Eb病毒編碼的eber-1的應(yīng)用方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于腫瘤分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種用于檢測(cè)鼻咽癌石蠟包埋樣品中 邸病毒編碼的小RNA-UEBER-1)表達(dá)水平與鼻咽癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移關(guān)系的原位雜交探針、檢測(cè) 試劑盒及其應(yīng)用方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 鼻咽癌（化SO地aryngealCarcinoma,NPC)是我國(guó)南方地區(qū)常見(jiàn)的頭頸部惡性腫 瘤，由于發(fā)病部位隱蔽，難于早期發(fā)現(xiàn)，且極易發(fā)生轉(zhuǎn)移，初診患者頸部淋己結(jié)轉(zhuǎn)移率高達(dá) 80 %。放射治療是目前鼻咽癌臨床上最常用的治療手段，60~70 %的患者能取得較好的療 效，但仍有20~30%的患者會(huì)出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是臨床上導(dǎo)致鼻咽癌患者死亡 的主要因素之一，且放化療對(duì)治療鼻咽癌的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移效果不理想，因此，篩選新的鼻咽癌 早期診斷及預(yù)后判斷的分子標(biāo)記物，對(duì)于鼻咽癌的臨床治療有著重要的指導(dǎo)意義，同時(shí)相 比較傳統(tǒng)的放化療手段，生物治療的方法更適合復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移鼻咽癌的治療，其中基因療法 對(duì)防治鼻咽癌的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移具有更重要而廣闊的臨床應(yīng)用前景，篩選鼻咽癌基因治療的祀 點(diǎn)也同樣意義重大。
[0003] 鼻咽癌的發(fā)病與邸病毒巧PSteinBarrvirus,邸V)感染密切相關(guān)。邸病毒是一 種普遍存在的人類瘤疹病毒，可W感染全球95%左右的成人人口，除偶爾有一小部分人也 會(huì)引起傳染性的單核細(xì)胞增多癥外，大部分被感染者不會(huì)出現(xiàn)任何的臨床癥狀，絕大多數(shù) 情況下邸病毒可W在宿主體內(nèi)長(zhǎng)期潛伏感染。然而，在某些情況下潛伏感染的邸病毒會(huì) 導(dǎo)致惡性腫瘤的發(fā)生，包括B細(xì)胞來(lái)源的伯基特和何杰金氏淋己瘤，W及上皮細(xì)胞來(lái)源鼻 咽癌和胃癌等。邸病毒導(dǎo)致惡性腫瘤發(fā)生的機(jī)制目前尚未完全明了，可能與邸病毒本身 編碼一系列基因的表達(dá)有關(guān)，如邸病毒編碼的潛伏膜蛋白ULatentMembraneProteinl, LMPl)作為一種致瘤蛋白，能激活許多宿主細(xì)胞內(nèi)癌基因的表達(dá)，抑制抑瘤基因的結(jié)構(gòu)和功 能。
[0004] EBV作為雙鏈DNA病毒其基因組大小約為170化，除了可轉(zhuǎn)錄一系列蛋白編碼基 因，最近發(fā)現(xiàn)邸病毒還可編碼一些小RNA分子（長(zhǎng)度<200nt)，包括微小RNAOnicroRNA，長(zhǎng) 度為19-2化t)。目前已發(fā)現(xiàn)EBV可編碼25個(gè)miRNAs前體，加工成44個(gè)成熟的miRNAs， 且EBV編碼的miRNAs在EBV基因組上成簇分布，可W分為BART和BHRFl兩組。而邸病 毒編碼的小RNA則主要有邸病毒編碼的小RNA-I巧pstein-Barrvirusencodedsmall RNA1,E邸R-1)和邸病毒編碼的小RNA-2 巧pstein-BarrvirusencodedsmallRNA 2,EBER-2)。迄今為止有關(guān)邸ER-I與鼻咽癌病人的輔助診斷或者療效預(yù)測(cè)等方面均沒(méi)有文 獻(xiàn)報(bào)道。