血清shbg蛋白作為肺結(jié)核病人血清標(biāo)志物及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種血清標(biāo)志物的應(yīng)用，具體為一種血清SHBG蛋白作為肺結(jié)核病人血清標(biāo)志物及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]結(jié)核病是由結(jié)核桿菌感染引起的慢性傳染病，潛伏期4?8周，其中80%發(fā)生在肺部。我國(guó)屬于全球22個(gè)結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家之一，患病人數(shù)僅次于印度，位居世界第二位，除了患病人數(shù)多，我國(guó)結(jié)核病耐藥的嚴(yán)重程度在全球范圍內(nèi)僅次于俄羅斯，耐藥性泛濫將會(huì)使結(jié)核病控制返回到無(wú)化療時(shí)代，而當(dāng)今世界約有三分之二的結(jié)核病人處于發(fā)生耐多藥的危險(xiǎn)之中。因此，結(jié)核病和耐藥結(jié)核病已成為我國(guó)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生和社會(huì)問(wèn)題。由于目前臨床常規(guī)的痰涂片和痰培養(yǎng)檢測(cè)結(jié)核桿菌的方法，存在檢出率低和/或培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)等問(wèn)題，遠(yuǎn)不能滿足臨床檢測(cè)的需求；同時(shí)目前臨床的抗結(jié)核病藥物治療存在耐藥，肝功損害、胃腸道不適、過(guò)敏等副作用，以及抗癆藥物修復(fù)病灶能力差，后遺癥等問(wèn)題，因此，開(kāi)發(fā)新的疾病標(biāo)志物，對(duì)結(jié)核病的防治具有重要意義。近年來(lái)，隨著質(zhì)譜技術(shù)的飛速發(fā)展和蛋白質(zhì)組學(xué)研究的深入，產(chǎn)生了血清定量蛋白組學(xué)新技術(shù)，該技術(shù)旨在應(yīng)用質(zhì)譜技術(shù)篩選和鑒定不同疾病循環(huán)血清中的標(biāo)志物，利用該技術(shù)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)和確定了許多新的疾病標(biāo)志物，為進(jìn)一步揭示疾病的致病機(jī)制，引導(dǎo)新的藥物靶標(biāo)的發(fā)現(xiàn)提供了重要的線索，本發(fā)明就是血清定量蛋白組學(xué)技術(shù)在結(jié)核病研究中的新發(fā)現(xiàn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是提供一種血清SHBG蛋白作為肺結(jié)核病人血清標(biāo)志物及其應(yīng)用，解決現(xiàn)有技術(shù)存在的檢出率低和/或培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)的問(wèn)題，同時(shí)解決目前臨床的抗結(jié)核病藥物治療存在耐藥，肝功損害、胃腸道不適、過(guò)敏等副作用，以及抗癆藥物修復(fù)病灶能力差，后遺癥的問(wèn)題。適用于肺結(jié)核病血清輔助檢測(cè)，發(fā)病機(jī)制研究和抗結(jié)核病藥物開(kāi)發(fā)。
[0004]本發(fā)明的技術(shù)方案是:一種血清SHBG(Sex hormone-binding globulin)蛋白作為肺結(jié)核病人血清標(biāo)志物，是利用iTRAQ (isobaric tags for relative and absolutequantitat1n, iTRAQ)結(jié)合MALD1-TOF/MS技術(shù)檢測(cè)涂陰肺結(jié)核病病人、涂陽(yáng)肺結(jié)核病人、耐藥肺結(jié)核病人、肺炎病人和正常人的血清，SHBG蛋白在涂陰、涂陽(yáng)肺結(jié)核和耐多藥肺結(jié)核病人血清中表達(dá)水平明顯高于肺炎病人和正常人的血清中表達(dá)水平，ELISA和免疫組織化學(xué)也驗(yàn)證SHBG蛋白在肺結(jié)核病人血清和組織中高表達(dá)。
[0005]所述SHBG蛋白在肺結(jié)核病人血清和組織中高表達(dá)是指以下5個(gè)肽段表達(dá)水平增高:IALGGLLFPASNLR，QAEISASAPTSLR，LPLVPALDGCLR，SCDVESNPGIFLPPGTQAEFNLR，WHQVEVK。
[0006]本發(fā)明的顯著效果在于:
[0007]采用基于iTRAQ標(biāo)記的定量蛋白質(zhì)組學(xué)對(duì)結(jié)核病的全面系統(tǒng)的研究，得到一種血清SHBG蛋白作為結(jié)核病人血清標(biāo)志物，該標(biāo)志物經(jīng)過(guò)大樣本的血清ELISA和免疫組織化學(xué)的驗(yàn)證，結(jié)果更為可靠，可為臨床應(yīng)用提供有價(jià)值的信息。
