專利名稱：肺癌早期血清特異蛋白及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，本發(fā)明涉及一種新的腫瘤標志物-肺癌早期血清特異蛋白。本發(fā)明還公開了肺癌早期血清特異蛋白在診斷肺癌上的用途。本發(fā)明還提供了含肺癌早期血清特異蛋白的診斷試劑盒。
背景技術(shù)：
原發(fā)性肺支氣管癌簡稱肺癌(Lung cancer)，是原發(fā)于各級支氣管上皮的常見惡性腫瘤。肺組織細胞在一些因素的刺激下癌變，使肺組織異常增生腫大為其病理特點?？人?、胸痛、咯血、胸悶、氣急、喘鳴、消瘦及惡病質(zhì)是其主要臨床表現(xiàn)。
肺癌已成為全世界范圍內(nèi)死亡率最高的惡性腫瘤。據(jù)估算，到2002年底，全球?qū)⒂?69400例新增肺癌患者，占所有新增癌癥患者的13％；將有154900病人死于肺癌，占所有癌癥死亡患者28％，遠遠高于因乳腺癌、前列腺癌死亡的患者總和。在我國，肺癌的發(fā)病率及死亡率同樣也逐年呈上升趨勢。1963～1965年，上海市市區(qū)肺癌標化死亡率男性為28.5/10萬，女性為11.1/10萬，到1999年男性肺癌標化發(fā)病率為53/10萬，女性為19/10萬。
肺癌包括小細胞癌(Small Cell Lung Cancer，SCLC)(占肺癌的20％左右)、非小細胞癌(Non-Small Cell Lung Cancer，NSCLC)(占肺癌的80％左右)和混合型癌。其中，非小細胞癌又分為鱗狀上皮細胞癌(Squamous Cell Carcinoma)(25％～30％)、腺癌(Adenocarcinoma)(40％)、大細胞未分化癌(Large-cell UndifferentiatedCarcinoma)(10％～15％)。
外科手術(shù)是治療肺癌的首選方案。但65％的肺癌患者發(fā)現(xiàn)并明確診斷時，病情已是晚期，失去了根治手術(shù)治療的時機，約80％的患者在診斷后一年內(nèi)死亡，因此肺癌的5年生存率僅為16％。這主要是因為目前尚缺乏有效的肺癌早期診斷手段。近年來，隨著放射學、病理學及分子生物學技術(shù)的蓬勃發(fā)展，在肺癌的臨床診斷上已取得不少進展。
影像學檢測包括X線、電子計算機斷層掃描(CT)(包括新發(fā)展的CT技術(shù)如螺旋CT(Spiral CT，SCT)、高分辨率CT(High Resolution CT，HRCT))、薄層低放射劑量CT(TS-LDSCT)、磁共振斷層掃描(MRI)、正電子發(fā)射體層掃描(PositronEmission Tomograghy，PET)。
病理學檢測包括痰脫落細胞檢查、纖維支氣管鏡檢查、經(jīng)皮肺穿刺活檢等。
分子生物學檢測根據(jù)臨床送檢標本的不同，所檢測的分子生物學指標也有所不同。
胸液標本可檢測的分子生物學指標包括水溶性細胞角蛋白19片段(CYFRA21-1)、糖鏈抗原(CA242)、組織多肽抗原(TPA)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)和癌胚抗原(CEA)。
支氣管肺泡灌洗液(BALF)標本可檢測的分子生物學指標包括端粒酶及端粒酶hTERT基因表達、p53、p16及K-ras基因的突變情況、T-抗原、組織多肽抗原(TPA)。
痰液脫落細胞標本可檢測的分子生物學指標包括痰液脫落細胞p16基因甲基化狀態(tài)、p16基因外顯子2丟失的情況、異質(zhì)型細胞核核糖核蛋白(heterogeneousnuclear ribonucleoprotein，hnRNP)A2/B1的過表達、hnRNPA2/B1抗體的含量。
組織標本可檢測的分子生物學指標包括染色體微衛(wèi)星標志物的改變、線粒體DNA(mtDNA)突變、脆性組氨酸三聯(lián)體(FHIT)基因蛋白的表達、死亡相關(guān)蛋白激酶(death-associated protein kinase，DAP)基因的異常甲基化。
外周血標本可檢測的分子生物學指標包括外周血有核細胞角蛋白CK19mRNA的表達水平、LUNX mRNA陽性率。
血清標本可檢測的分子生物學指標包括p53抗體、糖類抗原-125(CA125)、癌胚抗原(CEA)、血清人絨毛膜促性腺激素(HCG)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子(TTF1)、硫酸粘多糖片段(LTA)。
