專利名稱：一種用于檢測(cè)空腸彎曲菌特異性抗原的快速檢測(cè)試紙條的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物檢測(cè)領(lǐng)域，涉及空腸彎曲菌外膜蛋白PEB1基因 工程抗原的制備及其單克隆抗體的研制，和含有該單克隆抗體的空腸 彎曲菌膠體金快速檢測(cè)試紙條及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
空腸彎曲菌病是由空腸彎曲菌(Cjejuni)引起的感染性疾病。空腸 彎曲菌引起的腸炎是世界性疾病，在經(jīng)濟(jì)發(fā)達(dá)國(guó)家，是主要的食源性 感染性疾病，空腸彎曲菌感染引起的腹瀉在細(xì)菌性腹瀉病中位居榜 首。在發(fā)展中國(guó)家，腹瀉病發(fā)病率較高，空腸彎曲菌引起的腹瀉僅次 于大腸桿菌和志賀菌?？漳c彎曲菌的感染多為散發(fā)，較少有暴發(fā)，是 夏秋季腹瀉的主要病原，尤其學(xué)齡前兒童發(fā)病率較高，其傳染源主要 來(lái)自于污染的水和食物。最新研究證實(shí)空腸彎曲菌感染與格林-巴利 綜合征(Guillain-Barre Syndrome, GBS)相關(guān)。空腸彎曲菌病是典型的 人畜共患疾病。 臨床癥狀
空腸彎曲菌感染后，臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣。但主要癥狀為腹瀉性腸 炎。同時(shí)也有無(wú)癥狀攜帶和極少數(shù)因菌血癥而引起的腸道外感染。 腸炎以輕、中型多見，多數(shù)可自愈。嬰幼兒彎曲菌腸炎多不典型，
表現(xiàn)為全身癥狀輕微，精神和外表若似無(wú)??；多數(shù)無(wú)發(fā)熱和腹痛；僅 有間斷性輕度腹瀉，間有血便，持續(xù)較久；若合并其他腸道致病菌感 染，往往中毒癥狀較重、起病急。有中度發(fā)熱或高熱，大便多為膿血 便，6個(gè)月以下、特別是新生兒發(fā)病率最高。臨床難與菌痢等區(qū)別， 應(yīng)提高警惕。腸道外感染多見于老齡患者或免疫功能低下者。孕婦感 染者常見上呼吸道癥狀、肺炎及菌血癥。可引起早產(chǎn)、死胎或新生兒
敗血癥及新生兒腦膜炎?？漳c彎曲菌感染目前被廣泛認(rèn)為是GBS的前 驅(qū)感染，GBS是目前空腸彎曲菌感染引起的主要致死因素。 臨床診斷
目前主要根據(jù)病史與流行特點(diǎn)相結(jié)合。常有不潔食物史、喝生水 及旅游史，臨床癥狀主要為發(fā)熱、腹痛、腹瀉、發(fā)熱多為38°C左右， 或無(wú)熱；腹痛為臍周及全腹痙攣性疼痛，多伴里急后重；腹瀉次數(shù)一 般不多，且可間歇性血便。確診主要依據(jù)實(shí)驗(yàn)室的病原分離培養(yǎng)或血 清學(xué)檢測(cè)結(jié)果。
血清學(xué)檢查
血清學(xué)檢查通常作為空腸彎曲菌感染的流行病學(xué)調(diào)查。發(fā)病一周 后，血清內(nèi)可出現(xiàn)抗體，主要為lgM ，可用間接血凝試驗(yàn)及間接免 疫熒光試驗(yàn)，Western Blot等檢測(cè)特異性抗體及抗體效價(jià)，正常人 或帶菌者血清效價(jià)可達(dá)1:2 ~ 1:8，急性期病人抗體效價(jià)可達(dá)1 : 8~ 1 : 32 ，恢復(fù)期可達(dá)1:80- 1:320以上。由于血清抗體效價(jià)不高， 須釆取雙份血清檢測(cè)，以效價(jià)增高4倍作為診斷依據(jù)?？漳c彎曲菌 感染后血清中IgM, IgG， IgA水平升高。IgA在感染后血清及糞便 中含量升高數(shù)周后迅速下降，對(duì)于臨床診斷意義有限，但對(duì)于幫助確 定空腸彎曲菌的感染與GBS及關(guān)節(jié)炎的關(guān)系卻有重要意義。
病原的分離培養(yǎng)
