一種汞-極低密度脂蛋白螯合物及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明設及重金屬離子的免疫學檢測，具體設及一種隸-極低密度脂蛋白馨合物 及其制備方法和應用。
【背景技術】
[0002] 脂蛋白（lipoproteins)是蛋白質與脂質結合所形成的一種脂質-蛋白質復 合物，按密度分為高密度脂蛋白化i曲densitylipoprotein,簡稱皿L)、中間密度脂 蛋白（intermediatedensitylipoprotein,簡稱IDL)、低密度脂蛋白（lowdensity lipoprotein,簡稱LDL)、極低密度脂蛋白（verylowdensitylipoprotein,簡稱VLDL)、 乳糜顆粒（chylomicron,CM)。血液中大約百分之S十的膽固醇是通過皿L從組織細胞中 運輸?shù)礁闻K轉化為膽汁酸或通過膽汁排出體外的。血液中約70%的膽固醇由LDL和VLDL 所攜帶，肝臟中產生的內源性甘油S醋（triglyceride,TG)也主要依靠VLDL運輸至肝外。 VLDL的增多與高脂血癥、脂代謝素亂息息相關，而血脂異常又是多種疾病發(fā)生的重要危險 因素，因而VLDL含量水平的穩(wěn)定對于人體各方面機能功能的穩(wěn)定起著重要作用。
[0003] VLDL含量水平及結構功能的穩(wěn)定對機體意義重大。其含量過高與脂肪肝、脂代謝 素亂、屯、血管疾病、腎臟功能損傷等息息相關。定量檢測VLDL可W用于該些疾病的早期診 斷W及治療效果監(jiān)測，甚至作為預后好壞的評價指標之一。而對于營養(yǎng)不良、慢性貧血、肝 功能受損者等患者，血清VLDL含量也會下降，定量檢測VLDL也可用于該些疾病的早期診 斷、治療效果監(jiān)測W及作為預后評價的指標之一。
[0004] 隸（Mer州巧，Hg)是一種無處不在的重金屬，廣泛應用于工業(yè)、農業(yè)、醫(yī)藥業(yè)，是 一種非常重要的環(huán)境污染物。2011年，美國毒物和疾病登記署扣nitedStatesAgency forToxicSubstancesandDiseaseRegistry,ATSDR)已將其列入物質優(yōu)先列表內 (SubstancePriorityList),而世界衛(wèi)生組織（WorldHealthOrganization,WHO)也早已 將其列為10大最易引起健康問題的化學品之一。
[0005] 隸被認為是對人體及其有害的，會影響人體的多個組織、器官及系統(tǒng)，包括屯、血管 系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、神經系統(tǒng)、內分泌系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等，對人體危害極 大。關于隸致機體損傷的機制及其復雜，是很多學者及專家的研究中屯、。目前普遍研究認 為隸是一個具有其極強的琉基結合能力的金屬，因此推測其與多種蛋白質之間關系密切。 眾所周知，蛋白質作為身體多種功能的執(zhí)行者，與機體各組織、器官功能的穩(wěn)定息息相關， 而隸作為一種金屬與機體內的多種蛋白質皆關系密切，相信隸與蛋白質之間的相互關系與 隸致機體損傷息息相關，研究隸與蛋白質的關系將有助于我們了解隸致機體損傷的具體機 制。
