專利名稱：一種檢測空腸彎曲菌的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細菌的基因檢測，特別涉及空腸彎曲菌的熒光PCR檢測。
背景技術(shù)：
空腸彎曲菌(Campylobacter jejuni)是近十幾年來被認識的世界范圍廣泛流行的人獸共患病原菌。鳥、禽、狗、牛、豬等動物是該菌的貯存宿主，其中豬帶菌率為30％，奶牛帶菌率為10.7％，雞帶菌率高達60％～95％。該菌可引起牛和綿羊流產(chǎn)，火雞肝炎和藍冠病，童子雞和雛雞壞死性肝炎，以及雛雞、犢牛和仔豬腹瀉等多種疾病?？漳c彎曲菌可以通過動物、鳥和患病者的糞便進入環(huán)境中，由于該菌對環(huán)境較敏感，所以不可能在宿主外存活時間太長，但在水中可以進入一種稱為“非可培養(yǎng)狀態(tài)”(Viable butnon-culturerable，VNC)的休眠期。在條件適宜時，VNC狀態(tài)的空腸彎曲菌可增殖生長，通過環(huán)境及食物鏈進入人體。接觸畜禽類，或食入受到污染的禽制品、水源和牛奶是該菌感染人體的主要媒介。
空腸彎曲菌可引起人體急性腸炎和食物中毒，并引發(fā)格林-巴利綜合癥、反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎、瑞特氏病和肝炎等嚴重的并發(fā)癥。世界衛(wèi)生組織已將該病列為最常見的食源性傳染病之一，并指出必須加強監(jiān)測各地區(qū)空腸彎曲菌在動物和人體中的分布，減少或切斷主要傳染家禽、家畜及其制品對人體的傳播。
建立空腸彎曲菌快速而特異性的分離和檢測方法，是有效控制和預(yù)防該類“正在發(fā)展的食源性病原菌”的關(guān)鍵所在。面對復(fù)雜多樣的實物樣品時，傳統(tǒng)的分離鑒定方法需要耗費大量的時間和人力，而且存在敏感性低、難以檢測VNC狀態(tài)的空腸彎曲菌和易出現(xiàn)假陰性結(jié)果等問題，這將嚴重制約對該菌的快速準確檢測，因此迫切要求新的檢測技術(shù)能有效的改變這一狀況。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在提供一種空腸彎曲菌的實時熒光PCR檢測方法。該方法利用抗彎曲菌免疫磁珠直接捕獲檢樣中的空腸彎曲菌，通過熒光PCR技術(shù)分別檢測空腸彎曲菌特定的基因，從而達到準確、快速、靈敏檢測空腸彎曲菌的目的。
實現(xiàn)本發(fā)明方法的技術(shù)方案是應(yīng)用抗血清和磁性微珠制備空腸彎曲菌免疫磁珠，利用免疫磁珠直接捕獲檢樣中的空腸彎曲菌，煮沸法提取空腸彎曲菌的DNA，設(shè)計合成用于擴增空腸彎曲菌鞭毛蛋白A(flaA)基因的引物與探針和/或空腸彎曲菌的馬尿酸酶(hipO)基因的引物與探針，通過熒光PCR技術(shù)檢測得到擴增產(chǎn)物的熒光信號。
其中flaA基因的引物序列為flaA15’-ctgaatttgataccttaagtgcagc-3’及flaA25’-aggcacgcctaaacctatagct-3’，探針為5’-tgtgaaagaatttatcctaaagatgagcaaggaga-3’；hipO基因的引物序列為hipO15’-tgcttctttacttgttgtggcttt-3’及hipO25’-gctcctatgcttacaactgctgaatt-3’，探針為5’-caaagcatagtatctcgcaatgttgatcccc-3’，所有探針的5’端標記熒光報告基團，3’端標記熒光淬滅基團，二者可構(gòu)成能量傳遞結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明的優(yōu)點是(1)利用免疫磁珠捕獲技術(shù)可快速收集、濃縮檢樣中的目的菌，簡便、特異、安全的免疫磁珠法也為分離受損傷或處于VNC狀態(tài)的空腸彎曲菌提供了一種有效手段，這也是常規(guī)培養(yǎng)分離方法所不及的。