專利名稱：結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥突變可視化檢測(cè)探針及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于病原生物學(xué)、分子微生物學(xué)和核酸化學(xué)領(lǐng)域，涉及一種新型的基因點(diǎn)突變檢測(cè)探針的設(shè)計(jì)方法和序列，以及其在結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥突變檢測(cè)中的應(yīng)用，這種方法可以直觀快速并可視化的檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥突變。
背景技術(shù)：
由結(jié)核分枝桿菌引起的結(jié)核病(Tuberculosis,簡(jiǎn)稱TB)是一種古老的疾病,在很早以前就在世界廣泛傳播，20世紀(jì)50年代以來(lái)，異煙肼、利福平等有效治療結(jié)核藥物的發(fā)現(xiàn)，大大提高了結(jié)核病治愈率，并降低了結(jié)核病的復(fù)發(fā)率，使結(jié)核病成為一種可治愈和控制的疾病。在一些發(fā)達(dá)國(guó)家，結(jié)核病已基本得到控制。然而近些年來(lái)，由于一些國(guó)家對(duì)結(jié)核病防治工作的忽視，結(jié)核病的防治不能獲得預(yù)期效果；很多地方結(jié)核病化療方案不合理，管理不善，缺乏監(jiān)控，造成結(jié)核分枝桿菌耐藥菌株，特別是耐多藥菌株的產(chǎn)生和傳播，加大結(jié)核病治療的難度，加劇結(jié)核病疫情的惡化；加上艾滋病的流行以及經(jīng)濟(jì)全球化造成的人口廣泛流動(dòng)，促使結(jié)核病卷土重來(lái)，重新成為全球緊迫的公共衛(wèi)生問(wèn)題。到了 20世紀(jì)90年代，結(jié)核病疫情在世界的許多地方已經(jīng)失控，全球三分之一的人口感染結(jié)核分枝桿菌，每年新發(fā)結(jié)核病人約為800 1000萬(wàn)，每年約有300萬(wàn)人死于結(jié)核病。中國(guó)結(jié)核病的疫情同樣嚴(yán)峻，呈現(xiàn)患病率高、死亡率高、耐藥率高、年遞減率低的“三高一低”的勢(shì)態(tài)。當(dāng)前我國(guó)是全球22個(gè)結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)之一，結(jié)核病人總數(shù)僅少于印度，是全世界患者第二多的國(guó)家。面對(duì)這樣的形勢(shì)，科研工作者需要發(fā)展新的診斷技術(shù)和治療藥物，解決結(jié)核病防治中的棘手問(wèn)題。結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)也常簡(jiǎn)稱為結(jié)核桿菌或結(jié)核菌,是結(jié)核病的致病菌。結(jié)核分枝桿菌耐藥主要是由于基因組中藥物靶基因隨機(jī)突變?cè)斐傻?。目前使用的一線抗結(jié)核藥物主要包括利福平和異煙肼，其中利福平在細(xì)菌中的靶蛋白為RNA聚合酶的P亞基，利福平與RNA聚合酶的0亞基結(jié)合，阻礙mRNA合成，抑制轉(zhuǎn)錄過(guò)程，阻斷細(xì)菌的蛋白質(zhì)合成，達(dá)到抑菌的作用。研究表明結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥通常由其RNA聚合酶3亞基編碼基因rpoB突變所致，這些突變大部分(90%以上)位于一個(gè)81bp的區(qū)域，稱之為 RFP 耐藥決定區(qū)(Rifampicin Resistant Determination Region, RRDR)。目前耐藥結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)的方法主要是培養(yǎng)法，但結(jié)核分枝桿菌生長(zhǎng)緩慢，需要4 8周才能給出結(jié)果，而且陽(yáng)性率不高，僅為30% 40%，導(dǎo)致很多結(jié)核病人得不到及時(shí)診治。而基因突變和結(jié)核分枝桿菌耐藥性之間具有相關(guān)性，因此很多研究者發(fā)展各種突變檢測(cè)的方法，通過(guò)檢測(cè)相關(guān)的基因突變來(lái)檢測(cè)結(jié)核菌耐藥。