我們通過(guò)研究表明，EBER-I在鼻咽癌組織中的表達(dá)顯著升高，但高表達(dá)邸ER-I的 鼻咽癌患者比低表達(dá)邸ER-I的鼻咽癌患者不容易發(fā)生復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，預(yù)后要好，因此，針對(duì) E邸R-I設(shè)計(jì)專用原位雜交探針及檢測(cè)試劑盒，用于檢測(cè)鼻咽癌組織中邸ER-I的表達(dá)水平 有望為臨床上對(duì)鼻咽癌進(jìn)行輔助診斷復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的預(yù)測(cè)提供參考。

【發(fā)明內(nèi)容】

[00化]本發(fā)明的目的在于提供一種邸病毒編碼的小RNA-UEBER-1)的原位雜交探針、試 劑及其應(yīng)用方法，利用邸ER-I的序列可W制備用于鼻咽癌輔助診斷復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的預(yù)測(cè)制 劑，并提供一種性價(jià)比高、易于推廣應(yīng)用的邸ER-I的檢測(cè)試劑盒。
[0006] 邸病毒編碼的邸ER-I的應(yīng)用方法，所述的邸ER-I用于制備鼻咽癌輔助診斷復(fù)發(fā) 和轉(zhuǎn)移的預(yù)測(cè)制劑；在鼻咽癌組織中檢測(cè)到邸ER-I的表達(dá)水平與鼻咽癌患者的臨床分期， 腫瘤大小和淋己結(jié)轉(zhuǎn)移均呈負(fù)相關(guān)關(guān)系；E邸R-I的序列：aggaccuacg州gcccuagagguuuugc U曰邑邑邑曰邑邑曰邑曰C邑U邑U邑U邑邑CU邑U曰邑CC曰CCC邑UCCC邑邑邑U曰C曰曰邑UCCC邑邑邑U邑邑U邑曰邑邑曰C邑邑U邑UCU邑U邑邑UU邑UCUUCCC3g3CUCUgCUUUCUgCCgUCUUCggUC33gimCC3gCUggUggUCCgC3UgUUUU〇(SEQNO. 1)
[0007] 所述的鼻咽癌輔助診斷復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的預(yù)測(cè)制劑為原位雜交檢測(cè)制劑。
[0008] 所述的鼻咽癌輔助診斷復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的預(yù)測(cè)制劑中包括檢測(cè)邸ER-I的原位雜交探 針，序列為：AGACACCGTCCTCACCACCCGGGACTTGTA(SEQNO. 2)。
[0009] 所述的原位雜交檢測(cè)試劑為試劑盒。
[0010] 試劑盒中包括：檢測(cè)邸ER-I的原位雜交探針，序列為： W11]AGACACCGTCCTCACCACCCGGGACTTGTA;檢測(cè)內(nèi)參基因GAPDH的原位雜交探針，序列 為：CAGUAGAGGCAGGGAUGAUGUUCU(SEQNO. 3)。
[0012] 試劑盒中還含有：地高辛寡核巧酸加尾試劑、抗地高辛-辣根過(guò)氧化物酶復(fù)合物 檢測(cè)試劑、DAB染色試劑； 陽(yáng)01引其它常規(guī)生物化學(xué)試劑，包括20x巧樣酸鋼緩沖溶液（salinesodium citrate,SSC)，硫酸葡聚糖值extransulphate),去離子甲酯胺值eionizedF'ormamide)， 多聚腺巧酸（polyadenylicacid，PolyA),多聚脫氧腺巧酸（polydeo巧aden}dicacid, 化IydA)，變性剪切的蛙精DNA(denaturedandshearedsalmonspermDM,ssDNA)， 酵母轉(zhuǎn)運(yùn)RNA(yeastt-RNA，tRNA)，二硫蘇糖醇值TT)，50x鄧罕氏緩沖液值enhar化s's solution)，憐酸緩沖液（PBSbuffer)，胃蛋白酶K，牛血清白蛋白度SA)，S乙醇胺 (TEA)，醋酸酢，阻斷試劑度lockingreagentagent)，TNB緩沖液（即：pH7. 5 的 0.IM Tris-Cl+0. 15M化C1+0. 5 % 阻斷試劑），TNT緩沖液（即：pH7. 5 的 0.IMTris-Cl+0. 15M 化C1+0. 05%Tween20)。