(2)實時熒光PCR使PCR擴增與產(chǎn)物分析的全過程在單管封閉條件下進行，實現(xiàn)了對PCR擴增及產(chǎn)物分析的實時監(jiān)控和自動化操作，無須電泳步驟，避免了交叉污染和假陽性結(jié)果。而且實時熒光PCR增加了熒光標記探針與目標序列的雜交步驟，因而專一性更高、結(jié)果更準確。(3)免疫磁珠捕獲結(jié)合實時熒光PCR檢測方法，更顯示出優(yōu)越性。免疫磁珠直接分離檢樣中的靶細菌，除去了PCR抑制物質(zhì)，提高了畜禽類食品中空腸彎曲菌的檢出率和靈敏度；熒光PCR特異性地擴增空腸彎曲菌flaA基因和hipO基因，免疫磁珠吸附的其它雜菌不會干擾PCR結(jié)果，解決了親緣關(guān)系很近的空腸彎曲菌和結(jié)腸彎曲菌的鑒別難題。


圖1為flaA引物及熒光探針的實時PCR特異性試驗結(jié)果。其中各條曲線表示1.空腸彎曲菌ATCC33560，Ct＝23.248；2.空腸彎曲菌ATCC8341，Ct＝27.147；3.空腸彎曲菌XMIQ030516，Ct＝29.196；4.滅菌超純水，Ct＝40.00；5.埃希氏大腸桿菌，Ct＝40.00；6.鼠傷寒沙門氏菌，Ct＝40.00；7.結(jié)腸彎曲菌，Ct＝40.00；8.單核細胞增生李斯特菌，Ct＝40.00；9.宋氏志賀氏菌，Ct＝40.00。
圖2為hipO引物及熒光探針的實時PCR特異性試驗結(jié)果。其中各條曲線表示1.空腸彎曲菌ATCC33560，Ct＝21.344 2.空腸彎曲菌ATCC8341，Ct＝16.348；3.空腸彎曲菌XMIQ030516，Ct＝16.147；4.空腸彎曲菌XMIQ030827，Ct＝22.796；5.滅菌超純水，Ct＝40.00；6.埃希氏大腸桿菌，Ct＝40.00；7.結(jié)腸彎曲菌，Ct＝40.00。
圖3為磁捕獲-熒光PCR檢測混合菌結(jié)果。其中各條曲線表示1.hipO引物及探針的PCR擴增，Ct＝18.766；2.flaA引物及探針的PCR擴增，Ct＝22.038；3.滅菌超純水，Ct＝40.00。
圖4為磁捕獲-熒光PCR(hipO引物及探針)檢測實物樣品結(jié)果。其中各條曲線表示1.實物樣品-3，Ct＝17.432；2.實物樣品-5，Ct＝19.021；3.空腸彎曲菌ATCC33560，Ct＝19.011；4.結(jié)腸彎曲菌，Ct＝40.000。
具體實施例方式
下面通過具體實施例對本發(fā)明作進一步說明。
本發(fā)明首先是用抗彎曲菌免疫磁珠直接捕獲檢樣中的空腸彎曲菌，磁捕獲方法分離空腸彎曲菌特異性高且時間短。磁捕獲方法分離空腸彎曲菌采用以下步驟1.免疫磁珠的制備取磁珠液于磷酸緩沖液(PBST)中，混勻，2000～5000rpm離心2～5min，棄液體；重復(fù)清洗2～3次后，加入PBST使磁珠重懸其中；加入彎曲菌免疫血清，4℃輕緩旋轉(zhuǎn)振蕩15～25h；同上清洗3～5次后，加入PBST使磁珠重懸其中，制備的免疫磁珠懸液于4℃保存?zhèn)溆谩?br> 2.