同時檢測空腸彎曲菌三種血清型的試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明設及PCR檢測技術領域，特別是設及用于檢測空腸彎曲菌血清型服:41、 HS: 19、服:2的特異性引物對組合和S重PCR檢測方法，本發(fā)明還設及同時檢測空腸彎曲菌 =種血清型的試劑盒。
【背景技術】
[0002] 空腸彎曲菌（Camp^obacterjejuni)是彎曲菌屬中主要導致人類疾病的食源性 病原菌，是導致人類腹瀉的主要病原之一。空腸彎曲菌分布廣泛，人類感染主要是由于空腸 彎曲菌污染食品、飲用水W及環(huán)境引起的，除腸炎外，空腸彎曲菌的感染可導致格林-己利 綜合癥（Guillian-Barresyn化ome，簡稱GB巧，給人類帶來嚴重的疾病負擔。國內外對空 腸彎曲菌的監(jiān)測都非常關注。
[0003] 空腸彎曲菌感染后導致GBS的機率不大，但特異菌型菌株，如血清型（Penner heat-st油Ieserotype,服）為服:41，服：19,服:2的菌株感染后導致GBS的危險度大大增 高。血清型為服:41菌株的感染，曾經(jīng)導致我國36人GBS的暴發(fā)。對于運種感染后可導致 嚴重疾病后果的空腸彎曲菌血清型的鑒別確定有利于疾病防控和保障公共衛(wèi)生安全。
[0004] 目前空腸彎曲菌的血清型鑒定試劑匿乏、昂貴，實驗步驟繁瑣，需要有經(jīng)驗的專業(yè) 人員操作，造成空腸彎曲菌血清分型的困難。因此迫切需要一種快速、準確、特異、靈敏地檢 測空腸彎曲菌血清型服:41，服：19,服：2的方法。

【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供用于同時檢測空腸彎曲菌（Camp^obacterjejuni)S種 血清型服:41，服：19,服：2的特異性引物對組合。
[0006] 本發(fā)明的另一個目的在于提供能夠同時檢測空腸彎曲菌服:41，服：19,服：2血清 型的試劑盒。
[0007] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明通過對決定菌株血清型的芙膜多糖（polysaccharide capsule,簡稱CP巧合成相關基因簇的特異核巧酸序列的檢測確定彎曲菌的血清型特征。 對服:41，服：19,服：2S種血清型空腸彎曲菌分別找出其共同的CPS合成基因簇相關DNA 序列，W及區(qū)別于其它血清型的特異DNA序列，在NCBI上進行BLAST比對，確定篩選出運些 序列針對上述S種血清型菌株的共同性W及特異性。通過比對，獲得服:41，服：19,服：2S 種血清型菌株共有而其它血清型菌株中不存在的=段特異序列：服:41血清型菌株特異性 序列命名為SE-服41-3,服：19血清型菌株特異序列命名為SE-服19-1，服：2血清型菌株特 異序列命名為SE-HS2-4,具體核巧酸序列分別如SEQIDNO. 7-9所示。
[0008]VectorNTISuite6比對已測序服：41，服：19,服：2的(PS相關基因的特異序列 一的保守性。并用primerpremier5設計引物，引物設計避開序列的突變點，同時要考慮 所設計的=對引物之間W及引物與祀序列之間不錯配，不出現(xiàn)二級結構，并且=對引物擴 增的目的片段的長度具有區(qū)別度，大小不能太接近。
[0009] 經(jīng)過反復驗證對比，最終確定用于檢測空腸彎曲菌=種血清型的特異性引物對組 合，分別為：
[0010] 用于檢測血清型服:41的特異性引物對，其上、下游引物核巧酸序列分別如SEQID NO. 1、2 所示；
[0011] 用于檢測血清型服:19的特異性引物對，其上、下游引物核巧酸序列分別如SEQID NO. 3、4 所示；
[0012] 用于檢測血清型服:2的特異性引物對，其上、下游引物核巧酸序列分別如SEQID NO. 5、6 所示。
[001引進一步地，本發(fā)明提供了核巧酸序列如SEQIDNO. 1-2所示的引物對在制備檢測 空腸彎曲菌血清型HS: 41試劑盒或診斷試劑中的應用。
[0014] 本發(fā)明提供了核巧酸序列如SEQIDNO. 3-4所示的引物對在制備檢測空腸彎曲菌 血清型服：19試劑盒或診斷試劑中的應用。
[001引本發(fā)明提供了核巧酸序列如SEQIDNO. 5-6所示的引物對在制備檢測空腸彎曲菌 血清型服:2試劑盒或診斷試劑中的應用。
[0016] 在本發(fā)明的實施例中，使用序列如SEQIDNO. 1-2所示的引物對空腸彎曲菌血清 型服:41 采用PCR方法檢測，反應條件為：94°CSmin;94°C30s，55°C30s，72°CImin,共 30 個循環(huán)；72°ClOmin，將擴增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳，若目的條帶為328bp，則說明待測菌為 空腸彎曲菌血清型服:41。