目前研究者用于檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌耐藥突變的方法包括分子信標(biāo)和反向探針雜交，但這兩種方法操作較復(fù)雜，且需要專門的儀器。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對(duì)上述不足，提供一種針對(duì)耐藥結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)的可視化檢測(cè)探針，用于結(jié)核病利福平耐藥突變的可視化檢測(cè)。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下將rpoB基因突變核心區(qū)510-524位氨基酸分為3個(gè)區(qū)，根據(jù)每一區(qū)所包含的所有突變類型設(shè)計(jì)相應(yīng)的檢測(cè)探針簇，一共3個(gè)探針簇，每個(gè)探針簇包括若干探針組，探針組的可視化檢測(cè)探針包括錨定探針，其3’端含有3段GGG序列參與G-四鏈體形成，或其3’端含有I段GG G序列參與G-四鏈體形成；競(jìng)爭(zhēng)探針，其互補(bǔ)區(qū)與野生型靶序列完全互補(bǔ)；突變檢測(cè)探針，其互補(bǔ)區(qū)與相應(yīng)的突變型靶序列完全互補(bǔ)，其5 ‘端具有I段GGG序列參與G-四鏈體形成，或其5 ‘端具有3段GGG序列參與G-四鏈體形成；所述錨定探針的互補(bǔ)區(qū)與靶序列上的與突變檢測(cè)探針互補(bǔ)區(qū)段的下游互補(bǔ)，所述錨定探針與突變檢測(cè)探針結(jié)合在相應(yīng)的突變型靶序列上時(shí)，兩者之間能夠形成G-四鏈體；在對(duì)靶序列PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，為防止發(fā)夾結(jié)構(gòu)影響探針與靶核酸的結(jié)合，其還包括一對(duì)絕緣探針，所述絕緣探針?lè)謩e結(jié)合在錨定探針結(jié)合區(qū)域的下游和突變檢測(cè)探針結(jié)合區(qū)域的上游。在反應(yīng)體系中加入這兩個(gè)探針能與探針(錨定探針和突變檢測(cè)探針)在靶核酸結(jié)合區(qū)域的旁側(cè)區(qū)域互補(bǔ)，和單鏈靶核酸形成穩(wěn)定的雙鏈，從而打開靶核酸形成的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，有利于突變檢測(cè)探針與靶核酸的結(jié)合。針對(duì)耐藥結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)，本發(fā)明選用結(jié)核分枝桿菌RNA聚合酶3亞基編碼基因rpoB為目的基因，主要集中于其利福平耐藥決定區(qū)，這段區(qū)域負(fù)責(zé)編碼相當(dāng)于大腸桿菌RNA聚合酶3亞基507位至533位，共27個(gè)氨基酸(黃海榮，金奇，馬珣，陳曦，李惠文，莊玉輝.中國(guó)耐利福平結(jié)核分枝桿菌rpoB基因突變特點(diǎn).中華結(jié)核和呼吸雜志，2001，24(4)231 235)。具體地，將rpoB基因突變核心區(qū)510-524位氨基酸分為3個(gè)區(qū)，根據(jù)每一區(qū)所包含的所有突變類型設(shè)計(jì)相應(yīng)的檢測(cè)探針簇，一共3個(gè)探針簇，每個(gè)探針簇包含一條共有的錨定探針A，一條共有的競(jìng)爭(zhēng)探針SIB，及根據(jù)突變類型設(shè)計(jì)的一系列突變檢測(cè)探針B。探針簇包含若干探針組，分別針對(duì)檢測(cè)區(qū)域內(nèi)相應(yīng)的突變類型。本發(fā)明結(jié)核病利福平耐藥突變可視化檢測(cè)探針，其包括以下探針簇中的至少一種探針簇I，包括錨定探針，其核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示；競(jìng)爭(zhēng)探針，其核苷酸序列如SEQ ID No. 5所示；突變檢測(cè)探針，其選自SEQ ID No. 8 14所示核苷酸序列中的一個(gè)或多個(gè)；絕緣探針，包括探針L和探針R，其核苷酸序列分別如SEQ ID No. 30和SEQ IDNo. 31所示；探針簇II，包括錨定探針，其核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示；競(jìng)爭(zhēng)探針，其核苷酸序列如SEQ ID No. 6所示；突變檢測(cè)探針，其選自SEQ ID No. 15 25所示核苷酸序列中的一個(gè)或多個(gè)；絕緣探針，包括探針L和探針R，其核苷酸序列分別如SEQ ID No. 32和SEQ IDNo. 33所示；
