一種鉛-極低密度脂蛋白螯合物及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及重金屬離子的免疫學(xué)檢測(cè)，具體設(shè)及一種鉛-極低密度脂蛋白馨合物 及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 脂蛋白（lipoproteins)是蛋白質(zhì)與脂質(zhì)結(jié)合所形成的一種脂質(zhì)-蛋白質(zhì)復(fù) 合物，按密度分為高密度脂蛋白（hi曲densitylipoprotein,皿L)、中間密度脂蛋白 (intermediatedensitylipoprotein，IDL)、低密度月旨蛋白(lowdensitylipoprotein， LDL)、極低密度脂蛋白（verylowdensitylipoprotein,VLDL)、乳糜顆粒（chylomicron， CM)。血液中約70%的膽固醇由LDL和VLDL所攜帶。VLDL的主要功能是運(yùn)輸肝臟中合成的 內(nèi)源性甘油S醋（triglyceride,TG)，當(dāng)VLDL合成不足或分泌不足或結(jié)構(gòu)功能受損時(shí)，易 導(dǎo)致肝臟中的甘油S醋運(yùn)出障礙，過(guò)量的TG在肝臟存積，使肝臟易受脂質(zhì)過(guò)氧化打擊，進(jìn) 而脂肪細(xì)胞變性，而使肝細(xì)胞發(fā)生炎癥、壞死，導(dǎo)致脂肪肝。而TG的升高又進(jìn)一步刺激VLDL 升高，過(guò)多的VLDL不僅易在肝內(nèi)存積，導(dǎo)致肝功能受損，形成脂肪肝，而且VLDL的持續(xù)增 高，也可導(dǎo)致高甘油^脂血癥化7961'付1肖17。61'1(13611113，冊(cè)6)。￥0)1^的增多與高脂血癥、月旨 代謝素亂息息相關(guān)，而血脂異常又是多種疾病發(fā)生的重要危險(xiǎn)因素，因而VLDL含量水平的 穩(wěn)定對(duì)于人體各方面機(jī)能功能的穩(wěn)定起著重要作用。
[0003]VLDL含量水平及結(jié)構(gòu)功能的穩(wěn)定對(duì)機(jī)體意義重大。其含量過(guò)高與脂肪肝、脂代謝 素亂、屯、血管疾病、腎臟功能損傷等息息相關(guān)。定量檢測(cè)VLDL可W用于該些疾病的早期診 斷W及治療效果監(jiān)測(cè)，甚至作為預(yù)后好壞的評(píng)價(jià)指標(biāo)之一。而對(duì)于營(yíng)養(yǎng)不良、慢性貧血、肝 功能受損者等患者，血清VLDL含量也會(huì)下降，定量檢測(cè)VLDL也可用于該些疾病的早期診 斷、治療效果監(jiān)測(cè)W及作為預(yù)后評(píng)價(jià)的指標(biāo)之一。
[0004] 鉛是一種常見的有毒金屬及環(huán)境污染物，廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)環(huán)境中，包括冶煉 鍛造、鉛電池生產(chǎn)、汽油添加劑的生產(chǎn)過(guò)濾中等，與人們生活息息相關(guān)。對(duì)于普通人群，主要 是通過(guò)吸入鉛污染的空氣，或飲用W鉛壺或鉛錫壺盛裝的酒，甚至使用或?yàn)E用含鉛的藥物 治療慢性疾病而攝入鉛。研究表明，鉛是一種全身性毒物，可W影響神經(jīng)、造血、內(nèi)分泌、免 疫、生殖、肝臟、腎臟等組織器官，國(guó)際腫瘤研究機(jī)構(gòu)也將鉛及其化合物列為第2B類人致癌 物。可見鉛對(duì)機(jī)體的影響及其重要，不可忽視。
[0005]目前已有大量的文獻(xiàn)證實(shí)鉛可W作用于全身各個(gè)系統(tǒng)中的蛋白，從而影響機(jī)體各 組織器官的機(jī)能。眾所周知，極低密度脂蛋白是一種特殊意義的蛋白質(zhì)，鉛是否可W作用于 極低密度脂蛋白，而使極低密度脂蛋白結(jié)構(gòu)改變、含量改變、活性改變、功能改變，該些尚缺 乏相關(guān)研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 針對(duì)鉛污染嚴(yán)重的問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于提供一種鉛-極低密度脂蛋白馨合物 及其制備方法，并建立鉛-極低密度脂蛋白馨合物的定性、定量檢測(cè)方法，W便定量檢測(cè) 鉛-極低密度脂蛋白馨合物在評(píng)價(jià)一個(gè)地區(qū)鉛污染程度的應(yīng)用。通過(guò)定量檢測(cè)一個(gè)地區(qū)人 群血清中鉛-極低密度脂蛋白馨合物，可W間接反映該個(gè)地區(qū)人群受鉛污染的情況，從而 間接反映該個(gè)地區(qū)鉛污染程度。