[0006] 隸是一種強有力的琉基結合劑，隸也表現(xiàn)出對氨基、磯酷基、駿基及哲基團巨大的 親和力。因此，隸可W廣泛地結合多種蛋白質，并影響他們的功能，抑制他們的活性。隨著 對隸毒性研究的深入，人們逐漸認識到隸與蛋白的相互作用在其致毒過程中扮演著重要的 角色，被認為是了解隸的毒性機理的關鍵所在，因此，對隸和蛋白質相互作用的研究就顯得 愈發(fā)重要。而現(xiàn)在關于隸與蛋白質作用的機理僅是冰山一角，還有很多蛋白質與隸之間的 關系還不清楚，因而加強研究對于隸與蛋白質之間的關系至關重要。

【發(fā)明內容】

[0007] 針對隸污染嚴重的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種隸-極低密度脂蛋白馨合物 及其制備方法，并建立隸-極低密度脂蛋白馨合物的定性、定量檢測方法，W便定量檢測 隸-極低密度脂蛋白馨合物在評價一個地區(qū)隸污染程度的應用。通過定量檢測一個地區(qū)人 群血清中隸-極低密度脂蛋白馨合物，可W間接反映該個地區(qū)人群受隸污染的情況，從而 間接反映該個地區(qū)隸污染程度。
[000引本發(fā)明解決其技術問題所采用的技術方案是；提供一種隸-極低密度脂蛋白馨合 物，該隸-極低密度脂蛋白馨合物是隸離子與極低密度脂蛋白通過琉基或/和半脫氨酸殘 基馨合而成。
[0009] 本發(fā)明還提供一種上述的隸-極低密度脂蛋白馨合物的制備方法，即體外合成 法，包括W下步驟：
[0010] A)隸-極低密度脂蛋白馨合物的合成；在提純源于人體的極低密度脂蛋白或按照 生物學方法重組的極低密度脂蛋白中加入隸離子進行馨合反應，得到反應溶液；
[0011] B)隸-極低密度脂蛋白馨合物純化；采用免疫親和層析法，去除步驟A)反應溶液 中未反應的極低密度脂蛋白、特異性抗體和隸離子，即得隸-極低密度脂蛋白馨合物。
[0012] 作為優(yōu)選，所述步驟B)中具體包括W下步驟：
[0013] (1)溶解樣品；將上述步驟A)的隸-極低密度脂蛋白馨合物溶解于生理鹽水中， 得隸-極低密度脂蛋白馨合物的溶液；
[0014] (2)平衡層析柱；使用稀釋緩沖液沖洗層析柱的管路，在層析柱中裝入能與極低 密度脂蛋白特異性結合的填料，裝柱后，繼續(xù)使用稀釋緩沖液平衡層析柱；
[00巧]做上樣：待層析柱平衡后，用稀釋緩沖液稀釋步驟（1)的溶液，然后上柱，使極低 密度脂蛋白與填料特異性結合；
[0016] (4)洗脫；使用稀釋緩沖液沖洗層析柱至基線平衡，然后使用0. 05-0.lOmol/L的 化2冊〇4溶液進行洗脫；
[0017] (5)收集；收集步驟（4)的洗脫液，收集完畢后立即使蛋白復原；
[0018] (6)透析；將步驟巧）中的收集的洗脫液，裝透析袋，用d地2〇透析除鹽，換水S次 后，4°C透析過夜，收集樣本；
[0019] (7)平衡層析柱；采用新的層析柱，用稀釋緩沖液沖洗管路，在該層析柱中裝入能 與隸特異性結合的填料，裝柱后再用稀釋緩沖液平衡層析柱；
[0020] (8)上樣；待層析柱平衡后，用稀釋緩沖液稀釋步驟化）中樣本，然后上柱；
[0021] (9)洗脫；使用稀釋緩沖液沖洗層析柱至基線平衡，然后使用0. 5-1.Omol/L的 化2冊〇4溶液進行洗脫；
[0022] (10)收集；收集步驟巧）的洗脫液，收集完畢后立即使蛋白復原；
[002引 （11)透析；將步驟（10)的洗脫液，裝透析袋，用(1化0透析除鹽，換水立次后，4°C 透析過夜，收集樣本，即得隸-極低密度脂蛋白馨合物。
[0024] 作為優(yōu)選，上述隸-極低密度脂蛋白馨合物的制備方法，還包括W下對隸-極低密 度脂蛋白馨合物的鑒定步驟，具體包括w下步驟：
[0025] (1)制備膠床；W瓊脂糖凝膠、聚丙締酷胺凝膠中的一種作為介質制備膠床；
[002引 似加樣；取步驟B)中提取純化得到的隸-極低密度脂蛋白馨合物，加入上樣緩 沖液，并混勻，然后加樣于樣品槽中；
