專利名稱：一種梯度凝膠電泳檢測運鐵蛋白遺傳多態(tài)性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
用水平板聚丙烯酰胺凝膠梯度電泳檢測運鐵蛋白多態(tài)性的方法，涉及使用梯度電泳技術(shù)克服單一凝膠電泳方法檢測的缺陷來分析綿羊運鐵蛋白的遺傳多態(tài)性。
背景技術(shù)：
血清運鐵蛋白是一種分子量為75000_80000kDa的鐵結(jié)合糖蛋白，電泳區(qū)帶位于球蛋白，主要功能是將鐵運輸?shù)焦撬杌蚪M織貯存器官。在動物血漿中的功能是將鐵離子
從腸道運送到機體一定部位去合成重要的運氧工具，還能結(jié)合Cu、Mn、Zn及Co等在機體生長發(fā)育和代謝中起重要作用的微量元素，因此是細胞生長和分化所必須的因子。1958年， Ashton首次在英國綿羊血清中發(fā)現(xiàn)了 TF多態(tài)性，隨后各國學者又對其他品種綿羊的TF多態(tài)性進行了廣泛的研究。前人對此研究較多采用淀粉凝膠電泳來分離蛋白酶，此方法存在著分辨率較低、 有可能低估了遺傳變異水平等缺點(孫偉.中亞以東南不同生態(tài)型綿羊品種群體遺傳學的研究[D ].揚州揚州大學，2006 )。目前研究綿羊TF多態(tài)性大多通常采用聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳。張才俊(1994)采用聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳對100頭青海黃牛的血清運鐵蛋白多態(tài)性進行了研究，發(fā)現(xiàn)青海黃牛血清運鐵蛋白位點存在6個等位基因，共構(gòu)成13個基因型(張才駿.青海黃牛血清運鐵蛋白多態(tài)性研究[J]，青海畜牧獸醫(yī)雜志， 1994，24 (6):9-11)。劉艷芬(2002)利用聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳對雷州山羊血液運鐵蛋白多態(tài)性進行了研究，共發(fā)現(xiàn)3個等位基因，4種基因型(劉艷芬，趙云濤，嚴啟濤等.雷州山羊血液運鐵蛋白多態(tài)性研究[J]，中國草食動物，2003，5:11-13)。信金偉(2009)采用聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳方法對歐拉型藏綿羊的74份血樣進行了血清運鐵蛋白多態(tài)性的研究，發(fā)現(xiàn)被檢歐拉型藏綿羊的血清TF位點上檢測出5個復等位基因，9種基因型，為高原土著品種的基因儲備積累基礎(chǔ)試驗資料(信金偉.歐拉型藏綿羊血清運鐵蛋白多態(tài)性的研究[J]，中國畜牧獸醫(yī)，2010，37 (4) :118-120)。田海寧(2011)為探討青海小尾寒羊血清運鐵蛋白不同表型的優(yōu)勢程度，采用聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳對引入青海省的89只小尾寒羊運鐵蛋白多態(tài)性進行研究，在被檢測的小尾寒羊運鐵蛋白位點上共檢測出16種基因型，受7個等位基因控制，表明引入青海小尾寒羊TF顯示出豐富的生物多樣性和高度的遺傳變異性(田海寧.青海小尾寒羊血清運鐵蛋白多態(tài)性研究[J]安徽農(nóng)業(yè)科學，2011，39