但是，到目前為止所有的相關(guān)研究都是以肺癌病人為樣本，究竟這些檢測指標在肺癌高危人群或普通人群的篩查中效果如何還有待進一步的驗證。
此外，由于肺癌從細胞發(fā)生癌變到形成臨床病灶需10年左右時間，如果能夠在人體甚至細胞未出現(xiàn)任何病變前診斷出肺癌前兆，將大大提高肺癌患者的生存期。然而，到目前為止仍缺乏令人滿意的有效的肺癌早期檢測手段。
因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)新的有效地檢測肺癌，尤其是早期檢測肺癌的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種有效的肺癌早期檢測方法和試劑盒。
本發(fā)明的另一目的是提供相關(guān)的肺癌早期血清特異蛋白及其抗體。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種分離的肺癌早期血清特異蛋白，它具有以下特征(a)存在于肺癌病人的血清中，(b)用表面加強的激光解析電離化飛行-時間質(zhì)譜法(SELDI-TOF-MS)檢測時，其分子量為4.2±0.1KD、6.3±0.1KD或7.7±0.1KD。
在一優(yōu)選例中，所述的表面加強的激光解析電離化-飛行時間質(zhì)譜法檢測的條件是使用賽弗吉公司的蛋白質(zhì)生物系統(tǒng)PBS II，設(shè)定的最適激光強度為203和激光靈敏度為9。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種檢測樣品中是否存在本發(fā)明肺癌早期血清特異蛋白的方法，包括步驟(a)取血清樣品；(b)用步驟(a)的血清樣品制備弱陰離子交換(WCX2)蛋白質(zhì)芯片；(c)用表面加強的激光解析電離化-飛行時間質(zhì)譜法檢測，獲得血清蛋白質(zhì)組波譜；(d)確定是否存在分子量為4.2±0.1KD、6.3±0.1KD和7.7±0.1KD的波峰，存在所述波峰就表示存在所述的肺癌早期血清特異蛋白。
在一優(yōu)選例中，所述的表面加強的激光解析電離化-飛行時間質(zhì)譜法檢測的條件是使用賽弗吉公司的蛋白質(zhì)生物系統(tǒng)PBS II，設(shè)定的最適激光強度為203和激光靈敏度為9。
在另一優(yōu)選例中，在步驟(d)中還包括步驟與陰性對照的血清樣品的蛋白質(zhì)組波譜比較，從而確定是否存在分子量為4.2±0.1KD、6.3±0.1KD和7.7±0.1KD的波峰。
在另一優(yōu)選例中，步驟(c)中使用賽弗吉公司的蛋白質(zhì)生物系統(tǒng)PBS II。
在本發(fā)明的第三方面，提供了一種檢測本發(fā)明肺癌早期血清特異蛋白的試劑盒，它包括(a)抗所述的肺癌早期血清特異蛋白的抗體。
本發(fā)明的其它方面由于本文的技術(shù)的公開，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。


圖1顯示了肺癌病人和健康個體的血清的蛋白質(zhì)組波譜圖。
具體實施例方式
本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，首次鑒別和分離了與肺癌極其相關(guān)的血清特異蛋白。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。由于血清具有取材方便，無創(chuàng)傷性，并可連續(xù)檢測的優(yōu)點，因此從血清中檢測肺癌早期生物標志物可以將把肺癌的早期診斷提高到一個新的水平，從而提高肺癌的治愈率和降低肺癌的死亡率。
傳統(tǒng)上的蛋白質(zhì)組學研究的核心技術(shù)是二維凝膠電泳分離。轉(zhuǎn)移的斑點進行膠上酶解后，再用MADLI-TOF質(zhì)譜和多級液質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜進行蛋白的后續(xù)鑒定。但是，二維凝膠電泳不能分離分子量特別大或特別小的蛋白，由于樣品轉(zhuǎn)移的原因，二維凝膠技術(shù)也無法分離痕量的蛋白。最重要的是，它的分離時間長，阻礙了蛋白質(zhì)組學研究的通量。