[0017] 在本發(fā)明的實施例中，使用序列如SEQIDNO. 3-4所示的引物對空腸彎曲菌血清 型服：19 采用PCR方法檢測，反應條件為：94°C5min;94°C30s，55°C30s，72°CImin,共 30 個循環(huán)；72°ClOmin，將擴增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳，若目的條帶為649bp，則說明待測菌為 空腸彎曲菌血清型服：19。
[0018] 在本發(fā)明的實施例中，使用序列如SEQIDNO. 5-6所示的引物對空腸彎曲菌血清 型服:2采用PCR方法檢測，反應條件為：94°C5min;94°C30s，55°C30s，72°CImin,共30個 循環(huán)；72°ClOmin，將擴增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳，若目的條帶為78化p，則說明待測菌為空 腸彎曲菌血清型服:2。
[0019] 進一步地，本發(fā)明提供了核巧酸序列如SEQIDNO. 7所述的祀序列在檢測空腸彎 曲菌血清型服:41中的用途W(wǎng)及該祀序列在制備檢測空腸彎曲菌血清型服:41的試劑盒或 試劑中的用途。
[0020]SEQIDNO. 7編碼的蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO. 10所示。
[002。 進一步地，本發(fā)明提供了核巧酸序列如SEQIDNO. 8所述的祀序列在檢測空腸彎 曲菌血清型服：19中的用途W(wǎng)及該祀序列在制備檢測空腸彎曲菌血清型服：19的試劑盒或 試劑中的用途。
[002引SEQIDNO. 7編碼的蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO. 11所示。
[002引進一步地，本發(fā)明提供了核巧酸序列如SEQIDNO. 9所述的祀序列在檢測空腸彎 曲菌血清型服:2中的用途W(wǎng)及該祀序列在制備檢測空腸彎曲菌血清型服:2的試劑盒或試 劑中的用途。
[0024]SEQIDNO. 7編碼的蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO. 12所示。
[00巧]本發(fā)明提供了含有上述3對特異性引物對的組合在制備檢測空腸彎曲菌血清型 試劑盒中的應用。
[0026] 本發(fā)明提供了含有上述特異性引物對組合的試劑盒。
[0027] 本發(fā)明的試劑盒是W上述針對3種血清型的特異性引物對組合為引物，W待測 菌DNA為模板，進行PCR，將擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，若電泳結果顯示目的條帶為 328bp，則待測菌為空腸彎曲菌血清型服:41;若電泳結果顯示目的條帶為649bp，則待測菌 為空腸彎曲菌血清型服：19 ;若電泳結果顯示目的條帶為78化P，則待測菌為空腸彎曲菌血 清型服:2。
[002引優(yōu)選地，本發(fā)明試劑盒的25y1PCR反應體系為，EasySuperMix12. 5y1，d地20 8. 5y1，3對特異性引物對的上、下游引物均為0. 5y1，濃度均為10yM，DNA模板1y1。
[0029] 優(yōu)選地，本發(fā)明試劑盒的PCR的反應程序為：
[0030] 94°C預變性5min;
[0031]94°C變性Imin，60°C退火Imin，72°CImin，30 個循環(huán)；
[0032] 72°C7min;4°C保持。
[0033] 本發(fā)明提供了一種非診斷目的的檢測空腸彎曲菌S種血清型的方法，所述S種血 清型為服:41、服：19和服:2,同時使用3對特異性引物，通過一次PCR反應，對待測菌DNA 進行檢測，若將擴增產(chǎn)物大小為328bp，則待測菌為空腸彎曲菌血清型服:41;若擴增產(chǎn)物 大小為649bp，則待測菌為空腸彎曲菌血清型服：19 ;若擴增產(chǎn)物大小為78化P，則待測菌為 空腸彎曲菌血清型服:2;
[0034] 所述3對特異性引物分別為：
[0035] 用于檢測血清型服:41的特異性引物對，其上、下游引物核巧酸序列分別如SEQ ID NO. 1、2所示；
[0036] 用于檢測血清型服:19的特異性引物對，其上、下游引物核巧酸序列分別如SEQID NO. 3、4 所示；
[0037] 用于檢測血清型服:2的特異性引物對，其上、下游引物核巧酸序列分別如SEQID NO. 5、6 所示。
[0038] 本法提供的非診斷目的的檢測空腸彎曲菌S種血清型的方法中PCR反應的反應 程序為：94°C預變性5min;
[0039] 94°C變性Imin，60°C退火Imin，72°CImin，30 個循環(huán)；
[0040] 72°C7min;4°C保持。
[0041] 本發(fā)明還提供了用于檢測空腸彎曲菌=種血清型的特異性祀序列組合，分別是： 檢測血清型服:41的特異性祀序列，其核巧酸序列如SEQIDNO. 7所示；檢測血清型服：19 的特異性祀序列，其核巧酸序列如SEQIDNO. 8所示；檢測血清型服:2的特異性祀序