【附圖說(shuō)明】
[0008]圖1.SHBG的iTRAQ的相對(duì)定量分析圖
[0009]SCDVESNPGIFLPPGTQAEFNLR肽段的iTRAQ的相對(duì)定量分析圖，與正常人和肺炎比，該肽段在肺結(jié)核病血清中明顯高表達(dá)。
[0010]圖2.ELISA檢測(cè)SHBG的表達(dá)水平圖
[0011]Healthy control:正常對(duì)照，Pneumonia:肺炎，SNP-TB:涂陰肺結(jié)核病，DR-TB:耐藥肺結(jié)核病，SPP-TB:涂陽(yáng)肺結(jié)核病，ELISA檢測(cè)血清SHBG的表達(dá)水平，與正常對(duì)照和肺炎相比，SHBG蛋白的表達(dá)水平在涂陰肺結(jié)核病病人，耐藥肺結(jié)核病人、涂陽(yáng)肺結(jié)核病人血清中明顯高表達(dá)。
[0012]圖3.免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SHBG蛋白的表達(dá)水平
[0013]免疫組織化學(xué)檢測(cè)SHBG蛋白在肺結(jié)核組織和對(duì)照組織中的表達(dá)水平。與對(duì)照組比，SHBG蛋白在肺結(jié)核病組織中明顯高表達(dá)。
【具體實(shí)施方式】
[0014]以下通過(guò)具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步描述。
[0015]實(shí)施例1
[0016]血清定量蛋白組技術(shù)檢測(cè)SHBG蛋白五個(gè)肽段在結(jié)核病人血清中表達(dá)增高
[0017]1.檢測(cè)樣本:耐多藥結(jié)核病、涂陰結(jié)核病、涂陽(yáng)結(jié)核病、肺炎病人和正常對(duì)照血清各10例。清晨空腹采集2mL全血，4°C靜置l_2h待血液凝固析出血清，3000g離心lOmin，收集上清液，冰上分裝后存至-80°C備用。
[0018]2.檢測(cè)方法:(I)去除高豐度蛋白:按照多重親和去除系統(tǒng)humanl4色譜柱操作說(shuō)明，去除血清高豐度蛋白，將收集到的餾分用凍干機(jī)濃縮。(2)脫鹽和蛋白含量檢測(cè):除高豐度蛋白后的血清用3000MWC0超濾離心管，加入50mmol/L pH 8.5三乙胺碳酸氫緩沖液，反復(fù)3次，脫鹽和收集蛋白片段；采用BCA法測(cè)定血清蛋白含量，每組低豐度蛋白取100 μ g/管，凍干。(3)蛋白酶解和標(biāo)記iTRAQ:將干燥樣品加入胰蛋白酶，37°C消化過(guò)夜；酶解樣品真空干燥后，溶于iTRAQ溶液緩沖液中；iTRAQ試劑113、117、118、119、120分別標(biāo)記健康對(duì)照組、耐多藥組、涂陽(yáng)組、涂陰組和肺炎組血清蛋白多肽，標(biāo)記后的樣品經(jīng)過(guò)C18spin column除鹽柱除鹽，凍干。(4)離線二維液相色譜分離與點(diǎn)革E:干燥的標(biāo)記樣品用上樣緩沖液A(10mmOl/L KH2P04, 25% CAN, pH 2.7)復(fù)溶并稀釋10倍，上樣到SCX預(yù)裝柱，經(jīng)上樣緩沖液A洗滌后，用含有KCl濃度分別為35、50、75、100、125、150、175、200、250和300mmol/L的緩沖液B分布洗脫，收集不同梯度濃度條件下洗脫的多肽。收集到的各組份樣品稀釋后進(jìn)行反相C18柱梯度淋洗和點(diǎn)靶。(5)質(zhì)譜分析與數(shù)據(jù)處理:標(biāo)記肽段的串聯(lián)質(zhì)譜鑒定和相對(duì)定量分析采用ABI公司的5800MALD1-T0F/T0F蛋白分析儀，質(zhì)譜分析數(shù)據(jù)用Protein Pilot 2.0對(duì)SWISSPR0T數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索鑒定蛋白，報(bào)告置信度高于95%的蛋白，同時(shí)各組檢測(cè)數(shù)據(jù)與113報(bào)告離子的峰面積積分進(jìn)行相對(duì)定量分析，選擇P ^ 0.05的結(jié)果進(jìn)行報(bào)告。(6)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:應(yīng)用SPSS14.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以mean土 SD表示，兩樣本均數(shù)間的比較采用t檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
[0019]3.檢測(cè)結(jié)果:質(zhì)譜共鑒定到SHBG蛋白5個(gè)唯一肽段IALGGLLFPASNLR，QAEISASAPTSLR，LPLVPALDGCLR, SCDVESNPGIFLPPGTQAEFNLR，WHQVEVK，總體覆蓋率 22.4%，117/113 = 5.706，118/113 = 6.0681，11