近年來，隨著多維色譜分離技術(shù)的出現(xiàn)，蛋白質(zhì)組學研究又引入了新方法。它拋棄了二維凝膠電泳，而代之以多維色譜在線聯(lián)接質(zhì)譜，實現(xiàn)高通量的蛋白質(zhì)組學分析。四極桿技術(shù)由于分析混合物的能力強，所以已經(jīng)成功地和質(zhì)譜接合在一起，實現(xiàn)高通量的分析。自從1993年，美國的Bill Hutchens和Tai-Yung Yip提出了改良的表面加強的激光解析電離化—飛行時間質(zhì)譜(Surface EnhancedLaser Desorption Ionization-time of flight Mass Spectrum，SELDI-TOF-MS)，基于這一技術(shù)的蛋白質(zhì)芯片系統(tǒng)(ProteinChip Biosystem，Ciphergen，CA，USA)在臨床檢驗上有了大量的應(yīng)用。
SELDI技術(shù)的基本原理是基于特殊芯片的表面加強的吸附。芯片表面的基團有兩種化學的(如親水基團、疏水基團、離子基團)或生物的(如金屬離子、抗體、受體、配體)。復(fù)雜的生物樣品(如細胞或體液)中的特定蛋白質(zhì)通過不同類型芯片表面被吸附在芯片上。在洗脫去弱結(jié)合蛋白質(zhì)后，加上能量吸收分子(Energyabsorbing molecular，EAM)，利用激光脈沖輻射使被結(jié)合的蛋白質(zhì)解析形成荷電離子，根據(jù)不同質(zhì)荷比，這些離子在真空場中飛行的時間長短不一，由此繪制出一張質(zhì)譜圖，可以直接顯示樣品中各種蛋白質(zhì)的分子量、含量等信息。若將它與正常人或某種疾病患者的圖譜，甚至基因庫中的圖譜進行對照，既能發(fā)現(xiàn)和捕獲新的特異性相關(guān)蛋白質(zhì)。SELDI技術(shù)的優(yōu)點在于可以高通量、高效率地對少量未經(jīng)預(yù)處理的樣品進行分析。實驗重復(fù)性好，敏感性高，價格低廉，適用于臨床診斷及大規(guī)模人群篩查。
以往，有關(guān)蛋白質(zhì)組學的研究多采用色譜分離純化、二維電泳、光譜、質(zhì)譜定量定性等分析化學的研究技術(shù)。運用這些手段進行研究所必需的技術(shù)條件要求高，儀器昂貴，步驟繁瑣，耗時冗長，不適應(yīng)大規(guī)模的人群篩查和臨床檢驗。SELDI技術(shù)與MALDI技術(shù)(基質(zhì)輔助的激光解析電離化飛行時間技術(shù)，(Matrix AssistedLaser Desorption Ionization-time of flight Mass Spectrum，MALDI-TOF-MS)的根本區(qū)別在于在SELDI中，蛋白質(zhì)先和芯片表面物質(zhì)結(jié)合，再加上基質(zhì)，因此獲得的圖譜更單一，重復(fù)性好，可用于MALDI所不能進行的蛋白質(zhì)定量分析。另外，SELDI技術(shù)分析的樣品不需用液相色譜或氣相色譜預(yù)先純化，因此可用于分析復(fù)雜的生物樣品。與2D-PAGE(二維聚丙烯酰胺凝膠電泳)相比，SELDI技術(shù)的優(yōu)點在于第一，SELDI技術(shù)可以分析2D-PAGE無法分析的蛋白質(zhì)，包括疏水性蛋白質(zhì)，pI值過高或過低的蛋白質(zhì)，以及低分子量的蛋白質(zhì)(MW＜25kd)；第二，在未經(jīng)處理的樣品中，許多被掩蓋的低濃度蛋白質(zhì)可以通過SELDI技術(shù)被發(fā)現(xiàn)，增加了發(fā)現(xiàn)生物標志物的機會；第三，SELDI技術(shù)只需少量樣品，在較短時間內(nèi)就可以得到結(jié)果，且實驗重復(fù)性好，適合臨床診斷及大規(guī)模篩選疾病相關(guān)生物標志物。
SELDI技術(shù)具有相當高的敏感性和微量的定性分析能力，因此對疾病尤其是癌癥的早期發(fā)現(xiàn)具有重大的意義，比傳統(tǒng)的檢測技術(shù)先進得多。目前，SELDI技術(shù)在發(fā)現(xiàn)疾病標志物方面取得了一系列突破性發(fā)展。例如，用SELDI技術(shù)分析卵巢癌病人血清，發(fā)現(xiàn)了五個蛋白質(zhì)特征峰(質(zhì)/荷比值為534，989，2111，2251和2465)，診斷的靈敏度為100％，特異性為95％，陽性預(yù)測值為94％。用SELDI技術(shù)結(jié)合金屬螯合Ni型蛋白質(zhì)芯片分析乳腺癌患者血清，發(fā)現(xiàn)一個28.3kD的蛋白質(zhì)(命名為NMP66)，診斷準確率100％，特異性96％。