菌株的分離培養(yǎng)是空腸彎曲菌感染診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。
其它方法目前已有多種基于免疫和基因的診斷產(chǎn)品應(yīng)用于彎曲菌 屬的診斷。包括基于酶聯(lián)免疫吸附原理和應(yīng)用PCR的方法直接從糞 便樣品中檢測(cè)病原的試劑盒。
大量研究表明空腸彎曲菌外膜蛋白PEB1基因序列相對(duì)保守，在 不同的血清型空腸彎曲菌中均有表達(dá)，是一種有效的保護(hù)性抗原。 PEB1由; A"基因編碼，/7&"含有780bp，其中前26個(gè)氨基酸為信號(hào) 肽，成熟蛋白分子量為25.5kD 。因此屬于各種空腸彎曲菌的共同抗
原，可作為空腸彎曲菌的檢測(cè)抗原，用于檢測(cè)診斷。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是利用各種空腸彎曲菌的共同抗原PEB1蛋白，研
制特異性的單克隆抗體；并利用該抗原的單克隆抗體，研制一種可以 快速，準(zhǔn)確檢驗(yàn)布氏桿菌的空腸彎曲菌膠體金快速檢測(cè)試紙。 本發(fā)明的另一目的在于提供上述試紙條的制備方法。 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明首先利用基因工程技術(shù)，克隆并高效表
達(dá)空腸彎曲菌共同抗原PEB1蛋白，并通過(guò)免疫學(xué)技術(shù)對(duì)其免疫原性 及特異性進(jìn)行檢定。然后，利用PEB1研制了空腸彎曲菌特異性的配 對(duì)單克隆抗體。實(shí)驗(yàn)表明，通過(guò)基因工程抗原制備的單克隆抗體，其 具有良好的特異性和靈敏度。
進(jìn)而，本發(fā)明提供一種試紙條，其包括反應(yīng)膜和結(jié)合物釋放墊， 所述反應(yīng)膜具有包被抗空腸彎曲菌外膜蛋白PEB1單克隆抗體或多克 隆抗體的檢測(cè)帶和包被二抗IgG的質(zhì)控帶；所述結(jié)合物釋放墊包被膠 體金標(biāo)記的與反應(yīng)膜上不同亞型的抗空腸彎曲菌外膜蛋白PEB1單克
隆抗體。
其中，反應(yīng)膜可為硝酸纖維膜，結(jié)合物釋放墊可為玻璃纖維膜。 其中，二抗IgG為抗鼠IgG抗體。
本發(fā)明還提供 一種制備上述檢測(cè)試紙條的方法，其包括如下步
驟
1) 按照上述方法制備單克隆抗體，或制備多克隆抗體；
2) 將步驟1)制備的單克隆抗體或多克隆抗體以及二抗IgG在 反應(yīng)膜上分別形成檢測(cè)帶和質(zhì)控帶，備用；
3) 用膠體金標(biāo)記步驟1)制備的單克隆抗體，包被到結(jié)合物釋 放墊中，其中膠體金標(biāo)記的單克隆抗體與步驟2)中包被在檢測(cè)帶中 的單克隆抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)不同；
4) 將制備好的反應(yīng)膜以及結(jié)合物釋放墊與樣本墊、吸水墊和反應(yīng)支持物組裝成試紙條。
本發(fā)明空腸彎曲菌抗原快速檢測(cè)試紙(膠體金法)具有以下優(yōu)點(diǎn):
1) 檢測(cè)快速IO分鐘出結(jié)果；
2) 特異性僅對(duì)空腸彎曲菌呈陽(yáng)性，而對(duì)其他的致病菌如霍 亂霍菌、傷寒沙門氏菌、大腸桿菌、痢疾等呈陰性結(jié)果；
3) 敏感性對(duì)空腸彎曲菌外膜蛋白PEB1檢出可達(dá)lng的水
平；
4) 保存和運(yùn)輸方便，在室溫下可保存18個(gè)月；
5) 便于臨床和家居使用，而且具有產(chǎn)業(yè)性。


圖1:A本發(fā)明試紙條的正面示意圖；B本發(fā)明試紙條的側(cè)面 示意圖。其中，1:吸水墊；2:硝酸纖維膜(T:空腸彎曲菌的單克 隆抗體或抗空腸彎曲菌的多克隆抗體的條帶；C:包被抗鼠IgG的質(zhì) 控條帶);3:含有膠體金標(biāo)記空腸彎曲菌的單克隆抗體的玻璃纖維膜; 4:金標(biāo)抗體保護(hù)膜；5:反應(yīng)支持物。
