水貂阿留申病毒膠體金免疫層析檢測試紙條及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及膠體金檢測試紙條技術領域，具體涉及一種水貂阿留申病毒膠體金免疫層析檢測試紙條及其制備方法。
【背景技術】
[0002]水紹阿留申病(Aleutian Disease, AD)是由水紹阿留申病毒(Aleutian MinkDisease Virus, AMDV)引起的一種免疫系統(tǒng)紊亂、代謝異常的慢性傳染病。水貂阿留申病可以嚴重影響水貂的毛皮質量，損害其生育能力，降低存活率，給養(yǎng)貂業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失，被稱為毛皮動物三大疫病之一，目前國內外主要通過檢測淘汰來防控該水貂阿留申病。
[0003]目前，常規(guī)的AD檢測技術主要是采用對流免疫電泳(CIEP)，但該方法檢測步驟繁瑣、耗時，需要專業(yè)人員進行操作且主要依賴實驗室，這些弊端嚴重阻礙了水貂阿留申病檢測的普及和推廣。因此，研究一種簡單、快捷的AD檢測方法具有十分重要的意義。

【發(fā)明內容】

[0004]為了解決現(xiàn)有的AD檢測技術存在的檢測步驟繁瑣、耗時，需要專業(yè)人員進行操作且檢測主要依賴實驗室的問題，本發(fā)明提供一種水貂阿留申病毒膠體金免疫層析檢測試紙條及其制備方法。
[0005]本發(fā)明為解決技術問題所采用的技術方案如下:
[0006]本發(fā)明的水貂阿留申病毒膠體金免疫層析檢測試紙條，包括PVC底板，依次粘帖在PVC底板上的樣品墊、金標結合墊、帶有檢測線和質控線的硝酸纖維素膜、吸收墊；所述金標結合墊包被有水貂阿留申病毒單克隆抗體C5與膠體金的偶聯(lián)標記物，所述硝酸纖維素膜上的檢測線包被有水貂阿留申病毒單克隆抗體E3，所述硝酸纖維素膜上的質控線包被有羊抗鼠IgG。
[0007]本發(fā)明還提供了上述水貂阿留申病毒膠體金免疫層析檢測試紙條的制備方法，包括以下步驟:
[0008]步驟一、水貂阿留申病毒單克隆抗體C5、E3的制備:選6?8周齡的雌性Balb/c小鼠，腹腔注射降植烷0.5mL/只，7天后分別腹腔注射兩株水貂阿留申病毒單克隆抗體雜交瘤細胞，接種量均為4X 16?6X10 6細胞/mL/只；待小鼠腹部膨大后分別抽取腹水，5000rpm離心15min，取上清備用；將腹水上清分別用50 %飽和度的硫酸銨鹽析2次，透析除鹽后，獲得純化的水貂阿留申病毒單克隆抗體C5和水貂阿留申病毒單克隆抗體E3 ;
[0009]步驟二、水貂阿留申病毒單克隆抗體C5與膠體金的偶聯(lián)標記物的制備:逐級稀釋法確定水貂阿留申病毒單克隆抗體C5與膠體金溶液的用量比例為8.8 μ g?9.6 μ g:1mL,按照此用量比例逐滴加入水貂阿留申病毒單克隆抗體C5，再加入終濃度為5%的牛血清白蛋白，攪拌后獲得水貂阿留申病毒單克隆抗體C5與膠體金的偶聯(lián)標記物，采用低溫超速離心法對該偶聯(lián)標記物進行純化；
[0010]步驟三、試紙條的組裝:采用噴金儀將水貂阿留申病毒單克隆抗體C5與膠體金的偶聯(lián)標記物噴在玻璃纖維素膜，室溫條件下自然干燥，密封，獲得金標結合墊；采用劃膜儀將水貂阿留申病毒單克隆抗體E3、羊抗鼠IgG分別劃膜于硝酸纖維素膜上的檢測線和質控線上；將處理好的樣品墊、金標結合墊、硝酸纖維素膜依次粘帖在PVC底板上，切條、組裝、密封，獲得水貂阿留申病毒抗體膠體金檢測試紙條，室溫保存。
[0011]進一步的，步驟一中，兩株水貂阿留申病毒單克隆抗體雜交瘤細胞采用以下方法制備:將提純的水貂阿留申病毒接種Balb/c小鼠，加強免疫后，收集其脾細胞，與事先準備好的骨髓瘤細胞進行融合，用I % HAT培養(yǎng)液培養(yǎng)；融合2周左右，采用間接ELISA方法篩選出兩株陽性雜交瘤細胞株，并對篩選后的兩株陽性雜交瘤細胞進行克隆，得到兩株水貂阿留申病毒單克隆抗體雜交瘤細胞株。
