病毒膠體金免疫層析檢測試紙條，包括PVC底板1、樣品墊2、金標結(jié)合墊3、帶有檢測線5和質(zhì)控線6的硝酸纖維素膜4和吸收墊7，樣品墊2、金標結(jié)合墊3、帶有檢測線5和質(zhì)控線6的硝酸纖維素膜4、吸收墊7依次粘貼在PVC底板I上，金標結(jié)合墊3包被有水貂阿留申病毒單克隆抗體C5與膠體金的偶聯(lián)標記物，硝酸纖維素膜4上的檢測線5包被有水貂阿留申病毒單克隆抗體E3，硝酸纖維素膜4上的質(zhì)控線6包被有羊抗鼠IgG。
[0026]本發(fā)明的水貂阿留申病毒膠體金免疫層析檢測試紙條的使用方法如下:
[0027]用塑料吸頭吸取待檢動物的尿液樣品于加樣孔中，5?10分鐘即可顯示結(jié)果，對比檢測線5和對照線6的顏色即可判斷被檢水貂體內(nèi)是否帶有水貂阿留申病毒或者被水貂阿留申病毒感染。
[0028]結(jié)果判斷如圖2所示:
[0029]1、陽性:在檢測線5和質(zhì)控線6處各出現(xiàn)一條紅色條帶，判定為陽性；檢測線5條帶色澤的深淺依檢測樣品中水貂阿留申病毒抗原含量的高低而變化，抗原含量越高色帶越深，反之越淺。
[0030]2、陰性:在質(zhì)控線6出現(xiàn)一條紅色條帶，檢測線5未出現(xiàn)紅色條帶，說明檢測樣品中無水貂阿留申病毒抗原存在。
[0031]3、無效:僅在檢測線5有條帶或在檢測線5和質(zhì)控線6均無明顯條帶出現(xiàn)，視為試紙條檢測無效。
[0032]以下結(jié)合實施例和附圖對本發(fā)明做進一步詳細說明。
[0033]實施例1水貂阿留申病毒單克隆抗體C5、E3的制備
[0034](I)將提純的水貂阿留申病毒接種Balb/c小鼠，加強免疫后，收集其脾細胞，與事先準備好的骨髓瘤細胞進行融合，用1% HAT培養(yǎng)液培養(yǎng)；融合2周左右，采用間接ELISA方法篩選出兩株陽性雜交瘤細胞株，并對篩選后的陽性雜交瘤細胞進行克隆，得到兩株水貂阿留申病毒單克隆抗體雜交瘤細胞株；
[0035](2)選6?8周齡的雌性Balb/c小鼠，腹腔注射降植烷0.5mL/只，7天后分別腹腔注射上述獲得的兩株水貂阿留申病毒單克隆抗體雜交瘤細胞，接種量均為4X 16?6 X 10 6細胞/mL/只；待小鼠腹部膨大后(約一周)分別抽取腹水，5000rpm離心15min，取上清備用；將腹水上清分別用50%飽和度的硫酸銨鹽析2次，透析除鹽后，獲得純化的水貂阿留申病毒單克隆抗體C5和水貂阿留申病毒單克隆抗體E3。
[0036]實施例2膠體金溶液的制備
[0037]采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金溶液:取I %氯金酸溶液lmL，加入99mL的超純水配置成終濃度為0.01 %的氯金酸溶液，加熱至沸騰后，加入I %檸檬酸三鈉ImL并繼續(xù)加熱，溶液由淡黃色轉(zhuǎn)為藍黑色最終變?yōu)榫萍t色，顏色穩(wěn)定后繼續(xù)加熱5分鐘，室溫冷卻后4°C保存?zhèn)溆?，獲得膠體金溶液。吸取少量膠體金顆粒用透射電鏡觀察，膠體金顆粒大小基本一致，分布均勻，直徑約40nm方為合格。
[0038]實施例3水貂阿留申病毒單克隆抗體C5與膠體金的偶聯(lián)標記物(金標水貂阿留申病毒單克隆抗體C5)的制備
[0039](I)逐級稀釋法確定水貂阿留申病毒單克隆抗體C5與膠體金溶液的用量比例:用0.lmol/L的碳酸鉀溶液調(diào)節(jié)膠體金溶液的PH值為8.4，取11支潔凈的離心管，編號為I號管至11號管，每管加入膠體金溶液ImL ;將純化的水貂阿留申病毒單克隆抗體C5逐級稀釋后即含量分別為 2 μ g、4 μ g、6 μ g、8 μ g、10 μ g、12 μ g、14 μ g、16 μ g、18 μ g、20 μ g，按照上述順序加入到2號管至11號管中，并與離心管中的膠體金溶液混勻，5分鐘后在2號管至
11號管中分別加入10%的氯化鈉溶液ImL混勻，室溫靜置2小時以上觀察結(jié)果；1號管中未加入水貂阿留申病毒單克隆抗體C5和氯化鈉溶液，設(shè)為對照管；
[0040]水貂阿留申病毒單克隆抗體C5加入量不足以穩(wěn)定膠體金的離心管(2號管至4號管)，即出現(xiàn)由紅變藍的聚沉現(xiàn)象，而水貂阿留申病毒單克隆抗體C5加入量達到或超過最低穩(wěn)定量的離心管(5號管至11號管)，則保持膠體金的紅色不變。因此，膠體金紅色不變且水貂阿留申病毒單克隆抗體C5加入量最低的離心管(5號管)中的水貂阿留申病毒單克隆抗體C5含量(8 μ g)，即為穩(wěn)定ImL膠體金溶液所需的最低穩(wěn)定量，在該最低穩(wěn)定量的基礎(chǔ)上再加上10%?20%即為穩(wěn)定ImL膠體金溶液所需的水貂阿留申病毒單克隆抗體C5的實際使用量，即水貂阿留申病毒單克隆抗體C5與膠體金溶液的用量比例為:8.8 μ g?9.6 μ g:1mLo
[0041](2)用0.lmol/L碳酸鉀溶液調(diào)節(jié)膠體金溶液的PH值為8.4，在磁力攪拌下，按照上述確定的水貂阿留申病毒單克隆抗體C5與膠體金溶液的用量比例(8.Syg?