圖2:檢測(cè)結(jié)果示意圖。其中，從左至右依次為T、 C兩條線 陽(yáng)性；C一條線陰性；T、 C兩條線陰性，無(wú)效。
具體實(shí)施例方式
以下實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的 限制。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或 條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。
若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟 知的常規(guī)手段。
實(shí)施例1:空腸彎曲菌外膜蛋白PEB1基因工程抗原的制備
CJ基因組DNA的提取
取空腸彎曲菌培養(yǎng)物lml，離心收集細(xì)胞，然后懸浮于200ulTE
液中，用基因組DNA抽提試劑盒提取DNA。 peblA基因的擴(kuò)增
根據(jù)Genbank(編號(hào)AL139076)報(bào)道的； e6"完整CDS，去掉氨 基端的信號(hào)肽設(shè)計(jì)一對(duì)引物，選擇萬(wàn)"m/H和^oI作為酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì) 如下引物
上游為5隱GCGGATCCGCAGA AGGTAAACTTGAGTCTAT-3 ， 下游為5-CCGCTCGAGTTATAAACCCCATTTTTTCGCT-3 。 PCR擴(kuò)增peblA基因。擴(kuò)增條件為94"變性4min,然后94'C變 性30s， 53。C退火45s， 72。C延伸1 min,最后l個(gè)循環(huán)結(jié)束后再以 72'C延伸8min,共30個(gè)循環(huán)。所獲PCR產(chǎn)物進(jìn)行l(wèi). 5%瓊脂糖凝 膠電泳鑒定，并用DNAExtractionKit試劑盒回收純化PCR產(chǎn)物。 質(zhì)粒pET28a(+)-peblA的構(gòu)建
將純化的PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒pE128a(+)用Bam//1和lol進(jìn)行雙酶 切后。用DNA Extraction Kit試劑盒進(jìn)行純化，將酶切純化的目的基 因和質(zhì)粒pET28a(+)按3: l(摩爾數(shù))比例在22。C條件下連接2-4 h;然 后轉(zhuǎn)化已制備的E coli J1V1109感受態(tài)細(xì)胞，用含卡那霉素30ng/ml LB 平板篩選重組質(zhì)粒。
重組質(zhì)粒pET28a(+)-peblA的鑒定重組質(zhì)粒用Baw//1和lol進(jìn) 行雙酶切鑒定，同時(shí)提取重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序鑒定。
重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)及表達(dá)水平的鑒定
將重組質(zhì)粒pET28a(+)-peblA轉(zhuǎn)化￡ co// BL21(DE3)中，用含卡
那霉素的LB培養(yǎng)基篩選表達(dá)菌并增菌。取過(guò)夜培養(yǎng)菌重新培養(yǎng)于 37°。至A6oo=0.6時(shí)，用終濃度為1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)6 h，分別于誘導(dǎo)后1口23 4、 6h釆集菌體。將菌體重懸于lx蛋白電泳上樣 bufer混勻后煮沸5 min,用5%的濃縮膠和12%的分離膠進(jìn)行 SDS-PAGE電泳。以考馬斯亮藍(lán)R-250染液染色和脫色液充分脫色后觀察蛋白條帶。用凝膠圖像分析系統(tǒng)分析其表達(dá)量。