空腸彎曲菌的捕獲無菌操作取檢樣至蛋白胨水中，輕緩振蕩20～30min；取檢樣上清液于2000～3000rpm離心2～5min，上清液再次于3000～5000rpm離心15～30min，棄液體，沉淀重懸于PBST中；取檢樣懸液于裝有免疫磁珠懸液的小管中，室溫輕緩旋轉(zhuǎn)振蕩20～30min；將小管置于磁場旁1～3min，小心移出管中液體；加入PBST混勻，置于磁架或磁場旁3min，移出液體；重復(fù)清洗3～5次，加入滅菌超純水使吸附彎曲菌的磁珠重懸其中。取彎曲菌磁珠懸液，100℃水浴10min，3000～5000rpm離心5～10min，即可獲得空腸彎曲菌。
本發(fā)明的要點在于設(shè)計合成用于擴增及檢測空腸彎曲菌的兩組引物與探針。第一組探針針對flaA基因，其引物為flaA15’-ctgaatttgataccttaagtgcagc-3’/flaA25’-aggcacgcctaaacctatagct-3’，探針為5’-tgtgaaagaatttatcctaaagatgagcaaggaga-3’；第二組針對hipO基因，其引物為hipO15’-tgcttctttacttgttgtggcttt-3’/hipO25’-gctcctatgcttacaactgctgaatt-3’，探針為5’-caaagcatagtatctcgcaatgttgatcccc-3’。所有探針的5’端標記熒光報告基團，3’端標記熒光淬滅基團，二者可構(gòu)成能量傳遞結(jié)構(gòu)。
3.DNA擴增及實時熒光PCR檢測。熒光PCR擴增反應(yīng)體系含有10×PCR緩沖液，MgCl2，dNTP(dATP，dGTP，dCTP，dUTP)，flaA基因引物和/或hipO基因引物，TaqMan探針，DNA糖基化酶(UNG酶)，DNA聚合酶(Taq酶)，細菌DNA模板，滅菌超純水。擴增或檢測時可單獨針對flaA基因，也可單獨針對hipO基因，也可同時擴增或檢測兩個基因，即要擴增或檢測某個基因，就加入相應(yīng)的引物及探針。熒光PCR擴增反應(yīng)條件為50℃/2min，預(yù)變性95℃/10min；而后95℃/15s，55℃/60s，共40個循環(huán)，不同儀器應(yīng)將反應(yīng)參數(shù)作適當調(diào)整。檢測時可設(shè)立陽性對照如空腸彎曲菌ATCC33560，陰性對照如結(jié)腸彎曲菌和滅菌超純水的空白對照。反應(yīng)結(jié)束后，打開分析軟件，儀器自動給出每個檢樣的循環(huán)閥值(Ct值)，依據(jù)所得Ct值對檢樣進行結(jié)果判定。
免疫磁珠的制備與空腸彎曲菌DNA的獲取取0.1mL磁珠液(Dynal公司生產(chǎn)的Dynabeads M-280 Sheep anti-Rabbit IgG)于1.0mL PBST緩沖液中，混勻，3000rpm離心2min，棄液體；重復(fù)清洗2～3次后，加入1.0mL PBST緩沖液使磁珠重懸其中；加入0.1mL彎曲菌免疫血清，4℃輕緩旋轉(zhuǎn)振蕩18h；用1.0mL PBST緩沖液清洗3～5次后，加入0.5mL PBST緩沖液使磁珠重懸其中，制備的免疫磁珠懸液于4℃保存?zhèn)溆?。無菌操作取檢樣至50mL蛋白胨水中，輕緩振蕩30min；取檢樣上清液于3000rpm離心2min，上清液再次于5000rpm離心20min，棄液體，沉淀重懸于1.0mL PBST緩沖液中；取檢樣懸液于裝有0.1mL免疫磁珠懸液的小管中，室溫輕緩旋轉(zhuǎn)振蕩30min；將小管置于Dynal MPC-S磁架上3min，小心移出管中液體；加入1.0mL PBST緩沖液混勻，置于磁架上3min，移出洗液；重復(fù)清洗3～5次，加入0.1mL PBST緩沖液使吸附彎曲菌的磁珠重懸其中。