[0012]進一步的，所述膠體金溶液采用檸檬酸三鈉還原法制備:取I %氯金酸溶液1ml，加入99ml的超純水配置成終濃度為0.01 %的氯金酸溶液，加熱至沸騰后，加入I %檸檬酸三鈉Iml并繼續(xù)加熱，溶液由淡黃色轉為藍黑色最終變?yōu)榫萍t色，顏色穩(wěn)定后繼續(xù)加熱5分鐘，室溫冷卻，獲得膠體金溶液，4°C保存?zhèn)溆?，膠體金顆粒直徑為40nm。
[0013]進一步的，步驟二中，所述逐級稀釋法確定水貂阿留申病毒單克隆抗體C5與膠體金溶液的用量比例的具體過程如下:用0.lmol/L的碳酸鉀溶液調節(jié)膠體金溶液的PH值為
8.4，向11支離心管中分別加入Iml膠體金溶液；將水貂阿留申病毒單克隆抗體C5逐級稀釋后即含量分別為 2 μ g、4 μ g、6 μ g、8 μ g、10 μ g、12 μ g、14 μ g、16 μ g、18 μ g、20 μ g，按照上述順序加入到2號管至11號管中，并與離心管中的膠體金溶液混勻，5分鐘后在2號管至11號管中分別加入10%的氯化鈉溶液ImL混勻，室溫靜置2小時以上觀察結果，I號管為空白對照；
[0014]2號管至4號管中，出現(xiàn)由紅變藍的聚沉現(xiàn)象，5號管至11號管中，保持膠體金的紅色不變；因此，膠體金紅色不變且水貂阿留申病毒單克隆抗體C5加入量最低的離心管即5號管中的水貂阿留申病毒單克隆抗體C5含量，即為穩(wěn)定ImL膠體金溶液所需的最低穩(wěn)定量，在該最低穩(wěn)定量的基礎上再加上10%?20%即為穩(wěn)定Iml膠體金溶液所需的水貂阿留申病毒細胞單克隆抗體C5的實際使用量，即水貂阿留申病毒細胞單克隆抗體C5與膠體金溶液的用量比例為:8.8 μ g?9.6 μ g:1mLo
[0015]進一步的，步驟二中，采用低溫超速離心法對該偶聯(lián)標記物進行純化的具體過程如下:首先將體積為V的金標水貂阿留申病毒單克隆抗體C5在4°C下以3000rpm/min離心40分鐘，吸取上清液，棄沉淀；再將上清液在4°C下以10000rpm/min離心40分鐘，棄去上清，用0.0lmol/L、pH7.4的PBS緩沖液溶解沉淀至原體積即金標水貂阿留申病毒單克隆抗體C5的體積V，穩(wěn)定后過夜:4°C下，再以10000rpm/min離心40分鐘，棄上清，用0.0lmol/L、pH7.4的PBS緩沖液溶解沉淀至原體積即金標水貂阿留申病毒單克隆抗體C5的體積V的1/10，獲得純化的金標水貂阿留申病毒單克隆抗體C5，4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0016]進一步的，所述PBS緩沖液中含有1% BSA和0.02%疊氮鈉。
[0017]進一步的，步驟三中，水貂阿留申病毒單克隆抗體C5與膠體金的偶聯(lián)標記物的標記量為 8.8yg~9.6yg:1mL0
[0018]進一步的，步驟三中，水貂阿留申病毒單克隆抗體E3的標記量為2yg/cm。
[0019]進一步的，步驟三中，羊抗鼠IgG的標記量為4yg/cm。
[0020]本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明的水貂阿留申病毒膠體金免疫層析檢測試紙條具有特異性強、靈敏度高、簡單快速、操作簡單快捷等特點，易于推廣，適用于基層養(yǎng)殖場檢測，具有廣闊的市場前景。
[0021]本發(fā)明將酶聯(lián)免疫原理與膠體金層析技術結合，制備檢測水貂阿留申病毒膠體金免疫層析檢測試紙條并擬應用于臨床，提高水貂阿留申病的預防能力，具有操作簡單快速、檢測結果清楚易于判斷、特異性強、敏感性高、無需儀器設備等優(yōu)點，因此，非常適用于現(xiàn)場、門診等實驗條件有限的場所進行臨床樣品檢測。本發(fā)明提供了上述試紙條的制備方法，適用于工業(yè)生產(chǎn)。
【附圖說明】
[0022]圖1為本發(fā)明的水貂阿留申病毒膠體金免疫層析檢測試紙條的結構示意圖。
[0023]圖2為本發(fā)明的水貂阿留申病毒膠體金免疫層析檢測試紙條結果判定示意圖。
[0024]圖中:1、PVC底板，2、樣品墊，3、金標結合墊，4、硝酸纖維素膜，5、檢測線，6、質控線，7、吸收墊。
【具體實施方式】
[0025]本發(fā)明的水貂阿留申