檢測(cè)空腸彎曲菌的方法及其單抗的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物檢測(cè)領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及一種抗空腸彎曲菌單克隆抗 體、產(chǎn)生該單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞以及抗空腸彎曲菌的單克隆抗體的用途。
【背景技術(shù)】
[0002]空腸彎曲菌（Campylobacterjejunienteritis)是 1973 年Butzler等自腹瀉病 人糞便中分離出來(lái)，目前已認(rèn)識(shí)其為人類腹瀉的主要致病菌之一?？漳c彎曲菌腸炎的發(fā)病 率在發(fā)達(dá)國(guó)家超過(guò)細(xì)菌性痢疾，在發(fā)展中國(guó)家發(fā)病率幾乎等同于細(xì)菌性痢疾。本菌作為重 要的食源性致病菌，隨著食物進(jìn)入腸道后在含微量氧環(huán)境下迅速繁殖，主要侵犯空腸、回腸 和結(jié)腸，侵襲腸粘膜，造成充血及出血性損傷，近年來(lái)觀察到有些菌株能產(chǎn)生類似霍亂腸毒 素，引起腸腔內(nèi)液體分泌增加。
[0003] 目前空腸彎曲菌的檢測(cè)主要依賴于國(guó)標(biāo)所規(guī)定的生化鑒定，其缺點(diǎn)是操作繁瑣、 檢測(cè)周期較長(zhǎng)，無(wú)法適應(yīng)大量的樣品篩查。免疫學(xué)檢測(cè)是近年來(lái)出現(xiàn)的最快速、準(zhǔn)確、穩(wěn)定 的快速檢測(cè)手段，但國(guó)內(nèi)外目前尚無(wú)可運(yùn)用于檢測(cè)實(shí)踐的快速檢測(cè)產(chǎn)品，該專利以空腸彎 曲菌為檢測(cè)靶標(biāo)，所要求保護(hù)的技術(shù)涉及空腸彎曲菌快速檢測(cè)產(chǎn)品。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種體外檢測(cè)副溶血性弧菌的方法。
[0005] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供用于上述方法的兩株由同一次單克隆抗體制備過(guò)程 產(chǎn)生的可特異性地結(jié)合于副溶血性弧菌不同抗原位點(diǎn)的單克隆抗體。
[0006] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供產(chǎn)生上述單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞。
[0007] 本發(fā)明的第一方面是提供了一種體外檢測(cè)空腸彎曲菌的方法，所述方法用于非疾 病診斷目的，包括以下步驟：
[0008] (a)將待測(cè)樣品加樣于包被有捕捉抗體的固相載體，從而使待測(cè)樣品中的空腸彎 曲菌與固相載體上的捕捉抗體結(jié)合，形成帶有"空腸彎曲菌-捕捉抗體"二元復(fù)合物的固相 載體；所述的捕捉抗體是特異性地結(jié)合于空腸彎曲菌的單克隆抗體3G2D8H3G9,所述的單 克隆抗體3G2D8H3G9由小鼠雜交瘤細(xì)胞系3G2D8H3G9,CGMCCNo. 8766產(chǎn)生；
[0009] (b)將檢測(cè)抗體加樣于（a)獲得的固相載體，從而形成帶有"檢測(cè)抗體-空腸彎 曲菌-捕捉抗體"三元復(fù)合物的固相載體；所述的檢測(cè)抗體是特異性地結(jié)合于空腸彎曲菌 的單克隆抗體4C9E1G7H3,所述的單克隆抗體4C9E1G7H3由小鼠雜交瘤細(xì)胞系4C9E1G7H3， CGMCCNo. 8457產(chǎn)生，且所述的單克隆抗體4C9E1G7H3攜帶一可檢測(cè)標(biāo)記物；和
[0010] (C)檢測(cè)三元復(fù)合物中的可檢測(cè)標(biāo)記物，從而確定待測(cè)樣品中空腸彎曲菌的存在 與否以及存在的量。
[0011] 在一優(yōu)選例中，所述的固相載體為酶標(biāo)反應(yīng)板。
[0012] 在另一優(yōu)選例中，所述的可檢測(cè)標(biāo)記物為辣根過(guò)氧化物酶。
[0013] 本發(fā)明的第二方面是提供了一種免疫球蛋白，它是特異性地結(jié)合于空腸彎曲菌的 單克隆抗體，它由小鼠雜交瘤細(xì)胞系3G2D8H3G9,CGMCCNo. 8766所產(chǎn)生。
[0014] 本發(fā)明的第三方面是提供了一種產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，它是小鼠雜交瘤 細(xì)胞系 3G2D8H3G9,CGMCCNo. 8766。
[0015] 本發(fā)明的第四方面是提供了上述免疫球蛋白的用途，它被用于檢測(cè)空腸彎曲菌， 所述用途用于非疾病診斷目的。
[0016] 本發(fā)明的第五方面是提供了一種免疫球蛋白，它是特異性地結(jié)合于空腸彎曲菌的 單克隆抗體，它由小鼠雜交瘤細(xì)胞系4C9E1G7H3,CGMCCNo. 8457所產(chǎn)生。
[0017] 本發(fā)明的第六方面是提供了一種產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，它是小鼠雜交瘤 細(xì)胞系 4C9E1G7H3,CGMCCNo. 8457。
[0018] 本發(fā)明還提供了上述免疫球蛋白的用途，它被用于檢測(cè)空腸彎曲菌，所述用途用 于非疾病診斷目的。
[0019] 本發(fā)明各個(gè)方面的細(xì)節(jié)將在隨后的章節(jié)中得以詳盡描述。通過(guò)下文以及權(quán)利要求 的描述，本發(fā)明的特點(diǎn)、目的和優(yōu)勢(shì)將更為明顯。
【附圖說(shuō)明】
[0020] 圖1本發(fā)明的單克隆抗體的SDS-PAGE電泳圖
[0021] Lanel :4C9E1G7H3, Lane3 :3G2D8H3G9〇
【具體實(shí)施方式】
[0022] 本發(fā)明人的研究表明，以空腸彎曲菌作為免疫原，免疫Balb/c小鼠，分離純化得 到抗空腸彎曲菌單克隆抗體4C9E1G7H3和3G2D8H3G9,其抗體效價(jià)可達(dá)到1:100000,其能夠 特異性、高效地與空腸彎曲菌結(jié)合，與單增李斯特、豬霍亂沙門(mén)、鼠傷寒沙門(mén)、腸炎沙門(mén)、福 氏志賀、宋內(nèi)氏志賀、鮑氏志賀、大腸〇157:H7、小腸耶爾森氏菌等91種細(xì)菌（株）均無(wú)交叉 反應(yīng)。