探針簇III，包括錨定探針，其核苷酸序列如SEQ ID No. 4所示；競(jìng)爭(zhēng)探針，其核苷酸序列如SEQ ID No. 7所示；突變檢測(cè)探針，其選自SEQ ID No. 26 29所示核苷酸序列中的一個(gè)或多個(gè)；絕緣探針，包括探針L和探針R，其核苷酸序列分別如SEQ ID No. 34和SEQ IDNo. 35所示。為方便使用，本發(fā)明還包括含有所述上述可視化檢測(cè)探針的試劑盒。上述可視化檢測(cè)探針在結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥突變檢測(cè)中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供一種可視化檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥突變的方法，其包括如下步驟A、PCR擴(kuò)增待測(cè)樣品的靶核苷酸序列；B、將上述A的探針與靶核苷酸互補(bǔ)配對(duì)，并加入Hemin，通過(guò)DNA過(guò)氧化物酶所催化的顯色反應(yīng)，來(lái)判斷是否存在結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥突變。發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和效果I、可用于可視化結(jié)核分枝桿菌利福平多位點(diǎn)耐藥突變檢測(cè)，包括22種突變類型；探針簇及其包含的探針組均可很好的區(qū)分野生型序列和突變型序列，所有的探針組對(duì)相應(yīng)突變型序列和野生型序列的區(qū)分度，即探針對(duì)二者產(chǎn)生信號(hào)強(qiáng)度的比值，均大于15倍；而探針簇對(duì)突變型序列和野生型序列的區(qū)分度均大于10倍；所有結(jié)果均僅用肉眼觀察即可明確地區(qū)分突變型序列和野生型序列。2、本發(fā)明設(shè)計(jì)的探針體系包括兩個(gè)層次，可滿足不同檢測(cè)需要，探針簇可用于快速篩查結(jié)核分枝桿菌rpoB基因的利福平耐藥決定區(qū)是否存在突變；而探針組則可用于檢測(cè)某種特定突變，特別是那些與高度耐藥相關(guān)的突變類型。3、本發(fā)明設(shè)計(jì)的探針組和探針簇能夠?qū)εR床樣品來(lái)源的具有復(fù)雜二級(jí)結(jié)構(gòu)的PCR產(chǎn)物檢測(cè)表現(xiàn)出很好的區(qū)分度，目前所得結(jié)果對(duì)突變型和野生型rpoB基因PCR產(chǎn)物的區(qū)分度大于7倍。


圖I.結(jié)核分枝桿菌rpoB基因利福平(RFP)耐藥決定區(qū)突變位點(diǎn)結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥決定區(qū)，rpoB基因510-533位氨基酸，其中下劃線表示易突變的堿基。圖2. DNA過(guò)氧化物酶的不對(duì)稱拆分-組裝將DNA過(guò)氧化物酶序列d (GGGTAGGGCGGGTTGGG)，不對(duì)稱地分為兩個(gè)部分，一部分包含3段GGG序列，另一部分只含有一段GGG序列，這兩段序列的5’端或3’端分別與靶核酸相鄰區(qū)域互補(bǔ)序列融合，形成探針A和探針B。有靶DNA-C存在時(shí)，探針A和探針B與靶核酸的相鄰區(qū)域互補(bǔ)，它們中DNA過(guò)氧化物酶形成序列相互靠近，折疊為G-四鏈體結(jié)構(gòu)，與Hemin結(jié)合后，形成有活性的DNA過(guò)氧化物酶。這樣可通過(guò)DNA過(guò)氧化物酶所催化的顯色反應(yīng)，檢測(cè)溶液中靶核酸C的存在。圖3.第I探針簇對(duì)野生型序列和相應(yīng)突變型序列的選擇性第I探針簇對(duì)野生型序列和相應(yīng)突變型序列都表現(xiàn)出好的選擇性，從照片上看，探針簇本身及野生型檢測(cè)樣品基本無(wú)色，而各種突變型樣品則是很明顯的綠色(2 8)。