重組蛋白表達(dá)形式分析及其純化
收集10 ml誘導(dǎo)培養(yǎng)4 h細(xì)菌菌體沉淀，加入1 ml超聲破碎液(50 mmol/LNaH2P04, 300mmol/LNaCl， pH8)重懸菌體，在冰洛中超 聲破碎細(xì)菌10min。于4。C 12000 rpm離心10min，分別收集上清和 沉淀，用SDS-PAGE分析重組蛋白表達(dá)形式。同時(shí)取超聲碎菌后的 上清液，用HIS-融合蛋白純化試劑盒(B-PER細(xì)菌HIS標(biāo)簽融合蛋 白柱式純化Kit貨號(hào)78100賽默飛世爾科技)，按試劑盒推薦步驟 和體系進(jìn)行純化，純化產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE電泳以判斷純化效果， 通過(guò)紫外薄層測(cè)得產(chǎn)率在95%以上。
rPEBl免疫原性的鑒定 以兔抗CJ全菌抗體為一抗；HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG為二抗， 用Western bolt檢測(cè)rPEBl的免疫反應(yīng)性。結(jié)果表明，重組蛋白Pebl 具有良好的免疫原性，其兔血清的ELISA效價(jià)達(dá)1: 50000。
實(shí)施例2:抗空腸彎曲菌外膜蛋白PEB1單克隆抗體的制備
(1 )免疫小鼠
制備的基因工程抗原從-20低溫冰箱取出溶解后，給BALB/C小鼠 背部皮下注射(0.2ml/只)，間隔10天。融合前3日，在小鼠腹腔以抗 原0.15ml進(jìn)行攻擊。免疫效果用ELISA法進(jìn)行檢測(cè)。
(2) 骨髓瘤細(xì)胞
SP2/0骨髓瘤細(xì)胞將存儲(chǔ)在液氮罐中的SP2/0細(xì)胞復(fù)蘇，在含有 10。/。小牛血清DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)48-72小時(shí)，待細(xì)胞生長(zhǎng)良好，細(xì) 胞渾圓、透亮、大小均一、排列整齊、呈對(duì)數(shù)分裂，準(zhǔn)備融合。
(3) 細(xì)胞融合
制備好的SP2/0細(xì)胞和免疫的BALB/C小鼠的脾淋巴細(xì)胞分別配 制成2 x 10々ml和l x 108/ml。各取lml室溫下混合。用0.8ml， 50。/。的PEG (分子量1500)作為融合劑；培養(yǎng)液用10。/。小牛血清DMEM。
(4) 陽(yáng)性孔的檢測(cè)和篩選
ELISA法檢測(cè)。包被空腸彎曲菌粗制抗原和PEB1蛋白抗原兩種 酶標(biāo)板。對(duì)融合細(xì)胞的培養(yǎng)上清液進(jìn)行檢測(cè)，選擇ELISA效價(jià)OD值 大于1.0的陽(yáng)性孔進(jìn)行亞克隆。共檢出陽(yáng)性克隆16株，選擇ll株進(jìn)行 亞克隆操作。
(5)單抗細(xì)胞株的亞克隆用有限稀釋法對(duì)陽(yáng)性克隆細(xì)胞株進(jìn) 行克隆化篩選。對(duì)篩選的的陽(yáng)性克隆經(jīng)過(guò)凍存、復(fù)蘇、傳代等過(guò)程， 最終獲得5株可穩(wěn)定分泌特異性抗空腸彎曲菌外膜蛋白PEB1的單克 隆抗體細(xì)胞株。 (6)單克隆抗體細(xì)胞株檢定
細(xì)胞株核型分析對(duì)上述雜交瘤細(xì)胞染色體進(jìn)行檢測(cè)為106條； 證明他們是SP2/0骨髓瘤與小鼠細(xì)胞的雜交瘤細(xì)胞。
