作進一步的說明實施例設計結核分支桿菌引物及特異性探針75(質控探針9個)個。探針的大小為15-25個堿基。由上海生物工程有限公司合成。探針5’端加氨基修飾。
制備基因芯片用CEL公司生產(chǎn)的玻璃基片，使用BioRobotics公司的點樣儀按預先設定好的程序進行點樣。用去離子水將合成的探針溶解，濃度為200mmol/l。點好的芯片于37℃下水化3天，然后在80℃下烘干2小時。以探針緩沖液(1xSSC，0.1％SDS)及蒸餾水沖洗玻片，吹干。以封閉液(1％BSA，PH＝7 0.01mol/l PB)封閉玻片，之后洗滌3次。吹干備用。
處理樣品取臨床檢驗為結核患者的痰液少量，用結核桿菌PCR雜交診斷試劑盒提取DNA，備用。
PCR擴增采用的引物序列是5`-tgggacgaag tcgtaacaag g、5`-tgccaaggca tccaccat反應總體積為20μl，在反應管中加入10X buffer 2μl，Taq酶0.2μl，處理好的樣品0.8μl和上下游引物各2μl，dNTP0.8μl以及Cy3標記的dUTP1.2μl，其余的用H2O。擴增條件如下96℃5min96℃30sec56℃40sec
72℃1min72℃5min以上步驟為30個循環(huán)雜交PCR產(chǎn)物與芯片上的探針在60℃下雜交2小時，雜交緩沖液(10xSSC，0.1％SDS)與PCR產(chǎn)物的比例為1∶1。洗滌3次。
檢測用Genomic Solutions公司的掃描儀掃描雜交后的芯片，得到圖像并輸出結果。數(shù)據(jù)分析Genomic Solutions公司的掃描儀的配套分析軟件將芯片結果輸出。與臨床檢驗結果比較，符合率100％。
結核分支桿菌診斷及耐藥分析芯片引物序列表結核分型primer SequenceF3 5`-tgggacgaag tcgtaacaag gR3855`-tgccaaggca tccaccatF25 5`-acgttc ccgggccttgR5685`-tgacagctcc ccgaggc耐藥primer Sequenceethambutol F4185`-ggctcatatc gagaatgcrifampin R6215`-ctcatcatca aagcggacprimer Sequencequinolone F2465 5`-cgggtg ctctatgcaa tgttcciprofloxacin R2748 5`-tcctcgtcga tttccctcagprimer SequenceF7769 5`-tggcgcacct tcaccctethambutol R7921 5`-gaaccagcgg aaatagttgg acprimer SequenceF34 5`-gacttctgcgagggtggctpyrazinamide R3085`-tacgctccggtgtaggcac結核分支桿菌診斷及耐藥分析芯片探針序列表結核分型Probe Sequenceprob allatagtggtt gcgagcatc1abscessus ATCTAAACATAGCCTCGCT2africanum ATCAATGGATACGCTGCC3avium ATCTAGATGAGCGCATGG4bovis ATCAATGGATACGCTGCC5chelonae ATCTAACAAGCCTCGCTC6diernhoferiATCTAGCACGCAAGAGGA7gastri ATCAAATGGATGCGTTGC7.1 TGTCTTGGACTCGTCCAA8gilvum ATCGAAAGATGGTGCACA9gordonae ATCAAAATGTATGCGTTGTC10intracellulareATCTAGATGAGCGCATAGT11kansasii ATCAAATGGATGCGTTGCC11.1AACACTCGGGCTCTGTTC12marinum ATCAATTGGATGCGCTGC12.1ATCTCTGTTGGTTTCGGG13phlei ATCTGATACTTGATGCTCCT14scrofulaceum ATCTAAACGGATGCGTTGC
15smegmatis ATCTAGTTCGTAAGAGTGTG16szulgaiATCAATTGGATGCGCTGC16.1 ACTCAGGCTTGGCCAGAG17terrae ATCTAACAAGCAGATTTTTGG18triviale ATCTAGCAGATGAGATCTCT19tuberculosis ATCAATGGATACGCTGCC20vaccae ATCTGAATGCACAGCGCT21xenopi ATCTGGCAAAGACTGTGG22abscessus ACCCTGCTTGGTGGTGG23africanum AGGTGTTGTCCCACCGC24avium CCTCCATCTTGGTGGTG25bovis