取50μL彎曲菌磁珠懸液于0.5mL離心管中，100℃水浴10min，5000rpm離心5min，上清液于-20℃條件下保存?zhèn)溆谩?br> 合成用于檢測空腸彎曲菌的兩組引物與探針。第一組探針針對flaA基因，其引物為flaA15’-ctgaatttgataccttaagtgcagc-3’/flaA25’-aggcacgcctaaacctatagct-3’，探針為5’-tgtgaaagaatttatcctaaagatgagcaaggaga-3’；第二組針對hipO基因，其引物為hipO15’-tgcttctttacttgttgtggcttt-3’/hipO25’-gctcctatgcttacaactgctgaatt-3’，探針為5’-caaagcatagtatctcgcaatgttgatcccc-3’。
實施例1擴增及檢測空腸彎曲菌flaA基因的實時熒光PCR取空腸彎曲菌ATCC33560、空腸彎曲菌ATCC8341、空腸彎曲菌XMIQ030516、埃希氏大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、結(jié)腸彎曲菌、單核細胞增生李斯特菌、宋氏志賀氏菌的DNA及滅菌超純水各2μL，取合成的flaA引物1/2及探針各0.2μL，按照前述的步驟3“DNA擴增及實時熒光PCR檢測”中的反應(yīng)體系及條件進行擴增及檢測試驗，結(jié)果如圖1所示，多份空腸彎曲菌DNA均顯示陽性結(jié)果見圖1中曲線1～3；而其它菌株DNA均顯示陰性結(jié)果，其中包括屬內(nèi)同源程度極高的結(jié)腸彎曲菌見圖1中曲線7。結(jié)果表明，flaA引物及熒光探針對空腸彎曲菌檢測特異性高，能有效地鑒別空腸彎曲菌和結(jié)腸彎曲菌。
實施例2用于檢測空腸彎曲菌hipO基因的實時熒光PCR取空腸彎曲菌ATCC33560、空腸彎曲菌ATCC8341、空腸彎曲菌XMIQ030516、空腸彎曲菌XMIQ030827、埃希氏大腸桿菌、結(jié)腸彎曲菌DNA及滅菌超純水各2μL，取合成的hipO引物1/2及探針各0.2μL，按照前述的步驟3“DNA擴增及實時熒光PCR檢測”中的反應(yīng)體系及條件進行擴增及檢測試驗，結(jié)果如圖2所示，多份空腸彎曲菌DNA均顯示陽性結(jié)果見圖2中曲線1～4；而其它菌株DNA均顯示陰性結(jié)果，其中包括屬內(nèi)同源程度極高的結(jié)腸彎曲菌見圖A2中曲線6。結(jié)果表明，hipO基因引物及熒光探針對空腸彎曲菌檢測特異性高，能有效地鑒別空腸彎曲菌和結(jié)腸彎曲菌。
實施例3磁捕獲-熒光PCR檢測混合菌由于實際檢樣中可能同時帶有多種細菌，本實施例對多種混合菌進行實驗，針對含有單核細胞增生李斯特菌、綿羊李斯特菌、英諾克李斯特菌、宋氏志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌、臘樣芽孢桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、副溶血性弧菌、豚鼠氣單胞菌、溶藻弧菌、綠膿桿菌、嗜水氣單胞菌、埃希氏大腸桿菌、結(jié)腸彎曲菌和空腸彎曲菌ATCC33560等16種細菌的混合樣品，細菌磁捕獲及DNA提取方法按照實施例1進行，采用實施例2和3的步驟檢測空腸彎曲菌的flaA及hipO基因，結(jié)果如圖3所示，磁捕獲-熒光PCR檢測方法能抵抗其它細菌干擾，從含有混合菌的樣品中檢出空腸彎曲菌，排除了包括結(jié)腸彎曲菌在內(nèi)的多種細菌干擾，顯示出良好的特異性和抗干擾性，具有實際的應(yīng)用價值。