細(xì)胞株穩(wěn)定性對(duì)5株產(chǎn)生空腸彎曲菌外膜蛋白PEB1單克隆抗 體的雜交瘤細(xì)胞株經(jīng)連續(xù)克隆化檢測(cè)單克隆抗體陽(yáng)性率100%，在體 外傳代5個(gè)月，并經(jīng)反復(fù)凍存復(fù)蘇均能達(dá)到保持穩(wěn)定的分泌抗體。
實(shí)施例3:抗空腸彎曲菌外膜蛋白PEB1單克隆抗體的檢定
(1) 單抗腹水制備
小鼠SPF級(jí)小鼠，經(jīng)檢查無(wú)鼠源病毒污染，在腹水生產(chǎn)過(guò)程 中如發(fā)現(xiàn)動(dòng)物不健康、咬傷、感染者應(yīng)棄掉。
細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)取生產(chǎn)批細(xì)胞管l支復(fù)蘇，加營(yíng)養(yǎng)液擴(kuò)大培養(yǎng)， l只生產(chǎn)細(xì)胞只用一次，不再凍存。
雜交瘤細(xì)胞株接種制備腹水均需在無(wú)菌條件下進(jìn)行，注射雜 交瘤細(xì)胞之前，每只小鼠腹腔注射液體石蠟0.5ml。 一周后每只小鼠 腹腔注射雜交瘤細(xì)胞l-3x106/0.21111。
腹水釆集注射細(xì)胞株7-10天，或小鼠瀕死前一次釆集腹水， 置-2(TC保存。
(2) 單克隆抗體的提純
采用硫酸銨沉淀法粗提，進(jìn)而用HiTraprProteinA柱純化，經(jīng)SDS-PAGE電泳檢定，僅顯示單一蛋白帶。用HIS-融合蛋白純化試劑 盒(B-PER細(xì)菌fflS標(biāo)簽融合蛋白柱式純化Kit貨號(hào)78100賽默飛 世爾科技)，按試劑盒推薦步驟和體系進(jìn)行純化，純化產(chǎn)物進(jìn)行 SDS-PAGE電泳以判斷純化效果，通過(guò)紫外薄層測(cè)得產(chǎn)率在95%以上。
(3) 抗體親合力測(cè)定釆用NaSCN競(jìng)爭(zhēng)ELISA實(shí)驗(yàn)，測(cè)定其ED50 的下降值，來(lái)間接反映其抗體親合力的大小。選擇其中親和力較好的 6株，進(jìn)行亞型檢定。
(4) 亞型檢定釆用免疫擴(kuò)散法對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)上清的單抗進(jìn)行Ig亞 類的檢測(cè)。上述5株單克隆抗體的Ig亞類分別是IIgGl有一株；IgG2a 有兩株；IgG2b有二株。
(5) 抗原位點(diǎn)檢定用相加ELISA法對(duì)6株單抗的抗原結(jié)合位點(diǎn)進(jìn) 行檢測(cè)。結(jié)果表明，這5株中有三種不同的抗原結(jié)合位點(diǎn)。
實(shí)施例4:空腸彎曲菌Pebl蛋白多克隆抗體制備
(1) 動(dòng)物免疫
選擇l-2kg的新西蘭白兔，用空腸彎曲菌Pebl蛋白于背部皮下多 點(diǎn)注射，免疫劑量為lmg/kg。共免疫4次。
(2) 免疫效價(jià)檢測(cè) 包被空腸彎曲菌Pebl蛋白酶標(biāo)板，每孔4pg。按間接ELISA法檢
測(cè)免疫血清的效價(jià)。血清效價(jià)達(dá)到l: 20000以上，可釆集血清。
(3) 抗體提純及檢定
釆用常規(guī)辛酸法提純。純度用非變性PAGE電泳檢定，顯示蛋白 一條帶?；钚葬娪肊LISA檢定，效價(jià)大于l: 20000。
實(shí)施例5:空腸彎曲菌抗原檢測(cè)試劑盒的研制
(1)膠體金-抗體結(jié)合物的制備
經(jīng)實(shí)驗(yàn)確定，以1A3作為金標(biāo)抗體，其最佳結(jié)合pH值為8.0,蛋 白配比為25iig/ml膠體金。標(biāo)記膠體金經(jīng)穩(wěn)定劑(0.5%BSA， pH8.0， O.OlMTris緩沖液)處理后，按每平方厘米65pl的量，取膠體金-抗體
結(jié)合物溶液，均勾吸附于玻璃纖維上，冷凍干燥，并在干燥環(huán)境中保 存。
(2) 包被抗體于硝酸纖維膜 將空腸彎曲菌外膜蛋白PEB1單克隆抗體(與膠體金標(biāo)記的單克