AGGTGTTGTCCCACCG26chelonae ACCCTGCTTGGTGGTG27diernhoferiCGGTGTCTGTTGTTGCTC28gastri AGAGTGTTGTCCCACCAT29gilvum GGGTCGGTGTGTTGTTG30gordonae GGGTGCTGTCCCCCCA31intracellulare CCTCCATCTTGGTGGTGG32kansasii AGAGTTGTCCCACCATCT33marinumGGGATGTTGTCCCACCAT34phlei GGGTGCCGGTGTGTTG35scrofulaceum TGAGTGGTGTCCCTCCA36smegmatis GGCGTGTTGTTGCCCTG37szulgaiGAGCTGTTGTCCCACCA38terrae GCCTCACACTTGGTGGT39triviale TCACCGGTTTTGGTGTGG40tuberculosis GGTGTTGTCCCACCGC41vaccae GGGTCGGCGTGTTGTT42xenopi TGGTGGCGGGGTGTGG43fortuitum ATCACCTCCTTTCTAAGGAGCAC耐藥Probe Seq uence579 5`-atggaatgtc gcaaccaaat gethambutol579-15`-atagaatgtc gcaaccaaat gisoniazidrifampinprimer SequenceF2465 5`-cgggtg ctctatgcaa tgttcR2748 5`-tcctcgtcga tttccctcagProbe Sequencequinolonen25535`-actac accac ccgcacggcciprofloxacinm25675`-actaccac ccgcactgcgn25685`-gcg acgcgtcgat ctacgm25745`-ggcg acgtgtcgat ctacgm25765`-gcg acgcgtcgat ctan25855`-at ctacgacagc ctggtgcg
m2585t5`-at ctactacagc ctggtgcgcm2585c5`-t ctaccacagc ctggtgcgcm2585a5`-ctacaacagc ctggtgcgcm2586g5`-cgat ctacggcagc ctggm2586c5`-cgat ctacgccagc ctggm2589c5`-tcgat ctacgacacc ctggtgProbe Sequencen7855 5`-ctacatcctg ggcatggccm7868c5`-tacatcctg ggcctggccm7868g5`-catcctg ggcgtggccm7870a5`-gggcatagcc cgagtcgm7870t5`-gggcattgcc cgagtcgethambuto m7870c5`-gggcatcgcc cgagtcProbe Sequencen169 5`-acc cgggtgacga cttctcpyrazinamidem169 5`-acc cgggtgacca cttctc
權利要求
1.一種結核分支桿菌診斷及耐藥分析芯片及其制備工藝和使用方法，其特征在于該芯片為玻璃基片上分布有多個不同區(qū)域的微陣列，在每個微陣列區(qū)域中，分別固定有結核分支桿菌型及不同型的特異性探針。
2.根據(jù)權利要求1所述的結核分支桿菌診斷及耐藥分析芯片及其制備工藝和使用方法，其特征在于在該芯片的微陣列中，設有質控探針和多個耐藥分析探針。
3.根據(jù)權利要求1所述的結核分支桿菌診斷及耐藥分析芯片及其制備工藝和使用方法，其特征在于探針的大小為15-25個堿基，設計75個探針，質控探針9個，所設計的探針序列如下結核分型ProbeSequenceprob allatagtggtt gcgagcatc1abscessus ATCTAAACATAGCCTCGCT2africanum ATCAATGGATACGCTGCC3avium ATCTAGATGAGCGCATGG4bovis ATCAATGGATACGCTGCC5chelonaeATCTAACAAGCCTCGCTC6diemhoferi ATCTAGCACGCAAGAGGA7gastri ATCAAATGGATGCGTTGC7.1TGTCTTGGACTCGTCCAA8gilvum ATCGAAAGATGGTGCACA9gordonaeATCAAAATGTATGCGTTGTC10 intracellulareATCTAGATGAGCGCATAGT11kansasii ATCAAATGGATGCGTTGCC11.1AACACTCGGGCTCTGTTC12marinumATCAATTGGATGCGCTGC12.1ATCTCTGTTGGTTTCGGG13phlei