表格為探針簇實(shí)驗(yàn)方案和結(jié)果，探針簇對(duì)相應(yīng)突變型序列的信號(hào)是對(duì)野生型信號(hào)的10倍以上。圖4.第I探針簇各探針組對(duì)野生型序列和相應(yīng)突變型序列的選擇性第I探針簇各探針組對(duì)野生型序列和相應(yīng)突變型序列都表現(xiàn)出好的選擇性，從照片上各探針組對(duì)野生型序列基本無(wú) 色，而相應(yīng)突變序列則是明顯的綠色(Ib 7b)。表格為各探針組實(shí)驗(yàn)方案和結(jié)果，所有的探針組對(duì)相應(yīng)突變型序列的信號(hào)是對(duì)野生型信號(hào)的15倍以上。圖5.第2探針簇對(duì)野生型序列和相應(yīng)突變型序列的選擇性第I探針簇對(duì)野生型序列和相應(yīng)突變型序列都表現(xiàn)出好的選擇性，從照片上看，探針簇本身及野生型檢測(cè)樣品基本無(wú)色，而各種突變型樣品則是很明顯的綠色(2 12)。表格為探針簇實(shí)驗(yàn)方案和結(jié)果，探針簇對(duì)相應(yīng)突變型序列的信號(hào)是對(duì)野生型信號(hào)的10倍以上。圖6.第2探針簇各探針組對(duì)野生型序列和相應(yīng)突變型序列的選擇性第2探針簇各探針組對(duì)野生型序列和相應(yīng)突變型序列都表現(xiàn)出好的選擇性，從照片上各探針組對(duì)野生型序列基本無(wú)色，而相應(yīng)突變序列則是明顯的綠色(Ib Ilb)。表格為各探針組實(shí)驗(yàn)方案和結(jié)果，所有的探針組對(duì)相應(yīng)突變型序列的信號(hào)是對(duì)野生型信號(hào)的15倍以上。圖7.第3探針簇對(duì)野生型序列和相應(yīng)突變型序列的選擇性第3探針簇對(duì)野生型序列和相應(yīng)突變型序列都表現(xiàn)出好的選擇性，從照片上看，探針簇本身及野生型檢測(cè)樣品基本無(wú)色，而各種突變型樣品則是很明顯的綠色(2 5)。表格為探針簇實(shí)驗(yàn)方案和結(jié)果，探針簇對(duì)相應(yīng)突變型序列的信號(hào)是對(duì)野生型信號(hào)的10倍以上。圖8.第3探針簇各探針組對(duì)野生型序列和相應(yīng)突變型序列的選擇性第3探針簇各探針組對(duì)野生型序列和相應(yīng)突變型序列都表現(xiàn)出好的選擇性，從照片上各探針組對(duì)野生型序列基本無(wú)色，而相應(yīng)突變序列則是明顯的綠色(Ib 4b)。表格為各探針組實(shí)驗(yàn)方案和結(jié)果，所有的探針組對(duì)相應(yīng)突變型序列的信號(hào)是對(duì)野生型信號(hào)的15倍以上。圖9 第I探針簇對(duì)突變型菌株Gln513Lys的檢測(cè)第I探針簇對(duì)利福平耐藥結(jié)核分枝桿菌ropB基因突變情況的檢測(cè)，探針簇對(duì)野生型菌株P(guān)CR產(chǎn)物及對(duì)照基本無(wú)色，而突變型菌株P(guān)CR產(chǎn)物則呈現(xiàn)明顯的綠色(d)。探針簇對(duì)突變型菌株產(chǎn)物信號(hào)是對(duì)野生型信號(hào)的7倍以上。檢測(cè)結(jié)果耐藥結(jié)核分枝桿菌在510-513位氨基酸區(qū)域有突變，與測(cè)序結(jié)果相符。圖10.第I探針簇第5探針組對(duì)突變型菌株Gln513Lys的檢測(cè)第I探針簇第5探針組對(duì)利福平耐藥結(jié)核分枝桿菌ropB基因突變情況的檢測(cè)，探針組對(duì)野生型菌株P(guān)CR產(chǎn)物及對(duì)照基本無(wú)色，而突變型菌株產(chǎn)物則呈現(xiàn)明顯的綠色(d)，探針組對(duì)突變型菌株產(chǎn)物信號(hào)是對(duì)野生型信號(hào)的7倍以上。檢測(cè)結(jié)果耐藥結(jié)核分枝桿菌為513位氨基酸突變，CAA突變?yōu)锳AA，與測(cè)序結(jié)果相符。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。若無(wú)特別說(shuō)
明，本發(fā)明中所涉及到的實(shí)驗(yàn)均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知常規(guī)操作。實(shí)施例II. DNA過(guò)氧化物酶突變檢測(cè)探針體系的設(shè)計(jì)(I) rpoB基因突變核心區(qū)序列如圖I所示本發(fā)明包含510位到524位氨基酸的22種突變類型(圖I中下劃線標(biāo)記)，具體