[0007] 本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是；提供一種鉛-極低密度脂蛋白馨合 物，該鉛-極低密度脂蛋白馨合物是鉛離子與極低密度脂蛋白通過(guò)琉基或/和半脫氨酸殘 基馨合而成。
[0008] 本發(fā)明還提供一種上述的鉛-極低密度脂蛋白馨合物的制備方法，即體外合成 法，包括W下步驟：
[0009]A)鉛-極低密度脂蛋白馨合物的合成；在提純?cè)从谌梭w的極低密度脂蛋白或按照 生物學(xué)方法重組的極低密度脂蛋白中加入鉛離子進(jìn)行馨合反應(yīng)，得到反應(yīng)溶液；
[0010]B)鉛-極低密度脂蛋白馨合物純化；采用免疫親和層析法，去除步驟A)反應(yīng)溶液 中未反應(yīng)的極低密度脂蛋白、特異性抗體和鉛離子，即得鉛-極低密度脂蛋白馨合物。
[0011] 作為優(yōu)選，所述步驟B)中具體包括W下步驟：
[0012] (1)溶解樣品；將上述步驟A)的提取的鉛-極低密度脂蛋白馨合物溶解于生理鹽 水中，得鉛-極低密度脂蛋白馨合物的溶液；
[0013] (2)平衡層析柱；使用稀釋緩沖液沖洗層析柱的管路，在層析柱中裝入能與極低 密度脂蛋白特異性結(jié)合的填料，裝柱后，繼續(xù)使用稀釋緩沖液平衡層析柱；
[0014] 所述能與極低密度脂蛋白特異性結(jié)合的填料為吸附有可與極低密度脂蛋白特異 性結(jié)合物質(zhì)的硅膠或樹脂；
[00巧]做上樣：待層析柱平衡后，用稀釋緩沖液稀釋步驟（1)的溶液，然后上柱，使極低 密度脂蛋白與填料特異性結(jié)合；
[0016] (4)洗脫；使用稀釋緩沖液沖洗層析柱至基線平衡，然后使用0. 05-0.lOmol/L的 化2冊(cè)〇4溶液進(jìn)行洗脫；
[0017] (5)收集；收集步驟（4)的洗脫液，收集完畢后立即使蛋白復(fù)原；
[0018] (6)透析；將步驟巧）中的收集的洗脫液，裝透析袋，用d地2〇透析除鹽，換水S次 后，4°C透析過(guò)夜，收集樣本；
[0019](7)平衡層析柱；采用新的層析柱，用稀釋緩沖液沖洗管路，在該層析柱中裝入能 與鉛特異性結(jié)合的填料，裝柱后再用稀釋緩沖液平衡層析柱；
[0020] 所述能與鉛特異性結(jié)合的填料為吸附有可與鉛特異性結(jié)合物質(zhì)的硅膠或樹脂； [002。 做上樣；待層析柱平衡后，用稀釋緩沖液稀釋步驟做中樣本，然后上柱；
[0022] (9)洗脫；使用稀釋緩沖液沖洗層析柱至基線平衡，然后使用0. 5-1.Omol/L的 化2冊(cè)〇4溶液進(jìn)行洗脫；
[0023] (10)收集；收集步驟巧）的洗脫液，收集完畢后立即使蛋白復(fù)原；
[0024] (11)透析；將步驟（10)的洗脫液，裝透析袋，用(1化0透析除鹽，換水立次后，4°C 透析過(guò)夜，收集樣本，即得鉛-極低密度脂蛋白馨合物。
[0025] 作為優(yōu)選，上述鉛-極低密度脂蛋白馨合物的制備方法，還包括W下對(duì)鉛-極低密 度脂蛋白馨合物的鑒定步驟，具體包括W下步驟：
[0026] (1)制備膠床；W瓊脂糖凝膠、聚丙締酷胺凝膠中的一種作為介質(zhì)制備膠床；
[0027] 似加樣；取步驟B)中提取純化得到的鉛-極低密度脂蛋白馨合物，加入上樣緩 沖液，并混勻，然后加樣于樣品槽中；
[002引 做電泳：連接電泳板，進(jìn)行電泳；
[0029] (4)檢測(cè)；在膠床上找出含鉛的蛋白條帶，將該蛋白條帶取出，將蛋白條帶溶解， 然后再采用ICP-MS或AAS檢測(cè)該液體中是否含有鉛W及檢測(cè)鉛的含量。
[0030] 本發(fā)明還提供一種如上述的鉛-極低密度脂蛋白馨合物在制備檢測(cè)人體內(nèi)鉛-極 低密度脂蛋白馨合物的試劑或試劑盒中的應(yīng)用。
[0031] 本發(fā)明還提供一種至少包括如上述的鉛-極低密度脂蛋白馨合物作為標(biāo)準(zhǔn)品的 試劑盒。
[0032] 優(yōu)選地，該試劑盒中還包括包被液，該包被液含有捕獲極低密度脂蛋白的物質(zhì)或 捕獲金屬鉛的物質(zhì)。