[0014] 我們通過(guò)原位雜交在存檔的鼻咽癌石蠟組織標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)邸ER-I的表達(dá)與鼻咽癌 患者的預(yù)后密切相關(guān)，在鼻咽癌組織中檢測(cè)到邸ER-I的表達(dá)水平與鼻咽癌患者的臨床分 期，腫瘤大小和淋己結(jié)轉(zhuǎn)移均呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。即越是晚期鼻咽癌患者，鼻咽癌瘤體越大，淋 己結(jié)轉(zhuǎn)移越嚴(yán)重，EBER-I的表達(dá)水平反而下降。提示邸ER-I可作為鼻咽癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移預(yù) 測(cè)的分子標(biāo)志。本發(fā)明為肺癌的輔助診斷和預(yù)后預(yù)測(cè)提供了強(qiáng)有力的分子生物學(xué)工具，具 有深遠(yuǎn)的臨床意義和重要的推廣應(yīng)用前景。
【附圖說(shuō)明】
[0015] 圖1為原位雜交檢測(cè)邸ER-I在鼻咽癌及正常鼻咽上皮中的表達(dá)情況；
[0016] 在130例正常鼻咽上皮（NP巧樣品中，115例（88. 5% )基本檢測(cè)不到邸ER-I的表 達(dá)（negative,圖1A)，僅在15例（11.5% )中有邸ER-I低表達(dá)；而在301例鼻咽癌（NPC) 中僅87例（28. 9% )檢測(cè)不到邸ER-I的表達(dá)（圖1B)，而在214例中檢測(cè)到有邸ER-I的 表達(dá)（71. 1% )，其中165例為低表達(dá)（圖1C)，而在49例（16. 3% )中為高表達(dá)（圖ID); 圖IE為統(tǒng)計(jì)結(jié)果，P<0. 001。
[0017] 圖2為邸ER-I的表達(dá)水平可用于鼻咽癌的輔助診斷；
[0018]利用受試者工作特征曲線（receiveroperatingcharacteristiccurve,R0C)分 析發(fā)現(xiàn)邸ER-I的表達(dá)水平可W較好地用于區(qū)分鼻咽癌和非鼻咽癌患者。曲線下面積（area underthecurve,AUC)為 0.815 (95%置信區(qū)間：0.776-0. 854,P<0. 001)，靈敏度和特異性 分別為72. 5%和83. 5%。
[0019] 圖3為邸ER-I的表達(dá)水平與鼻咽癌患者臨床參數(shù)相關(guān)性；
[0020] 在鼻咽癌組織中檢測(cè)到邸ER-I的表達(dá)水平與鼻咽癌患者的臨床分期（圖3A，I~ IV分別為臨床I、II、III、IV期），腫瘤大?。▓D3B，Tl~T4)和淋己結(jié)轉(zhuǎn)移（圖3C，NO為 無(wú)淋己轉(zhuǎn)移，Nl~N3淋己結(jié)轉(zhuǎn)移程度逐漸增加）均呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。即越是晚期鼻咽癌患 者，鼻咽癌瘤體越大，淋己結(jié)轉(zhuǎn)移越嚴(yán)重，EBER-I的表達(dá)水平反而下降。
[0021] 圖4為鼻咽癌中邸ER-I的表達(dá)與鼻咽癌患者預(yù)后的關(guān)系
[0022] 鼻咽癌中邸ER-I的表達(dá)與鼻咽癌患者的預(yù)后密切相關(guān)，E邸R-I高表達(dá)（化曲）的 患者生存時(shí)間要明顯長(zhǎng)于邸ER-I低表達(dá)化OW)或者不表達(dá)（negative)的患者。
【具體實(shí)施方式】
[0023]W下結(jié)合【具體實(shí)施方式】進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明。
[0024] 實(shí)施例1，原位雜交檢測(cè)邸ER-I在正常鼻咽上皮和鼻咽癌中的表達(dá)情況 W25] 1.材料方法
[00%] 1. 1設(shè)計(jì)并合成雜交探針
[0027] 為了采用原位雜交方法檢測(cè)邸邸-1的表達(dá)情況，