用SELDI技術(shù)在前列腺癌病人血清中發(fā)現(xiàn)5個特異蛋白質(zhì)峰，聯(lián)合檢測這些峰可使前列腺癌的診斷敏感性上升為82％，特異性上升為83％。用SELDI技術(shù)研究轉(zhuǎn)移性膀胱癌(TCC)病人的尿樣，發(fā)現(xiàn)了5個可能的新的TCC生物標志物及7個蛋白質(zhì)組群(分子量為3.3～13.3kD)。聯(lián)用這些生物標志物和蛋白質(zhì)組群診斷，可使TCC敏感性提高達87％，特異性為66％。用SELDI技術(shù)結(jié)合SAX2蛋白質(zhì)芯片研究結(jié)腸癌患者、癌前息肉患者的血清，發(fā)現(xiàn)一個特異性表達的13.8kD的蛋白質(zhì)，從而可對結(jié)腸癌作出早期篩查。用SELDI技術(shù)結(jié)合H4芯片研究腎細胞癌(RCC)組織(包括正常組織、外周癌組織和中心癌組織)，發(fā)現(xiàn)RCC組織過度表達11951.2Da及12019.9Da蛋白質(zhì)。用SAX2芯片發(fā)現(xiàn)RCC組織過度表達12027Da蛋白質(zhì)，但低表達10205Da、10953Da及12738Da蛋白質(zhì)。從而為RCC病人的檢測提供方法。(這一段可精簡一些。)SELDI技術(shù)的問世，提供了一個有效的分析手段。不僅可在臨床醫(yī)學領(lǐng)域用于發(fā)現(xiàn)和定義生物標志物，研究藥理學，觀察治療預(yù)后效果。在本發(fā)明確定了肺癌早期血清特異蛋白后，便可聯(lián)用SELDI技術(shù)或其他技術(shù)來檢測這些蛋白，從而成為肺癌早期診斷和療效監(jiān)測的有力手段。
如本文所用，術(shù)語“肺癌早期血清特異蛋白”指一種在早期肺癌病人的血清中存在的蛋白，并且用表面加強的激光解析電離化飛行-時間質(zhì)譜法(SELDI-TOF-MS)檢測時，其分子量為4.2±0.1KD、6.3±0.1KD或7.7±0.1KD。
肺癌早期血清特異蛋白1、肺癌早期血清特異蛋白2和肺癌早期血清特異蛋白3分別指分子量為4.2±0.1KD、6.3±0.1KD或7.7±0.1KD的肺癌早期血清特異蛋白。
如本文所用，“分離的”是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(如果是天然的物質(zhì)，原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。如活體細胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質(zhì)中分開，則為分離純化的。
在確定了肺癌早期血清特異蛋白之后，技術(shù)人員可用常規(guī)方法分離這些肺癌早期血清特異蛋白。此外，還可通過重組技術(shù)產(chǎn)生這些蛋白。因此，本發(fā)明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優(yōu)選重組多肽。本發(fā)明的多肽可以是天然純化的產(chǎn)物，或是化學合成的產(chǎn)物，或使用重組技術(shù)從原核或真核宿主(例如，細菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細胞)中產(chǎn)生。根據(jù)重組生產(chǎn)方案所用的宿主，本發(fā)明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發(fā)明的蛋白還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。此外，本發(fā)明還包括人肺癌早期血清特異蛋白的片段、衍生物和類似物。
另一方面，本發(fā)明還涉及肺癌早期血清特異蛋白的編碼序列，含有這些編碼序列的載體以及含有所述載體的宿主細胞。本發(fā)明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。
本發(fā)明的肺癌早期血清特異蛋白的核苷酸全長序列或其片段通?？梢杂肞CR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計引物，并用市售的cDNA庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模板，擴增而得有關(guān)序列。當序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR擴增，然后再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細胞中分離得到有關(guān)序列。