突變及相應(yīng)的檢測(cè)探針如下表
權(quán)利要求
1.結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥突變可視化檢測(cè)探針，其包括以下探針簇中的至少一種 探針簇I，包括 錨定探針，其核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示； 競(jìng)爭(zhēng)探針，其核苷酸序列如SEQ ID No. 5所示； 突變檢測(cè)探針，其選自SEQ ID No. 8 14所示核苷酸序列中的一個(gè)或多個(gè)； 絕緣探針，包括探針L和探針R，其核苷酸序列分別如SEQ ID No. 30和SEQ ID No. 31所示； 探針簇II,包括 錨定探針，其核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示； 競(jìng)爭(zhēng)探針，其核苷酸序列如SEQ ID No. 6所示； 突變檢測(cè)探針，其選自SEQ ID No. 15 25所示核苷酸序列中的一個(gè)或多個(gè)； 絕緣探針，包括探針L和探針R，其核苷酸序列分別如SEQ ID No. 32和SEQ ID No. 33所示； 探針簇III，包括 錨定探針，其核苷酸序列如SEQ ID No. 4所示； 競(jìng)爭(zhēng)探針，其核苷酸序列如SEQ ID No. 7所示； 突變檢測(cè)探針，其選自SEQ ID No. 26 29所示核苷酸序列中的一個(gè)或多個(gè)； 絕緣探針，包括探針L和探針R，其核苷酸序列分別如SEQ ID No. 34和SEQ ID No. 35所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的可視化檢測(cè)探針，其包括所述探針簇I、探針簇II和探針簇III。
3.含有權(quán)利要求I或2所述可視化檢測(cè)探針的試劑盒。
4.權(quán)利要求I或2所述可視化檢測(cè)探針在結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥突變檢測(cè)中的應(yīng)用。
5.一種可視化檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥突變的方法，其包括如下步驟 A、PCR擴(kuò)增待測(cè)樣品的靶核苷酸序列； B、將權(quán)利要求I或2所述的探針與靶核苷酸互補(bǔ)配對(duì)，并加入Hemin，通過(guò)DNA過(guò)氧化物酶所催化的顯色反應(yīng)，來(lái)判斷是否存在結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥突變。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥突變可視化檢測(cè)探針及其應(yīng)用。本發(fā)明針對(duì)利福平耐藥突變，根據(jù)結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥的rpoB基因突變核心區(qū)510-524位氨基酸分為3個(gè)區(qū)，根據(jù)每一區(qū)所包含的所有突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)合成3個(gè)檢測(cè)探針簇，每個(gè)探針簇包含若干探針組，每個(gè)探針組含一種特定的突變檢測(cè)探針B，此法設(shè)計(jì)的各探針組和探針簇對(duì)合成的野生型和突變型檢測(cè)片段有良好的區(qū)分性，并能準(zhǔn)確檢測(cè)利福平耐藥結(jié)核分枝桿菌rpoB基因510-524位氨基酸具體的突變位點(diǎn)，具有良好的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12N15/11GK102628086SQ20121012188
公開日2012年8月8日 申請(qǐng)日期2012年4月24日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月24日
發(fā)明者馮爍, 周翔, 孫小明, 章曉聯(lián), 羅鳳玲, 鄧明剛 申請(qǐng)人:武漢大學(xué)