ATCTGATACTTGATGCTCCT14scrofulaceum ATCTAAACGGATGCGTTGC15smegmatis ATCTAGTTCGTAAGAGTGTG16szulgaiATCAATTGGATGCGCTGC16.1ACTCAGGCTTGGCCAGAG17terrae ATCTAACAAGCAGATTTTTGG18triviale ATCTAGCAGATGAGATCTCT19tuberculosis ATCAATGGATACGCTGCC20vaccae ATCTGAATGCACAGCGCT21xenopi ATCTGGCAAAGACTGTGG22abscessus ACCCTGCTTGGTGGTGG23africanum AGGTGTTGTCCCACCGC24avium CCTCCATCTTGGTGGTG25bovis AGGTGTTGTCCCACCG26chelonaeACCCTGCTTGGTGGTG27diernhoferi CGGTGTCTGTTGTTGCTC28gastri AGAGTGTTGTCCCACCAT29gilvum GGGTCGGTGTGTTGTTG30gordonaeGGGTGCTGTCCCCCCA31intracellulare CCTCCATCTTGGTGGTGG32kansasiiAGAGTTGTCCCACCATCT33marinum GGGATGTTGTCCCACCAT34phlei GGGTGCCGGTGTGTTG35scrofulaceumTGAGTGGTGTCCCTCCA36smegmatis GGCGTGTTGTTGCCCTG37szulgai GAGCTGTTGTCCCACCA38terrae GCCTCACACTTGGTGGT39trivialeTCACCGGTTTTGGTGTGG40tuberculosisGGTGTTGTCCCACCGC41vaccae GGGTCGGCGTGTTGTT42xenopi TGGTGGCGGGGTGTGG43fortuitum ATCACCTCCTTTCTAAGGAGCAC耐藥Probe Sequenceethambutol 579 5`-atggaatgtc gcaaccaaat gisoniazid 579-1 5`-atagaatgtc gcaaccaaat grifampinprimer SequenceF2465 5`-cgggtg ctctatgcaa tgttcR2748 5`-tcctcgtcga tttccctcagProbe Sequencen2553 5`-actaccac ccgcacggcm2567 5`-actaccac ccgcactgcgn2568 5`-gcg acgcgtcgat ctacgm2574 5`-ggcg acgtgtcgat ctacgm2576 5`-gcg acgcgtcgat ctan2585 5`-at ctacgacagc ctggtgcgm2585t 5`-at ctactacagc ctggtgcgcm2585c 5`-t ctaccacagc ctggtgcgcm2585a 5`-ctacaacagc ctggtgcgcm2586g 5`-cgat ctacggcagc ctggm2586c 5`-cgat ctacgccagc ctggqumolone m2589c 5`-tcgat ctacgacacc ctggtgciprofloxacinProbe Sequenceethambuto n7855 5`-ctacatcctg ggcatggccm7868c 5`-tacatcctg ggcctggccm7868g 5`-catcctg ggcgtggccm7870a 5`-gggcatagcc cgagtcgm7870t 5`-gggcattgcc cgagtcgm7870c 5`-gggcatcgcc cgagtcProbeSequencen1695`-acc cgggtgacga cttctcpyrazinamide m1695`-acc cgggt9acca cttctc
4.根據(jù)權利要求1所述的結核分支桿菌診斷及耐藥分析芯片及其制備工藝和使用方法，其特征在于本發(fā)明制備工藝按如下步驟進行(1)、設計結核特異性探針和引物；從數(shù)據(jù)庫中獲得可靠的結核分支桿菌病毒基因序列以及耐藥特征序列，根據(jù)所述的探針序列設計探針；從數(shù)據(jù)庫中獲得可靠的結核分支桿菌病毒基因序列以及耐藥特征序列，為準確鑒別不同基因型結核病原體，用引物F3、R385、F25、R568對提取的結核DNA作常規(guī)PCR或巢式PCR，擴增不同類型結核桿菌16S-18S間隔區(qū)序列，篩選47個寡核苷酸探針，鑒別不同的結核桿菌類型；選擇對乙胺丁醇、異煙肼、利福平耐藥的變異菌株特征序列，用引物F418、R621進行擴增，選擇579和579-1探針鑒別多藥耐藥基因菌株；用引物F2465、R2748擴增對喹諾酮、環(huán)內(nèi)沙星耐藥菌株的變異區(qū)核酸序列，用寡核苷酸探針n2553 