此外，還可用人工合成的方法來合成有關(guān)序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然后再進行連接可獲得序列很長的片段。
用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進行。
獲得的轉(zhuǎn)化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達本發(fā)明的基因所編碼的多肽。根據(jù)所用的宿主細胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細胞生長的條件下進行培養(yǎng)。當宿主細胞生長到適當?shù)募毎芏群?，用合適的方法(如溫度轉(zhuǎn)換或化學誘導(dǎo))誘導(dǎo)選擇的啟動子，將細胞再培養(yǎng)一段時間。
在上面的方法中的重組多肽可在細胞內(nèi)、或在細胞膜上表達、或分泌到細胞外。如果需要，可利用其物理的、化學的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于常規(guī)的復(fù)性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié)合。
另一方面，本發(fā)明還包括對肺癌早期血清特異蛋白具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結(jié)合于人肺癌早期血清特異蛋白或片段。較佳地，指那些能與肺癌早期血清特異蛋白或片段結(jié)合但不識別和結(jié)合于其它非相關(guān)抗原分子的抗體。本發(fā)明的抗體可以通過本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進行制備。
本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子；或嵌合抗體。
抗人肺癌早期血清特異蛋白的抗體可用于免疫組織化學技術(shù)中，檢測血清標本中的人肺癌早期血清特異蛋白。
一種檢測樣品中是否存在肺癌早期血清特異蛋白的方法是利用肺癌早期血清特異蛋白的特異性抗體進行檢測，它包括將血清樣品與肺癌早期血清特異蛋白特異性抗體接觸；觀察是否形成抗體復(fù)合物，形成了抗體復(fù)合物就表示樣品中存在肺癌早期血清特異蛋白。
肺癌早期血清特異蛋白的多核苷酸也可用于肺癌的早期的診斷和治療。本發(fā)明的多核苷酸的一部分或全部可作為探針固定在微陣列(microarray)或DNA芯片(又稱為“基因芯片”)上，用于分析組織中基因的差異表達分析和基因診斷。用肺癌早期血清特異蛋白特異的引物進行RNA-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)體外擴增也可檢測肺癌早期血清特異蛋白的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
本發(fā)明還提供了一種檢測腫瘤的試劑盒，它含有特異性擴增肺癌早期血清特異蛋白的引物對和/或肺癌早期血清特異蛋白特異性抗體。此外，還可含有特異性探針和/或PCR緩沖液等。
本發(fā)明的主要優(yōu)點在于(a)為肺癌的早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷提供準確、高效的檢測方法。
(b)成本低，比傳統(tǒng)診斷方法要便宜得多。
下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1肺癌早期血清特異蛋白的確定1.1血清的制備對臨床病理確診的肺癌患者及健康對照人員，取5ml外周血，4℃冷藏2h后，血清析出。3000g離心15分鐘后取血清，分裝后-80℃?zhèn)溆谩z測時用NaAc結(jié)合液稀40倍釋后使用。
1.2芯片的制備取美國賽弗吉公司(Ciphergen Biosystems，Inc.)WCX2芯片，裝在8-孔加樣器上備用。
芯片的預(yù)平衡每孔加200μl NaAc結(jié)合液，室溫搖床上孵育5分鐘。棄去結(jié)合液，重復(fù)1次。
