一種檢測(cè)樣本中氧化低密度脂蛋白濃度的試劑盒及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于體外免疫檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測(cè)樣本中氧化低密度脂蛋白 (Ox-LDL)濃度的試劑盒及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 脂蛋白是血漿膽固醇和甘油三酯的主要載體；低密度脂蛋白（LDL)是一種密度較 低（1. 019~I. 063g/cm3)的血衆(zhòng)脂蛋白，由磷脂，載脂蛋白（ApO)B多肽鏈，膽固醇，甘油 三酯，碳水化合物等組成，約含25%蛋白質(zhì)與49%膽固醇及膽固醇酯；氧化低密度脂蛋白 (OxLDL)是天然的低密度脂蛋白（LDL)經(jīng)氧化修飾形成的脂蛋白。
[0003] 近年來人們發(fā)現(xiàn)OxLDL與動(dòng)脈粥樣硬化有密切的關(guān)系。Ox-LDL促使泡沫細(xì)胞的 形成，而泡沫細(xì)胞的死亡將導(dǎo)致脂類在動(dòng)脈壁的沉積，這是導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的主要病因 之一。最近研宄表明，在動(dòng)脈粥樣硬化病灶中發(fā)現(xiàn)了 OxLDL沉積，在正常動(dòng)脈壁中沒有，此 屬于動(dòng)脈粥樣硬化病灶的特有成分，因此，患者體內(nèi)的OxLDL量遠(yuǎn)高于正常人，其濃度與病 變范圍呈比例。臨床認(rèn)為健康人體內(nèi)Ox-LDL的含量為200-500 μ g/L，而當(dāng)臨床檢測(cè)OxLDL 含量大于600 μ g/L時(shí)為異常。因此Ox-LDL的檢測(cè)對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化心血管病的預(yù)警及早期 輔助診斷具有重要意義。
[0004] 目前，在市面上檢測(cè)OxLDL濃度常用的試劑種類少，檢測(cè)成本高，操作繁瑣，對(duì)實(shí) 驗(yàn)操作人員的技能要求高，不利于該項(xiàng)目檢測(cè)的大范圍推廣。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對(duì)上述技術(shù)的不足之處，本發(fā)明提供一種操作簡(jiǎn)便、便于實(shí)驗(yàn)人員掌握、涉及實(shí) 驗(yàn)儀器單一、普及率高、檢測(cè)成本低、檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確，非常利于大范圍推廣的氧化低密度脂 蛋白（OxLDL)定量檢測(cè)試劑盒。
[0006] 一種檢測(cè)樣本中氧化低密度脂蛋白濃度的試劑盒，包括包被有抗氧化低密度脂蛋 白克隆抗體的平臺(tái)載體、不同濃度氧化低密度脂蛋白濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)品、氧化低密度脂蛋白 質(zhì)控品、生物素標(biāo)記的氧化低密度脂蛋白克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的親和素、樣本緩 沖液、底物A、底物B、終止液、濃縮洗液。
[0007] 進(jìn)一步的，所述平臺(tái)載體為微孔板，所述微孔板為96孔聚苯乙烯微孔板；所述抗 氧化低密度脂蛋白克隆抗體為抗氧化低密度脂蛋白單克隆抗體；所述氧化低密度脂蛋白克 隆抗體為氧化低密度脂蛋白單克隆抗體；所述底物A為過氧化氫的檸檬酸鹽緩沖液；所述 底物B為四甲基聯(lián)苯胺的檸檬酸鹽緩沖液；所述終止液為硫酸溶液；所述濃縮洗液為含有 表面活性劑的磷酸鹽緩沖液。
[0008] 進(jìn)一步的，所述試劑盒微孔板上抗氧化低密度脂蛋白單克隆抗體的數(shù)量為 1-50 μ g/孔；氧化低密度脂蛋白濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)品為6支、各2ml ;所述氧化低密度脂蛋白質(zhì) 控品為2支各2ml ;生物素標(biāo)記的氧化低密度脂蛋白單克隆抗體IOmlU支；辣根過氧化物 酶標(biāo)記的親和素 l〇ml、l支；樣本緩沖液10ml、l支；過氧化氫的檸檬酸鹽緩沖液10ml、l支； 四甲基聯(lián)苯胺的檸檬酸鹽緩沖液IOmlU支；硫酸溶液IOmlU支；含有表面活性劑的磷酸 鹽緩沖液l〇ml、l支。
[0009] 進(jìn)一步的，所述氧化低密度脂蛋白濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品都是用氧化低密度脂 蛋白純品與標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液按照1:200000-1:1000稀釋而成，所述標(biāo)準(zhǔn)品不少于2個(gè)，所述質(zhì) 控品和所述標(biāo)準(zhǔn)品的區(qū)別只是濃度不同，所述質(zhì)控品的作用是在試劑盒使用過程中起到核 準(zhǔn)校對(duì)的作用，即通過質(zhì)控品測(cè)值是否在質(zhì)控范圍內(nèi)來對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品擬合出來的曲線進(jìn)行核準(zhǔn) 校對(duì)，若質(zhì)控品測(cè)值合格，則可以利用標(biāo)準(zhǔn)曲線來擬合出樣本中的氧化低密度脂蛋白濃度 值。