[0033] 本發(fā)明還提供一種定量檢測(cè)鉛-極低密度脂蛋白馨合物的方法，W已知含量的上 述的鉛-極低密度脂蛋白馨合物作為標(biāo)準(zhǔn)品，采用W下方法之一對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)；酶聯(lián)免 疫法、酶聯(lián)免疫與原子吸收光譜結(jié)合法、酶聯(lián)免疫與電感禪合等離子體質(zhì)譜結(jié)合法、提純 鉛-極低密度脂蛋白馨合物與酶聯(lián)免疫結(jié)合法、提純鉛-極低密度脂蛋白馨合物與原子吸 收光譜結(jié)合法、提純鉛-極低密度脂蛋白馨合物與電感禪合等離子體質(zhì)譜結(jié)合法、電泳與 酶聯(lián)免疫或原子吸收光譜或電感禪合等離子體質(zhì)譜結(jié)合法。
[0034] 相比現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果在于：
[0035] 1.本發(fā)明首次合成了鉛-極低密度脂蛋白馨合物；
[0036] 2.本發(fā)明首次提出鉛-極低密度脂蛋白馨合物可用于制備檢測(cè)血樣中鉛-極低密 度脂蛋白馨合物的試劑或試劑盒中的應(yīng)用；
[0037] 3.本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了-極低密度脂蛋白馨合物的特異性識(shí)別和定量檢測(cè)，W便定量檢 測(cè)人群血清中鉛-極低密度脂蛋白馨合物的含量，W評(píng)價(jià)一個(gè)地區(qū)鉛污染程度的應(yīng)用，為 工業(yè)地區(qū)的鉛污染水平提供間接指標(biāo)。本發(fā)明建立的鉛-極低密度脂蛋白馨合物定量檢測(cè) 方法的準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好。
【附圖說(shuō)明】
[003引圖1為本發(fā)明所述的鉛-極低密度脂蛋白馨合物的非變性電泳條帶圖；
[0039] 圖2為本發(fā)明所述的鉛-極低密度脂蛋白馨合物的同步福射X線電泳條的巧光分 析圖。
【具體實(shí)施方式】
[0040] 下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】，對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步描述：
[0041] 本發(fā)明除特別說(shuō)明外，設(shè)及的實(shí)驗(yàn)操作步驟均為本領(lǐng)域常規(guī)的步驟；所用試劑、材 料如未特殊說(shuō)明，均視為可從市購(gòu)方式購(gòu)得：
[0042] 提取試劑為PEG溶液、棚酸鹽緩沖液等（采用PEG法）；
[0043] 捕獲極低密度脂蛋白的物質(zhì)為抗極低密度脂蛋白抗體，可通過(guò)市售獲得，如艾博 抗（上海）貿(mào)易有限公司出售的"Genetexgtxl6419"的anti-HDL抗體，W下實(shí)施方式中， 所述與極低密度脂蛋白特異性結(jié)合的物質(zhì)、抗極低密度脂蛋白抗體、抗VLDL抗體均為捕獲 極低密度脂蛋白的物質(zhì)；
[0044] 酶標(biāo)抗體為含有辣根過(guò)氧化物酶、堿性磯酸酶等酶標(biāo)記的抗體中的一種；
[0045] 稀釋緩沖液為抑9. 6的0. 05M碳酸鹽緩沖液，配制方法示例：取1. 5g的化和 2. 93g的Na肥〇3溶解加d地2〇定容至1000血；
[0046] 洗漆緩沖液為抑7. 4的0. 15MPBS溶液，配制方法示例：取0. 2g的皿2口〇4、2. 90g 的化2冊(cè)〇4? 12&0、8.Og的NaCl、0. 2g的KC1、0. 5mLTween-20,溶解加dd&O定容至lOOOmL;
[0047] 封閉液為牛血清白蛋白溶液，配制方法示例：取0.Ig牛血清白蛋白，加入洗漆緩 沖液稀釋定容至lOOmL;
[004引終止液為2M&804,配制方法示例：取178. 3血的(1化0,加濃&80庶容至200血；
[0049] 底物為甲基聯(lián)苯胺（TMB)溶液，配制方法示例：取0. 5mL濃度為2g/L的甲基聯(lián)苯 胺己醇溶液，加底物稀釋液稀釋至10血；
[0050] 底物緩沖液抑為5. 0,其中化2冊(cè)〇4的摩爾濃度為0. 2M、巧樣酸的摩爾濃度為 0