加樣取稀釋后的血清，每孔加200μl，室溫搖床上孵育1小時。棄去血清。
洗脫每孔加200μl NaAC洗脫液，室溫搖床上孵育5分鐘。棄去洗脫液，重復(fù)1次。每孔加300μl去離子水，快速洗滌后，將芯片從加樣器上拆下于室溫干燥。
加能量吸收分子(Energy Absorbed Molecular，EAM)按說明書配置新鮮的SPA(Ciphergen Biosystems，Inc.)，每孔加0.5μl，室溫干燥后重復(fù)1次。
1.3血清蛋白質(zhì)組波譜分析將制備好芯片置入美國賽弗吉公司(Ciphergen Biosystems，Inc.)蛋白質(zhì)生物系統(tǒng)PBS II，選取激光強度為203、激光分辨率為9，使出峰最多并且基線穩(wěn)定，編寫單點分析程序及芯片分析程序，讀取血清蛋白質(zhì)組波譜。
1.4肺癌患者特異性蛋白質(zhì)峰的獲得于同一芯片上制備肺癌患者及健康對照人員樣品，在相同條件下讀取血清蛋白質(zhì)組波譜。將兩者的蛋白質(zhì)組波譜進行比較。
結(jié)果如圖1所示，發(fā)現(xiàn)肺癌患者特異性表達4.2KD、6.3KD、7.7KD蛋白質(zhì)峰。
實施例2利用肺癌早期血清特異蛋白檢測肺癌的陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值、靈敏度和特異度將52例病例血清樣品與42例正常血清樣品統(tǒng)一編號，采用盲法進行臨床篩選試驗，出現(xiàn)上述三個特征峰中一個的即判為病例。實驗結(jié)果如下

據(jù)上表，計算靈敏度即真陽性率為84.62％特異度即真陰性率為83.33％陽性預(yù)測值為86.27％陰性預(yù)測值為81.40％
實施例3肺癌早期血清特異蛋白與肺部其他腫瘤及肺部炎性疾患的關(guān)系按實施例1相同的方法，檢測惡性間皮瘤(MM)、肺結(jié)核、大葉性肺炎等肺部疾患病人的血清的蛋白質(zhì)組波譜，并進行比較。
結(jié)果，在上述疾病的患者血清中，尚未發(fā)現(xiàn)同時存在以上三種特異性蛋白。
實施例4肺癌早期血清特異蛋白與其他腫瘤的相關(guān)性按實施例1相同的方法，檢測腎癌、膀胱癌病人的血清的蛋白質(zhì)組波譜，并進行比較。
結(jié)果，在上述疾病的患者血清中，尚未發(fā)現(xiàn)同時存在以上三種特異性蛋白。
實施例5肺癌早期血清特異蛋白的氨基酸序列的測定檢測采用美國ABI公司QSTAR液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)。這是一套接合了四極桿和飛行時間質(zhì)譜技術(shù)的系統(tǒng)，它可以實現(xiàn)高通量、微量樣本、全自動的蛋白質(zhì)組分析，并且可以鑒定翻譯后修飾、糖基化修飾等多種修飾，可以進行蛋白定量，自動的從頭(de novo)測序。
實施例6肺癌早期血清特異蛋白的分離和制備6.1將20μl的血清用30μl 8M尿素溶液稀釋后于自動振蕩器上4℃混勻10分鐘。
6.2用300μl 1M尿素溶液預(yù)平衡Cibacron Blue柱，共3次，每次均以1000g離心30秒。
6.3將稀釋后的血清樣品加在Cibacron Blue柱上。
6.4加入50μl 8M尿素溶液稀釋后于自動振蕩器上4℃混勻15分鐘，1000g離心30秒，得到組分1(肺癌早期血清特異蛋白1)。
6.5重復(fù)步驟6.4兩次，得到組分2(肺癌早期血清特異蛋白2)，組分3(肺癌早期血清特異蛋白3)。
將各組分用1M尿素溶液稀釋7倍后，于NP20芯片上分析，獲得蛋白質(zhì)波譜圖證實了獲得了其分子量分別為4.2KD、6.3KD和7.7KD，證實了分離得到了本發(fā)明的三種肺癌早期血清特異蛋白。
實施例7肺癌早期血清特異蛋白抗體的制備7.1肺癌早期血清特異蛋白4.2±0.1KD單克隆抗體的制備。
將分離純化的肺癌早期血清特異蛋白4.2±0.1KD免疫小鼠，待免疫反應(yīng)出現(xiàn)后，從外周血中分離B細胞。用溶血噬菌斑分析法選擇并分離出能分泌所需抗體的單個淋巴細胞。將單個細胞擴增至1×107個以上，用Quick mRNA Purification Kit提取mRNA。以提取的mRNA為模板，合成cDNA鏈。以此cDNA為模板，加入鼠抗體重鏈可變區(qū)(VH)通用引物，輕鏈可變區(qū)(VL)通用引物，進行聚合酶鏈反應(yīng)，獲得擴增的VH基因片段和VL基因片段。將擴增產(chǎn)物行15g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定和分離。用glassmilk回收擴增的VH基因片段和VL基因片段，與等摩爾濃度的linker primer Mix混合，進行聚合酶鏈反應(yīng)，連接VH和VL。擴增產(chǎn)物分離純化后，獲得特異性單鏈抗體(ScFV)。此ScFV可用于制備檢測所需DNA芯片。