[0010] 進(jìn)一步的，所述的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，是在pH 7. 0-8. 0、濃度為IO-IOOmM磷酸鹽緩沖 液中，分別加入1-10%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的動(dòng)物血清、〇. 01-0. 5%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的防腐劑、1-10%質(zhì)量分 數(shù)的蛋白保護(hù)劑、〇. 05-1%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的表面活性劑混合而成。
[0011] 進(jìn)一步的，所述樣本緩沖液是在PH6. 0-7. 0、濃度為IO-IOOmM的磷酸鹽緩沖液中， 分別加入0. l_3mM的金屬離子絡(luò)合劑、1-10%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的蛋白保護(hù)劑、0.01-1 %質(zhì)量分?jǐn)?shù) 的表面活性劑、0. 01-0. 5%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的防腐劑混合而成；所述底物A是將過氧化氫純品加 入到濃度為50-100mM檸檬酸鹽緩沖液中配制而成；所述底物B是將四甲基聯(lián)苯胺加入到濃 度為50-100mM檸檬酸鹽緩沖液中配制而成；所述濃縮洗液是把質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 05-1 %的表 面活性劑加到pH6. 0-7. 0、濃度為IO-IOOmM磷酸鹽緩沖液中配制而成。
[0012] 進(jìn)一步的，所述的表面活性劑為曲達(dá)通X-100、吐溫20 (Tween 20)、布里 杰-35 (BRIJ-35)、吐溫40、十二烷基磺酸鈉、聚乙二醇2000 ;所述的防腐劑為PrOclin 300。
[0013] 進(jìn)一步的，所述的金屬離子絡(luò)合劑為乙二胺四乙酸二鈉（EDTA_2Na)和乙二胺四 乙酸（EDTA)。
[0014] 進(jìn)一步的，所述的蛋白保護(hù)劑為牛血清白蛋白、甘油、蔗糖。
[0015] 制備如上所述的試劑盒的方法，包括以下步驟，所述步驟不分前后順序：
[0016] 包被有抗氧化低密度脂蛋白單克隆抗體的平臺(tái)載體的制備：將濃度為6-10mg/ml 的特異性抗氧化低密度脂蛋白單克隆抗體用濃度為20-50mmol的磷酸鹽緩沖液稀釋到濃 度為l-3mg/ml，加入到平臺(tái)載體上，4-8°C過夜進(jìn)行包被；然后用濃縮洗液將平臺(tái)載體清洗 至少3次；再向平臺(tái)載體上加入含蛋白保護(hù)劑的封閉液（所述封閉液包括蛋白保護(hù)劑質(zhì)量 分?jǐn)?shù)8-12%、蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)1-3%、防腐劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)0. 1-3%、10-50mM磷酸鹽緩沖劑）進(jìn)行 封閉；等待平臺(tái)載體至干燥后，真空袋封裝，4-8°C存放；
[0017] 氧化低密度脂蛋白濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品的制備：是用氧化低密度脂蛋白純 品與標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液按照1:200000-1:1000稀釋，最后配制成標(biāo)示濃度為0-1000ng/ml的一 濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)品以及80-500ng/ml的質(zhì)控品；其中標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液是在pH 7. 0-8. 0、濃度為 IO-IOOmM磷酸鹽緩沖液中，分別加入1% -4%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的動(dòng)物血清、0. 1-0. 5%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的 防腐劑、3-5%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的蛋白保護(hù)劑、0. 1-0. 5%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的表面活性劑；所得到的濃度梯 度標(biāo)準(zhǔn)品的濃度分別為〇、50、100、250、500、1000ng/ml，將得到的濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)品與質(zhì)控品 每瓶500ul分裝，然后凍干成粉末狀，4-8°C保存；