(7):4022-4023)。海思源、楊虎林、陳增國等(2010)利用聚丙烯酰胺垂直板電泳測定了四川省阿貝縣草地藏系綿羊紅原羊類群、賈洛羊類群及青海歐拉羊血清運鐵蛋白的多態(tài)性，對其遺傳特征進行了比較研究，結(jié)果顯示紅原羊運鐵蛋白有3種基因型，賈洛羊只有一種基因型(海思源、楊虎林、陳增國等.3個藏系綿羊品種血清運鐵蛋白的多態(tài)性比較[J]，四川畜牧獸醫(yī)，2010，4:30-32)。范玉霞(2008)采用聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳法對82份青?；ブ镜厣窖蜓暹\鐵蛋白進行了電泳分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)被檢山羊血清共有3種基因型，為了解青?；ブ镜厣窖虻腡F特征，為該品種的基因儲備積累實驗材料(范玉霞.青?；ブ镜厣窖蜓暹\鐵蛋白和血紅蛋白的電泳分析[J]，四川畜牧獸醫(yī)，2008, 7 (213) 30-32 )。
聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳常采用均一濃度凝膠，根據(jù)蛋白質(zhì)分子量的大小確定凝膠濃度，其工藝簡單操作方便，但由于凝膠濃度單一，運鐵蛋白在電泳過程中仍然不能得到很好的分型，效率相對而言仍較低，此外實驗過程中膠板有時候會發(fā)熱，且垂直板電泳過程為60V，lh、120V，2h，需耗費大量的時間。目前尚沒有利用水平板聚丙烯酰胺凝膠梯度電泳檢測運鐵蛋白多態(tài)性的報道，本發(fā)明旨在提供一種新的、高效、簡便、快捷的檢測運鐵蛋白遺傳多態(tài)性檢測方法，為保護和合理利用本地綿羊品種資源提供可借鑒的遺傳資料。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有研究方法存在的問題，為深入了解綿羊運鐵蛋白的遺傳多樣性，本發(fā)明所采用的水平板聚丙烯酰胺凝膠梯度電泳技術(shù)則克服了上述不足。本發(fā)明從水平板頂端到底端分別注入不同濃度的凝膠，形成梯度；在凝膠頂部孔徑較大，在凝膠的底部孔徑較小，運鐵蛋白在梯度凝膠中分型清晰，效率高，且制膠過程簡單，先采用電壓為380V預電泳10-15分鐘，然后采用740V電泳5_6個小時即可。
本發(fā)明所述的聚丙烯酰胺凝膠梯度電泳檢測運鐵蛋白遺傳多態(tài)性的方法，是采用水平板聚丙烯酰胺梯度凝膠電泳檢測運鐵蛋白多態(tài)性，所述的水平板聚丙烯酰胺梯度凝膠，從頂部到底部凝膠濃度分別為12%、8%、6% ;電泳條件為380V。為了降低電泳過程中膠板的溫度，保證實驗的順利進行；還可以對水平板進行冰水循環(huán)冷卻(保持4°C )。為達到此目的，可在電泳設(shè)備上設(shè)置冰水循環(huán)系統(tǒng)以有效降低實驗過程中膠板的溫度。本發(fā)明方法的步驟包括采取綿羊非抗凝血備用，采用水平梯度電泳法對血清TF進行電泳分析，此過程包括凝膠的制備、電極緩沖液的配制、制膠、染色等步驟，對血清TF進行多態(tài)性分析。該方法的具體操作采集綿羊非抗凝血，使其自然凝固，以3000r/min離心IOmin,分離出血清，將上清液置于滅菌干凈的青霉素小瓶中并編號。用水清洗玻璃板、晾干，將墊片放在玻璃板上，用洗滌液擦洗帶有膠帶紙的那塊平板的無膠帶紙的那個平面，將兩塊玻璃平板放在一起，用夾子將周圍固定。用針筒向玻璃平板中分別加入12%、6%、8%的膠，待膠面水平凝固后，倒出正丁醇，取走墊條及玻璃平板，在剩余平板的膠面上放置保鮮膜，防止膠變干，在膠板下墊一塊劃一條直線的白紙上，使膠下邊緣離直線大約5. 5cm，將待測的各血漿樣品瓶打開，取單層小紙片(2mm*6mm)，沾少許血衆(zhòng)，用卷紙吸取多余血衆(zhòng)，放在線的下面并注意在適當?shù)奈恢梅派蠘藴蕵悠?。加樣后將膠板放在水平循環(huán)裝置的平板上，倒入電極緩沖液，使棉布搭在膠面上，棉布緊貼膠面。電泳條件加樣后預電泳，電壓380v,電流24ma, 15_20min。電泳條帶跑出大約IOcm后，停止電泳，保留12%的部分，其余部分凝膠舍去，將凝膠在膠與玻璃板接觸的周圍用注射器注水進去，然后用所料薄膜覆蓋膠面，傾斜膠板。