實施例4磁捕獲熒光PCR方法檢測實物樣品采集畜禽類實物樣品，彎曲菌的磁捕獲及DNA提取方法按照前述的步驟進行，本實施例只檢測空腸彎曲菌的hipO基因，hipO引物和探針的設(shè)計合成及hipO基因的熒光PCR檢測與實施例3相同，從27份實物樣品中檢出2份樣品含有空腸彎曲菌，結(jié)果顯示見圖4。
本方法利用抗彎曲菌免疫磁珠直接捕獲檢樣中的目的菌，磁珠捕獲的細菌進行DNA抽提；通過熒光PCR技術(shù)分別檢測空腸彎曲菌的鞭毛蛋白A(flaA)基因和馬尿酸酶(hipO)基因。本方法采用的磁捕獲結(jié)合熒光PCR技術(shù)，提高了畜禽類食品中空腸彎曲菌的檢出率和靈敏度，解決了親緣關(guān)系很近的空腸彎曲菌和結(jié)腸彎曲菌的鑒別難題，達到了準確、快速、靈敏的要求。
權(quán)利要求
1.一種檢測空腸彎曲菌的方法，利用抗血清免疫磁珠直接捕獲檢樣中的空腸彎曲菌，磁珠捕獲的細菌進行DNA抽提，其特征在于設(shè)計合成用于擴增空腸彎曲菌鞭毛蛋白A(flaA)基因的引物與探針和/或空腸彎曲菌馬尿酸酶(hipO)基因的引物與探針，通過熒光PCR技術(shù)檢測得到擴增產(chǎn)物相應(yīng)的熒光信號；其中flaA基因的引物序列為flaA15’-ctgaatttgataccttaagtgcagc-3’/flaA25’-aggcacgcctaaacctatagct-3’，探針序列為5’-tgtgaaagaatttatcctaaagatgagcaaggaga-3’；hipO基因引物序列為hipO15’-tgcttctttacttgttgtggcttt-3’/hipO25’-gctcctatgcttacaactgctgaatt-3’，探針序列為5’-caaagcatagtatctcgcaatgttgatcccc-3’，所有探針的5’端標記熒光報告基團，3’端標記熒光淬滅基團，二者可構(gòu)成能量傳遞結(jié)構(gòu)。
全文摘要
本發(fā)明涉及空腸彎曲菌的熒光PCR檢測，提供一種空腸彎曲菌的實時熒光PCR檢測方法，應(yīng)用抗血清和磁性微珠制備空腸彎曲菌免疫磁珠，利用免疫磁珠直接捕獲檢樣中的空腸彎曲菌，煮沸法提取空腸彎曲菌的DNA，設(shè)計合成用于擴增空腸彎曲菌鞭毛蛋白A(flaA)基因的引物與探針和/或空腸彎曲菌的馬尿酸酶(hipO)基因的引物與探針，通過熒光PCR技術(shù)檢測得到擴增產(chǎn)物的熒光信號；其中flaA基因的引物序列為flaA15’－ctgaatttgataccttaagtgcagc－3’/flaA25’－aggcacgcctaaacctatagct－3’，探針序列為5’－tgtgaaagaatttatcctaaagatgagcaaggaga－3’hipO基因引物序列為hipO 15’－tgcttctttacttgttgtggcttt－3’/hipO25’－gctcctatgcttacaactgctgaatt－3’，探針序列為5’－caaagcatagtatctcgcaatgttgatcccc－3’，本發(fā)明為畜禽等食品中的空腸彎曲菌的檢測提供快捷方法。
文檔編號G01N33/52GK1598544SQ20041005108
公開日2005年3月23日 申請日期2004年8月13日 優(yōu)先權(quán)日2004年8月13日
發(fā)明者劉光明, 韓雅莉, 章躍陵 申請人:汕頭大學