[0018] 生物素標(biāo)記的氧化低密度脂蛋白克隆抗體制備：在偶聯(lián)前將生物素活化；然后將 濃度為l-5mg/ml待標(biāo)記的氧化低密度脂蛋白抗體用50-100mM碳酸鹽緩沖液稀釋到濃度 為l-2mg/ml，并用稀釋后的碳酸鹽緩沖液透析6-15h后；將活化后的生物素溶解于二甲基 亞砜純品中待用，把處理后的氧化低密度脂蛋白抗體溶解到于碳酸鹽緩沖液中，按體積比 1:6-1:10混合含有生物素活化的二甲基亞砜和含有氧化低密度脂蛋白抗體的碳酸鹽緩沖 液，在室溫下溫育4h后用PBS透析純化；將所得生物素標(biāo)記氧化低密度克隆抗體加入NaN3或者甘油等體積混合，-15 20°C保存?zhèn)溆茫?br>[0019] 辣根過氧化物酶標(biāo)記的親和素的制備：稱取過碘酸鈉加入到純凈水中配置得到終 濃度為l〇_15mg/ml的過碘酸鈉溶液；將終濃度為10-15mg/ml的過碘酸鈉溶液與濃度為 l-2mg/ul的辣根過氧化物酶等比例混合得到被過碘酸鈉氧化過的辣根過氧化物酶；將氧 化過的辣根過氧化物酶與濃度為l_2mg/ml親和素等體積混合后在4-8°C透析10_12h ;然后 在透析液中按I :8-12加入8-12mg/ml硼氫化鈉還原即得酶標(biāo)親和素；將所得酶標(biāo)親和素 與甘油等體積混合，_15 20°C保存?zhèn)溆茫?br>[0020] 樣本緩沖液的配制：所述樣本緩沖液是在PH6. 0-7. 0、濃度為IO-IOOmM的磷酸鹽 緩沖液中，分別加入〇. l_3mM的金屬離子絡(luò)合劑、1-10%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的蛋白保護(hù)劑、0. 01-1% 質(zhì)量分?jǐn)?shù)的表面活性劑、〇. 01-0. 5%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的防腐劑混合而成；
[0021] 底物A :將過氧化氫純品加入到濃度為IO-IOOmM檸檬酸鹽緩沖液中，配制成過氧 化氫質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20-50%的檸檬酸鹽混合溶液；
[0022] 底物B :將四甲基聯(lián)苯胺加入到濃度為IO-IOOmM檸檬酸鹽緩沖液中，配制成四甲 基聯(lián)苯胺質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5-20 %的檸檬酸鹽混合溶液；
[0023] 終止液：將濃硫酸加水稀釋至IM ;
[0024] 濃縮洗液：把質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 05-1 %的表面活性劑加到PH6. 0-7. 0、濃度為 IO-IOOmM磷酸鹽緩沖液中，然后混勻。
[0025] 磷酸鹽緩沖液的簡(jiǎn)寫為PBS，其為磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氯化鈉的混合物，是按 照實(shí)驗(yàn)室常規(guī)操作制備而成；辣根過氧化物酶簡(jiǎn)寫HRP ;
[0026] 本發(fā)明由于所用的檢測(cè)儀器較為簡(jiǎn)單，均為通常所用儀器，故檢測(cè)成本較低，利于 推廣；并且該試劑盒容易操作，不需要專業(yè)的人員即可實(shí)現(xiàn)；同時(shí)試劑盒內(nèi)獨(dú)特的標(biāo)準(zhǔn)品 稀釋液和樣本緩沖液配方，大大提高了檢測(cè)結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性。
【附圖說明】
[0027] 圖1為實(shí)施例8標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
[0028] 圖2為實(shí)施例9標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
[0029] 圖3為實(shí)施例10標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
[0030] 圖4為實(shí)施例11標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
[0031] 圖5為實(shí)施例12標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
[0032] 圖6為實(shí)施例13標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
【具體實(shí)施方式】
[0033] 下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。
[0034] 實(shí)施例1:生物素標(biāo)記的氧化低密度脂蛋白克隆抗體制備
[0035] (1)生物素的活化
[0036] 生物素在與氧化低密度脂蛋白克隆抗體偶聯(lián)前必須先活化，具體活化步