將膠放入裝有染色液的方盒里，過幾分鐘會出現(xiàn)條帶，通過UVI成像系統(tǒng)來成像，此時進行多態(tài)性分析。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明通過水平板梯度電泳技術(shù)分析綿羊血清運鐵蛋白遺傳多態(tài)性，可廣泛的用于蛋白質(zhì)遺傳多態(tài)性的分析，所分離蛋白質(zhì)的范圍更廣，且能辨別分子量相差較小蛋白質(zhì)，為蛋白質(zhì)遺傳多態(tài)性的研究提供技術(shù)支撐。本發(fā)明不同于聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳，其過程并不是在單一濃度的凝膠上進行，而是通過形成梯度凝膠，使凝膠從頂部到底部丙烯酰胺的濃度呈梯度變化，因此在凝膠的頂部孔徑較大，而在凝膠的底部孔徑較小，運鐵蛋白在此梯度電泳中條帶清晰、分型效率高。本方法具有簡便、靈敏、分型效率高等特點，可以分析出綿羊血清運鐵蛋白遺傳多態(tài)性，為發(fā)現(xiàn)和鑒別更多運鐵蛋白等位基因提供了檢測方法，進而為綿羊運鐵蛋白遺傳多態(tài)性的研究提供參考依據(jù)。


圖I各濃度膠長度示意圖。圖2實施例水平板梯度電泳檢測運鐵蛋白(Tf)各帶型(等位基因型)判型圖。
具體實施例方式為了更好的理解本發(fā)明，下面結(jié)合實施例進行進一步闡明本發(fā)明的內(nèi)容。實施例I :
用水平板聚丙烯酰胺凝膠梯度電泳分析綿羊血清運鐵蛋白遺傳多態(tài)性的步驟
一、選擇用于待檢驗的樣品一綿羊非抗凝血，使其自然凝固，以3000r/min離心lOmin，分離出血清，將上清液置于滅菌干凈的青霉素小瓶中并編號，置于-20°C冰箱中保存，供TF電泳用。二、制膠 ①準備膠板
用水清洗玻璃板、晾干，將墊片放在玻璃板上，用洗滌液擦洗帶有膠帶紙的那塊平板的無膠帶紙的那個平面，將兩塊玻璃平板放在一起，用夾子將周圍固定。②加膠 I、12%
取4個大tip頭，分別放標注A、B、C、DW，取A 11. 2ml+B 7. 5ml+Dff 3. 8ml于一個小燒杯中取7. 5ml C于上述小燒杯中，玻璃棒攪動(快速)用大針筒吸取上述A、B、C、DW混合液，注入膠板中，直至膠板長度的2/3處，將小針筒的正丁醇注入膠內(nèi)大約I. 5ml，大約10-20分鐘，可以看到膠面水平凝固，倒掉上面正丁醇，并用水沖洗膠面2次。2、6%:
取A I. 125ml+B I. 5ml+C I. 875ml +Dff I. 5ml于一個小燒杯中，玻璃棒攪動用大針筒吸入大約6ml注入膠面，將小針筒中大約l_2ml的正丁醇注入膠面。待膠面水平、凝固，倒出正丁醇,再用水沖洗膠面1-2次。3、8%
取Al. 5ml+Bl. 5ml+Cl. 5ml +DffI. 5ml于一個小燒杯中，玻璃棒攪動用大針筒取大約 取6ml，注入膠面，將小針筒中剩余的正丁醇注入膠面靜置，待膠面水平凝固后，倒出正丁醇。③拆膠
取走墊條及玻璃平板，在剩余的平板的膠面上放置保鮮膜，在膠板下墊一塊劃一條直線的白紙上使膠下邊緣離直線大約5. 5cm，將待測的各血漿樣品瓶打開，取單層小紙片，沾少許血漿，用卷紙吸取多余血漿，放在線的下面，并注意在適當?shù)奈恢梅派蠘藴蕵悠贰＂茈娪具^程
加樣后將膠板放在冰水循環(huán)裝置的平板上，倒入電極緩沖液，使棉布搭在膠面上，使棉布緊貼膠面、平整。電泳條件加樣后預電泳，電壓380v，電流24ma、15-20分鐘。電泳循環(huán)裝置配套有冰水循環(huán)冷卻系統(tǒng)。具體做法是將膠板放在冰水循環(huán)裝置的平板的上面，通過冰水循環(huán)裝置的平板來間接冷卻膠板(保持4°C )。三、染色