9.6 μ g:1mL)向膠體金溶液中逐滴加入水貂阿留申病毒單克隆抗體C5，繼續(xù)攪拌20分鐘，加入終濃度為5%的牛血清白蛋白，再攪拌15分鐘，獲得水貂阿留申病毒單克隆抗體C5與膠體金的偶聯(lián)標記物即金標水貂阿留申病毒單克隆抗體C5，4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0042](3)金標水貂阿留申病毒單克隆抗體C5的純化
[0043]采用低溫超速離心法純化金標水貂阿留申病毒單克隆抗體C5，以去除溶液中未標記的水貂阿留申病毒單克隆抗體C5和未充分標記的膠體金以及在標記中可能形成的各種聚合物。首先將金標水貂阿留申病毒單克隆抗體C5(體積為V)在4°C下，以3000rpm/min低速離心40分鐘，小心吸取上清液，棄去沉淀；再將上清液在4°C下，以10000rpm/min離心40分鐘，棄去上清，用0.0lmol/L、ρΗ7.4的PBS緩沖液(內(nèi)含I % BSA和0.02%疊氮鈉)溶解沉淀至原體積(指的是金標水貂阿留申病毒單克隆抗體C5的體積V)，充分穩(wěn)定后過夜:4°C下，再以10000rpm/min離心40分鐘，棄去上清，用0.01mol/L、pH7.4的PBS緩沖液(內(nèi)含1%BSA和0.02%疊氮鈉)溶解沉淀至原體積(指的是金標水貂阿留申病毒單克隆抗體C5的體積V)的1/10，獲得純化的金標水貂阿留申病毒單克隆抗體C5，該純化的金標水貂阿留申病毒單克隆抗體C5位于離心管底部，為深紅色的松散沉淀，4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0044]實施例4試紙條的組裝
[0045](I)采用噴金儀(XYZ3000Dispensing Platform)將水紹阿留申病毒單克隆抗體C5與膠體金的偶聯(lián)標記物噴在玻璃纖維素膜，水貂阿留申病毒單克隆抗體C5與膠體金的偶聯(lián)標記物的標記量為8.8 μ g?9.6 μ g:1mL,室溫條件下自然干燥，密封，獲得金標結(jié)合墊3，4°C保存?zhèn)溆茫?br>[0046](2)采用劃膜儀將水貂阿留申病毒單克隆抗體E3、羊抗鼠IgG分別劃膜于硝酸纖維素膜4上的檢測線5和質(zhì)控線6上，水貂阿留申病毒單克隆抗體E3、羊抗鼠IgG的標記量分別為2 μ g/cm、4 μ g/cm，室溫條件下自然干燥，密封，獲得帶有檢測線5 (包被有純化的水貂阿留申病毒單克隆抗體E3)和質(zhì)控線6 (包被有羊抗鼠IgG)的硝酸纖維素膜4，4°C保存?zhèn)溆?
[0047](3)將上述處理好的樣品墊2、金標結(jié)合墊3、帶有檢測線5和質(zhì)控線6的硝酸纖維素膜4、吸收墊7等材料依次粘貼在PVC底板I上，切條、組裝、密封，獲得本發(fā)明的水貂阿留申病毒膠體金免疫層析檢測試紙條，室溫保存?zhèn)溆?。組裝后的試紙條如圖1所示。
[0048]實施例5特異性試驗
[0049]采用本發(fā)明的試紙條對水貂阿留申病毒(AMDV)細胞毒樣品、健康水貂尿液樣品、被水貂阿留申病毒感染的水貂尿液樣品、水貂細小病毒性腸炎病毒(MEV)滅活疫苗樣品、水貂犬瘟熱病毒(CDV)活疫苗樣品檢測。
[0050]結(jié)果顯示:僅水貂阿留申病毒細胞毒樣品和水貂阿留申病毒感