[0027] 做電泳：連接電泳板，進行電泳；
[0028] (4)檢測；在膠床上找出含有隸的蛋白條帶，將該蛋白條帶取出，將蛋白條帶溶 解，然后再采用ICP-MS或AAS檢測是否含有隸W及檢測隸的含量。
[0029] 本發(fā)明還提供一種如上述的隸-極低密度脂蛋白馨合物在制備檢測人體內隸-極 低密度脂蛋白馨合物的試劑或試劑盒中的應用。
[0030] 本發(fā)明還提供一種至少包括如上述的隸-極低密度脂蛋白馨合物作為標準品的 試劑盒。
[0031] 優(yōu)選地，該試劑盒中還包括包被液，該包被液含有捕獲極低密度脂蛋白的物質或 捕獲金屬隸的物質。
[0032] 本發(fā)明還提供一種定量檢測隸-極低密度脂蛋白馨合物的方法，W已知含量的上 述的隸-極低密度脂蛋白馨合物作為標準品，采用W下方法之一對樣品進行檢測；酶聯(lián)免 疫法、酶聯(lián)免疫與原子吸收光譜結合法、酶聯(lián)免疫與電感禪合等離子體質譜結合法、提純 隸-極低密度脂蛋白馨合物與酶聯(lián)免疫結合法、提純隸-極低密度脂蛋白馨合物與原子吸 收光譜結合法、提純隸-極低密度脂蛋白馨合物與電感禪合等離子體質譜結合法、電泳與 酶聯(lián)免疫或原子吸收光譜或電感禪合等離子體質譜結合法。
[0033] 相比現(xiàn)有技術，本發(fā)明的有益效果在于：
[0034] 1.本發(fā)明首次合成了隸-極低密度脂蛋白馨合物；
[0035] 2.本發(fā)明首次提出隸-極低密度脂蛋白馨合物可用于制備檢測血樣中隸-極低密 度脂蛋白馨合物的試劑或試劑盒中的應用；
[0036] 3.本發(fā)明實現(xiàn)了隸-極低密度脂蛋白馨合物的特異性識別和定量檢測，W便定量 檢測人群血清中隸-極低密度脂蛋白馨合物的含量，W評價一個地區(qū)隸污染程度的應用， 為工業(yè)地區(qū)的隸污染水平提供間接指標。本發(fā)明建立的隸-極低密度脂蛋白馨合物定量檢 測方法的準確度高、重復性好。
【附圖說明】
[0037]圖1為本發(fā)明所述的隸-極低密度脂蛋白馨合物的非變性電泳條帶圖；
[003引圖2為本發(fā)明所述的隸-極低密度脂蛋白馨合物的電泳條帶的同步福射X線巧光 分析圖。
【具體實施方式】
[0039] 下面結合【具體實施方式】，對本發(fā)明做進一步描述：
[0040] 本發(fā)明除特別說明外，設及的實驗操作步驟均為本領域常規(guī)的步驟；所用試劑、材 料如未特殊說明，均視為可從市購方式購得：
[0041] 提取試劑為PEG溶液、棚酸鹽緩沖液等（采用PEG法）；
[0042] 捕獲極低密度脂蛋白的物質為抗極低密度脂蛋白抗體，可通過市售獲得，W下實 施例中，使用的抗極低密度脂蛋白抗體為"Genetex gtxl6419"的VLDL antibody,所述與極 低密度脂蛋白特異性結合的物質、抗極低密度脂蛋白抗體、抗VLDL抗體均為捕獲極低密度 脂蛋白的物質；
[0043] 酶標抗體為含有辣根過氧化物酶、堿性磯酸酶等酶標記的抗體中的一種；
[0044] 稀釋緩沖液為抑9.6的0. 05M碳酸鹽緩沖液，配制方法示例：取1. 5g的化化和 2. 93g的Na肥〇3溶解加d地2〇定容至1000血；
[0045] 洗漆緩沖液為抑7. 4的0. 15MPBS溶液，配制方法示例：取0. 2g的皿2口〇4、2. 90g 的化2冊〇4? 12&0、8.Og的NaCl、0. 2g的KC1、0. 5mLTween-20,溶解加dd&O定容至 1000血；
[0046] 封閉液為牛血清白蛋白溶液，配制方法示例：取0.Ig牛血清白蛋白，加入洗漆緩 沖液稀釋定容至lOOmL;
[0047] 終止液為2MH2SO4,配制方法示例：取17