電泳條帶跑出大約IOcm后，停止電泳，保留12%的部分，其余部分凝膠舍去，將凝膠在膠與玻璃板接觸的周圍用注射器注水進去，然后用所料薄膜覆蓋膠面，傾斜膠板。將膠放入裝有染色液的方盒里，過幾分鐘會出現(xiàn)條帶，然后可以過夜放置。四、判型
從正極開始，帶型向下依次為A、B、C、D、E、F、G,根據(jù)條帶的數(shù)目分析出帶型。電泳圖見圖2
本發(fā)明所用凝膠的配制方法
A.儲備液stocksolution: Acrylamide 32g>Bisacrylamide O. 8g、加水定容至 100ml
B.凝膠緩沖液PH7. 8-7. 9、Tris 4. 54g、TEMD O. 3ml、2-mercaptoethanol (疏基乙醇)O. 15ml加水定容至100ml,并用concH2S04調(diào)整到PH 7. 8-7. 9。C. Ammonium persulfate (過硫酸銨)，100mg/50 ml D. W 以下為制作一塊板膠的用量
(總量 30) 12% A. 11. 2ml+B 7. 5ml +C 7. 5ml +D. W 3. 8ml(總量 6) 6% A. I. 125ml+B I. 5ml +C I. 5ml +D. W I. 875ml(總量 6) 8% A. I. 5ml+B I. 5ml +C I. 5ml +D. W I. 5ml制成膠后的各濃度膠長度示意圖，見圖I本發(fā)明所用電極緩沖液的配制方法
Tris 15. 74g、硼酸 2. 96g，加水定容至 2000ml,用 NaOH 調(diào)整到 ph9. O。本發(fā)明所用電極染色液的配制方法
Ig考馬斯亮藍G溶于600ml水中，然后加入120ml 6%的高氯酸溶液，最后加水直到2000ml為止。在配置時采用實驗室一個大約5000ml的標本缸，由于高氯酸原液濃度為70%，因此可以根據(jù)下式120*60%=x*70%計算出70%高氯酸的需要量(X)，然后加入水(2000-600-x)即可。
權(quán)利要求
1.一種梯度凝膠電泳檢測綿羊運鐵蛋白多態(tài)性的方法，其特征在于是采用水平板聚丙烯酰胺梯度凝膠電泳檢測運鐵蛋白多態(tài)性，所述的水平板聚丙烯酰胺梯度凝膠，從頂部到底部凝膠濃度分別為12%、8%、6% ；電泳條件為采用電壓為380V預電泳10-15分鐘，然后采用740V電泳5-6個小時。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的梯度凝膠電泳檢測綿羊運鐵蛋白多態(tài)性的方法，其特征在于在電泳過程中對水平板進行冰水循環(huán)冷卻，保持4°C。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種梯度凝膠電泳檢測運鐵蛋白遺傳多態(tài)性的方法。該方法是采用水平板聚丙烯酰胺梯度凝膠電泳檢測運鐵蛋白多態(tài)性，所述的水平板聚丙烯酰胺梯度凝膠，從頂部到底部凝膠濃度分別為12%、8%、6%；電泳條件為采用電壓為380V預電泳10-15分鐘，然后采用740V電泳5-6個小時。應(yīng)用本發(fā)明方法，運鐵蛋白能得到很好地分離，條帶清晰，無干擾現(xiàn)象且能可同時進行大批量樣本的檢測，克服垂直板凝膠電泳條帶不清晰、分型效率低等弊端。因此本發(fā)明采用的水平板聚丙烯酰胺凝膠梯度電泳具有簡便、快速、靈敏等特點，本方法為發(fā)現(xiàn)綿羊運鐵蛋白的遺傳多態(tài)性檢測提供了新的檢測方法。
文檔編號G01N27/447GK102636548SQ20121013998
公開日2012年8月15日 申請日期2012年5月8日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月8日
發(fā)明者丁家桐, 倪蓉, 周洪, 孫偉, 孫煒, 常洪, 陳玲 申請人:揚州大學