將此擴增產(chǎn)物兩端加限制性酶切位點，純化定量后，連接到PUC19載體上。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌TOP10，經(jīng)藍白斑篩選及酶切鑒定，篩選出重組質(zhì)粒。于96孔板形成單克隆抗體。用ELISA法篩選出效價最高的單抗株，大量制備，并從培養(yǎng)上清中提取所需單抗。此單抗可用于制備檢測所需試劑盒。
7.2肺癌早期血清特異蛋白6.3±0.1KD和7.7±0.1KD單克隆抗體的制備同7.1。
實施例8肺癌檢測試劑盒的制備用96孔板做酶聯(lián)反應(yīng)。試劑盒提供了3種針對肺癌早期血清特異蛋白的單抗。96孔板上分別包被這三種單抗。將標準品、空白對照和樣品加入96孔板與單抗反應(yīng)。洗滌后加地高辛標記的單抗，再加入偶聯(lián)有辣根過氧化物酶的羊抗鼠抗體。加入OPD底物進行顯色反應(yīng)，加入2MH2SO4終止反應(yīng)?？赏ㄟ^標準曲線來定量樣品中三種肺癌早期血清特異蛋白的濃度。并設(shè)定一定的閾值進行臨床診斷。
在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
權(quán)利要求
1.分離的肺癌早期血清特異蛋白，其特征在于，它具有以下特征(a)存在于肺癌病人的血清中，(b)用表面加強的激光解析電離化飛行-時間質(zhì)譜法檢測時，其分子量為4.2±0.1KD、6.3±0.1KD或7.7±0.1KD。
2.如權(quán)利要求1所述的蛋白，其特征在于，所述的表面加強的激光解析電離化-飛行時間質(zhì)譜法檢測的條件是使用賽弗吉公司的蛋白質(zhì)生物系統(tǒng)PBS II，設(shè)定的最適激光強度為203和激光靈敏度為9。
3.一種檢測樣品中是否存在權(quán)利要求1所述的肺癌早期血清特異蛋白的方法，其特征在于，包括步驟(a)取血清樣品；(b)用步驟(a)的血清樣品制備弱陰離子交換蛋白質(zhì)芯片；(c)用表面加強的激光解析電離化-飛行時間質(zhì)譜法檢測，獲得血清蛋白質(zhì)組波譜；(d)確定是否存在分子量為4.2±0.1KD、6.3±0.1KD和7.7±0.1KD的波峰，存在所述波峰就表示存在所述的肺癌早期血清特異蛋白。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述的表面加強的激光解析電離化-飛行時間質(zhì)譜法檢測的條件是使用賽弗吉公司的蛋白質(zhì)生物系統(tǒng)PBS II，設(shè)定的最適激光強度為203和激光靈敏度為9。
5.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，在步驟(d)中還包括步驟與陰性對照的血清樣品的蛋白質(zhì)組波譜比較，從而確定是否存在分子量為4.2±0.1KD、6.3±0.1KD和7.7±0.1KD的波峰。
6.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，步驟(c)中使用賽弗吉公司的蛋白質(zhì)生物系統(tǒng)PBS II。
7.一種檢測權(quán)利要求1所述的肺癌早期血清特異蛋白的試劑盒，其特征在于，它包括(a)抗所述的肺癌早期血清特異蛋白的抗體。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種新的腫瘤標志物－肺癌早期血清特異蛋白。本發(fā)明還公開了所述蛋白在診斷肺癌上的用途。本發(fā)明還提供了含肺癌早期血清特異蛋白的診斷試劑盒。本發(fā)明可有效地檢測肺癌，尤其是早期檢測肺癌。
文檔編號G01N33/574GK1534045SQ0311605
公開日2004年10月6日 申請日期2003年3月28日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月28日
發(fā)明者張勝年, 盧偉, 王文靜, 項翠琴, 陸曄 申請人:上海市疾病預(yù)防控制中心