隆抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)不同)用0.01MPBS稀釋成l,2士0.1mg/ml。將 羊抗鼠IgG多克隆抗體用0.01MPBS稀釋成2士0.1mg/ml。用噴膜機(jī)將二 者以l^il/cm的速度噴于硝酸纖維膜上，分別形成檢測(cè)線和對(duì)照線。兩 條線之間的間隔為0.5cm。
把固定有抗體的硝酸纖維置37度烤箱中干燥2小時(shí)。干燥環(huán)境中 保存?zhèn)溆谩?br> (3) 空腸彎曲菌抗原檢測(cè)試劑盒組成
反應(yīng)支持物為6.5cm x 0.4cmPCV板；吸水墊為2cm x 0.4cm的濾 油紙；1.8cmx 0.4cm的硝酸纖維膜依次包被抗鼠IgG, 空腸彎曲菌 PEB1蛋白的單克隆抗體(步驟2)或抗空腸彎曲菌的多克隆抗體， 0.4cmx 0.4cm的含有膠體金標(biāo)記的空腸彎曲菌PEBl蛋白的單克隆抗 體玻璃纖維(步驟l );金標(biāo)抗體保護(hù)膜(樣品墊)為2.7cm x 0.4cm的 濾紙纖維；即形成了空腸彎曲菌抗原快速檢測(cè)試紙條(膠體金法)。
(4) 空腸彎曲菌抗原檢測(cè)試劑盒特異性及敏感度實(shí)驗(yàn) 使用步驟3的檢測(cè)試劑盒(檢測(cè)帶為單克隆抗體)進(jìn)行實(shí)驗(yàn) 特異性實(shí)驗(yàn)
空腸彎曲菌是一種人畜共患病，臨床上主要引起人腹瀉癥狀。因 此其特異性實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)以下陰性質(zhì)控品大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、 痢疾桿菌、Ol群霍亂弧菌、0139群霍亂弧菌、副溶血弧菌、正常糞 便、血便。檢測(cè)結(jié)果表明，本品與上述樣品無(wú)交叉反應(yīng)。
敏感度實(shí)驗(yàn)
用生理鹽水將空腸彎曲菌培成不同濃度表準(zhǔn)品，檢測(cè)結(jié)果表明， 本品最低檢出量為1 x 106菌/1111。
實(shí)施例6檢測(cè)方法(參見圖2)
將待檢糞便標(biāo)本用裂解液處理后，取約100- 150^1加入檢測(cè)條 的樣品墊(實(shí)施例4試紙條"4"處)上，樣品液沿膜向上爬行，10-15 分鐘判讀結(jié)果。
結(jié)果
如樣本中含有空腸彎曲菌抗原，則與試紙條上膠體金標(biāo)記的空腸 彎曲菌的單克隆抗體形成相應(yīng)的復(fù)合物，上行與包被在硝酸纖維膜上 的空腸彎曲菌的單克隆抗體或抗空腸彎曲菌的多克隆抗體，形成紅色 線條，即在T處形成紅色條帶，即為陽(yáng)性結(jié)果。
無(wú)論是否含有相對(duì)應(yīng)的抗原，膠體金標(biāo)記空腸彎曲菌的單克隆抗 體繼續(xù)向上爬行與包被在膜上的抗鼠IgG形成紅色沉淀線，即在"C" 處形成紅色條帶。此線是質(zhì)控線，如膠體金失效，此線就不會(huì)出現(xiàn)， 說(shuō)明試紙條失效。 序列表
<110>北京莊笛浩禾生物醫(yī)學(xué)科技有限公司
<120> —種用于檢測(cè)空腸彎曲菌特異性抗原的快速檢測(cè)試紙條
<130>
<160> 2
< 170> Patentln version 3.3
<210> 1
<211> 31
<212> DNA <213>人工序列
<400> 1
gcggatccgc agaaggtaaa cttgagtcta t
<210> 2
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ccgctcgagt tataaacccc attttttcgc t
權(quán)利要求
1、抗空腸彎曲菌外膜蛋白PEB1單克隆抗體，其特征在于，所述單克隆抗體的由PEB1基因工程抗原制備獲得。