m2567 n2568 m2574 m2576n2585 m2585t m2585c m2585a m2586g m2586c m2589c鑒別野生型和耐喹諾酮、環(huán)丙沙星藥型菌株；用引物F7769、R7921擴增對乙胺丁醇耐藥菌株的變異區(qū)核酸序列，用寡核苷酸探針n7855 m7868g m7870a m7870t m7870c鑒別野生型和乙胺丁醇耐藥型菌株；用引物F34、R308擴增對吡嗪酰胺耐藥菌株的變異區(qū)核酸序列，用寡核苷酸探針n169、m169鑒別野生型和吡嗪酰胺藥型菌株；(2)、合成探針；(3)、制備芯片；用去離子水將合成的探針溶解，濃度為200mmol/l，在玻璃基片上進行點樣；點好的芯片于37℃下水化3天，然后在80℃下烘干2小時；以探針緩沖液及蒸餾水沖洗玻片，吹干；以封閉液封閉玻片，之后洗滌3次，吹干備用。
5.根據(jù)權利要求4所述的結核分支桿菌診斷及耐藥分析芯片的使用方法，其特征在于對待測樣品的預處理過程中，PCR擴增引物序列如下結核分型primerSequenceF3 5`-tgggacgaag tcgtaacaag gR385 5`-tgccaaggca tccaccatF255`-acgttc ccgggccttgR568 5`-tgacagctcc ccgaggc耐藥primerSequenceethambutol F418 5`-ggctcatatc gagaatgcrifampin R621 5`-ctcatcatca aagcggacprimerSequencequinolone F2465 5`-cgggtg ctctatgcaa tgttcciprofloxacin R2748 5`-tcctcgtcga tttccctcagprimerSequenceF7769 5`-tggcgcacct tcaccctethambutol R7921 5`-gaaccagcgg aaatagttgg acprimerSequenceF345`-gacttctgcgagggtggctpyrazinamide R308 5`-tacgctccggtgtaggcac
6.根據(jù)權利要求4所述的結核分支桿菌診斷及耐藥分析芯片的使用方法，其特征在于探針5’端加氨基修飾。
7.根據(jù)權利要求4所述的結核分支桿菌診斷及耐藥分析芯片的使用方法，其特征在于點樣從幾十點到上千點，點的大小為50-100微米左右。
8.根據(jù)權利要求4所述的結核分支桿菌診斷及耐藥分析芯片的使用方法，其特征在于探針緩沖液為1xSSC，0.1％SDS；封閉液為1％BSA，PH＝7 0.01mol/l PB。
9.根據(jù)權利要求1所述的結核分支桿菌診斷及耐藥分析芯片的使用方法，其特征在于使用方法按如下步驟進行(1).處理樣品；取病人腦脊液少量，分別提取DNA，備用；如需長時間放置，在-20℃下凍存；(2).PCR擴增在反應管中加入擴增反應混合物——Taq酶，相應的處理好的樣品和引物，足量的dNTP以及熒光素Cy3標記的dUTP；擴增條件如下94℃5min94℃30sec56℃30sec72℃1min72℃5min以上步驟為30個循環(huán)；(3).雜交；PCR產(chǎn)物與芯片上的探針在60℃下雜交2小時，雜交緩沖液(10xSSC，0.1％SDS)與PCR產(chǎn)物的比例為1∶1。洗滌3次。(4).檢測；用掃描儀掃描雜交后的芯片，得到圖像并輸出結果；(5).數(shù)據(jù)分析將芯片分析結果輸出。
全文摘要
本發(fā)明涉及醫(yī)學體外診斷技術，具體地講是一種基因芯片——結核分支桿菌診斷及耐藥分析芯片及其制備工藝和使用方法。它是在玻璃基片上分布有多個不同區(qū)域的微陣列，在每個微陣列區(qū)域中，分別固定有結核分支桿菌型和亞型的特異性探針，另設有質控探針和多個耐藥分析探針。利用相應探針與經(jīng)擴增并加入熒光標記的結核分支桿菌DNA雜交，經(jīng)掃描儀掃描芯片，并對雜交信號進行處理分析，獲得有關信息。這種芯片能同時檢測結核分支桿菌存在與否，并分析其不同類型及耐藥特性，具有診斷快速準確、特異性高、信息量大的特點，對臨床診斷和流行病學篩查都有很大幫助。
文檔編號C12Q1/68GK1515690SQ0311145
公開日2004年7月28日 申請日期2003年4月14日 優(yōu)先權日2003年4月14日
發(fā)明者趙雨杰, 魏誠佑, 王天驕, 王紹成, 馬佳明, 何群, 馬汝海, 張玉魁, 潘忠誠, 侯偉健 申請人:趙雨杰, 魏誠佑, 王天驕, 侯偉健, 馬汝海, 王紹成, 張玉魁, 潘忠誠, 何群, 馬佳明