[0023] 本發(fā)明提供了抗空腸彎曲菌單克隆抗體。本發(fā)明的抗空腸彎曲菌單克隆抗體可以 利用小鼠雜交瘤細(xì)胞系 4C9E1G7H3(CGMCCNo. 8457)或 3G2D8H3G9(CGMCCNo. 8766)分泌產(chǎn) 生。本發(fā)明包括具有抗空腸彎曲菌單克隆抗體4C9E1G7H3和3G2D8H3G9的相應(yīng)氨基酸序列 的單克隆抗體，以及具有這些鏈的其他蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)偶聯(lián)物及融合表達(dá)產(chǎn)物。具體地，本 發(fā)明包括具有含超變區(qū)（互補(bǔ)決定區(qū)，CDR)的輕鏈和重鏈的任何蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)偶聯(lián)物及 融合表達(dá)產(chǎn)物（即免疫偶聯(lián)物及融合表達(dá)產(chǎn)物），只要該超變區(qū)與本發(fā)明的輕鏈和重鏈的 超變區(qū)相同或至少90%同源性，較佳地至少95%同源性。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，免疫偶 聯(lián)物及融合表達(dá)產(chǎn)物包括：藥物、毒素、細(xì)胞因子（cytokine)、放射性核素、酶和其他診斷 或治療分子與抗空腸彎曲菌單克隆抗體或其片段結(jié)合的而形成的偶聯(lián)物。本發(fā)明還包括與 抗空腸彎曲菌單克隆抗體或其片段結(jié)合的細(xì)胞表面標(biāo)記物或抗原。
[0024] 對(duì)于本發(fā)明的抗空腸彎曲菌單克隆抗體重鏈和輕鏈序列，可以用常規(guī)方法測(cè)定。 抗空腸彎曲菌單克隆抗體V鏈的超變區(qū)或互補(bǔ)決定區(qū)（complementaritydetermining region，⑶R)特別令人感興趣，因?yàn)樗鼈冎兄辽俨糠稚婕敖Y(jié)合抗原。因此，本發(fā)明包括那些 具有帶CDR的免疫球蛋白輕鏈和重鏈可變鏈的分子，只要其CDR與抗空腸彎曲菌單克隆抗 體⑶R具有90%以上（較佳地95%以上）的同源性。本發(fā)明不僅包括完整的單克隆抗體， 還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab或（Fab'）2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈。
[0025] 本發(fā)明還提供了上述免疫球蛋白或其片段的DNA分子。這些DNA分子的序列可以 用常規(guī)技術(shù)，利用雜交瘤細(xì)胞系 4C9E1G7H3(CGMCCNo. 8457)或 3G2D8H3G9(CGMCCNo. 8766) 獲得。此外，還可將輕鏈和重鏈的編碼序列融合在一起，形成單鏈抗體。
[0026] -旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來(lái)大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將 其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過(guò)常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。
[0027] 此外，還可用人工合成的方法來(lái)合成有關(guān)序列，尤其是片段長(zhǎng)度較短時(shí)。通常，通 過(guò)先合成多個(gè)小片段，然后再進(jìn)行連接可獲得序列很長(zhǎng)的片段。
[0028]目前，已經(jīng)可以完全通過(guò)化學(xué)合成來(lái)得到編碼本發(fā)明蛋白（或其片段，或其衍生 物）的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領(lǐng)域中己知的各種現(xiàn)有的DNA分子（或如載 體）和細(xì)胞中。此外，還可通過(guò)化學(xué)合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。
[0029] 本發(fā)明還涉及包含上述的適當(dāng)DNA序列以及適當(dāng)啟動(dòng)子或者控制序列的載體。這 些載體可以用于轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，以使其能夠表達(dá)蛋白質(zhì)。
[0030] 宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞；或是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；或是高 等真核細(xì)胞，如哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
[0031] 用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。當(dāng)宿主為原 核生物如出血性大腸桿菌時(shí)，能吸收DNA的感受態(tài)細(xì)胞可在指數(shù)生長(zhǎng)期后收獲，用CaClJi 處理，所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電 穿孔的方法進(jìn)行。當(dāng)宿主是真核生物，可運(yùn)用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法：磷酸鈣共沉淀法，常規(guī) 機(jī)械方法如顯微注射、電穿孔，脂質(zhì)體包裝等。
[0032] 獲得的轉(zhuǎn)化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達(dá)本發(fā)明的基因所編碼的多肽。根據(jù)所用 的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細(xì)胞生長(zhǎng)的條件下 進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)宿主細(xì)胞生長(zhǎng)到適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度后，用合適的方法（如溫度轉(zhuǎn)換或化學(xué)誘導(dǎo)）