2、 一種制備權(quán)利要求l所述單克隆抗體的方法，其包括步驟 將構(gòu)建表達(dá)PEB1基因的表達(dá)載體，將所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞， 誘導(dǎo)表達(dá)PEB1蛋白，經(jīng)純化后作為免疫原制備單克隆抗體。
3、 如權(quán)利要求2所述的方法，其還包括檢測(cè)制備的單克隆抗體 的抗原結(jié)合位點(diǎn)。
4、 含有權(quán)利要求l所述單克隆抗體的檢測(cè)試劑盒。
5、 一種檢測(cè)試紙條，包括反應(yīng)膜和結(jié)合物釋放墊，其特征在于， 所述反應(yīng)膜具有包被權(quán)利要求1所述單克隆抗體或PEB1多克隆抗體 的檢測(cè)帶和包被二抗IgG的質(zhì)控帶；所述結(jié)合物釋放墊包被膠體金標(biāo) 記的與反應(yīng)膜上不同抗原結(jié)合位點(diǎn)的PEB1單克隆抗體。
6、 如權(quán)利要求5所述的試紙條，其特征在于，所述反應(yīng)膜為硝 酸纖維素膜。
7、 如權(quán)利要求5所述的試紙條，其特征在于，所述的結(jié)合物釋放墊為玻璃纖維膜。
8、 如權(quán)利要求5 7任一項(xiàng)所述試紙條，其特征在于，所述的二 抗IgG為抗鼠IgG。
9、 一種制備權(quán)利要求5 8任一所述試紙條的方法，包括步驟1 )按照權(quán)利要求2或3所述方法制備單克隆抗體，或制備多克 隆抗體；2) 將步驟1)制備的單克隆抗體或多克隆抗體以及二抗IgG在 反應(yīng)膜上分別形成檢測(cè)帶和質(zhì)控帶，備用；3) 用膠體金標(biāo)記權(quán)利要求1制備的單克隆抗體，被包被到結(jié)合 物釋放墊中，其中膠體金標(biāo)記的單克隆抗體與步驟2)中包被在檢測(cè) 帶中的單克隆抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)不同； 4)將制備好的反應(yīng)膜以及結(jié)合物釋放墊與樣本墊、吸水墊和反 應(yīng)支持物組裝成試紙條。
10、權(quán)利要求5 8任一項(xiàng)所述的試紙條在檢測(cè)空腸彎曲菌中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用于檢測(cè)空腸彎曲菌特異性抗原的快速檢測(cè)試紙條，包括反應(yīng)膜和結(jié)合物釋放墊，所述反應(yīng)膜具有包被權(quán)利要求1所述單克隆抗體或PEB1多克隆抗體的檢測(cè)帶和包被二抗IgG的質(zhì)控帶；所述結(jié)合物釋放墊包被膠體金標(biāo)記的與反應(yīng)膜上不同抗原結(jié)合位點(diǎn)的PEB1單克隆抗體，應(yīng)用膜層析雙抗體夾心法，檢測(cè)標(biāo)本中空腸彎曲菌的特異性抗原。應(yīng)用本發(fā)明試紙條檢測(cè)，操作簡(jiǎn)單、方便、快速、簡(jiǎn)捷，不需特殊儀器設(shè)備，不需專業(yè)培訓(xùn)，結(jié)果清晰易辨，操作簡(jiǎn)單，易于推廣，適合基層，適合于突發(fā)事件的大批量現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，適合流行病學(xué)調(diào)查，對(duì)空腸彎曲菌的感染診斷起到輔助作用。
文檔編號(hào)C12N15/31GK101362801SQ20081011273
公開日2009年2月11日 申請(qǐng)日期2008年5月26日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月26日
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