專利名稱：一種根特異性啟動(dòng)子及其重組表達(dá)載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物基因工程領(lǐng)域，具體的說(shuō)，是涉及一種根特異性啟動(dòng)子及其重 組表達(dá)載體。
技術(shù)背景真核生物基因的表達(dá)受到轉(zhuǎn)錄前、轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后加工、轉(zhuǎn)運(yùn)、翻譯水平以 及蛋白活性的調(diào)控，其中轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控是基因表達(dá)中最基本的環(huán)節(jié)，啟動(dòng)子是基 因表達(dá)所必需的，決定了外源基因表達(dá)的空間、時(shí)間和表達(dá)的強(qiáng)度，是人們利用基 因工程和轉(zhuǎn)基因技術(shù)定向改造植物的重要限制因素。大多數(shù)真核生物基因組內(nèi)編碼序列只占其基因組DNA的1% — 10%，而非編 碼序列中很大一部分序列起到基因表達(dá)調(diào)控作用，啟動(dòng)子序列在非編碼序列中占有 很大的比例。按照啟動(dòng)子的作用方式可將其分為3類，即組成型啟動(dòng)子、誘導(dǎo)型啟 動(dòng)子和組織特異性啟動(dòng)子，其中，組織特異性啟動(dòng)子又稱為器官特異性啟動(dòng)子。當(dāng)前通過(guò)轉(zhuǎn)基因手段來(lái)獲得基因修飾生物(genomic modified organism, GM0)， 從而改變植物尤其是作物的生長(zhǎng)特性、果實(shí)品質(zhì)已經(jīng)成為現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的重要組成部 分。在轉(zhuǎn)基因植物中，最常用的啟動(dòng)子為組成型啟動(dòng)子，即利用CaMV 35S啟動(dòng)子 驅(qū)動(dòng)目的基因在各組織中高水平表達(dá)。某些情況下這對(duì)于植物的生長(zhǎng)發(fā)育可能會(huì)造 成一些不利的影響，不利于實(shí)現(xiàn)人們改造植物的目的。例如，利用CaMV 35S啟動(dòng) 子驅(qū)動(dòng)DREB1A基因轉(zhuǎn)化擬南芥植株后，轉(zhuǎn)基因植株的抗旱性、耐鹽性大大提高， 但是由于該基因的過(guò)度異位表達(dá)，使得正常狀況下的植株生長(zhǎng)嚴(yán)重受到抑制，表現(xiàn) 為植株矮化、葉片短小。組織特異性啟動(dòng)子可以驅(qū)動(dòng)目的基因在根、莖、葉、花甚至是氣孔特異表達(dá)。 根部是植物從土壤中吸收水分和營(yíng)養(yǎng)的主要器官，根特異性啟動(dòng)子可以驅(qū)動(dòng)其下游 的目的基因特異表達(dá)在根部。通過(guò)轉(zhuǎn)基因手段，可以將已經(jīng)分離的與K+吸收相關(guān)的 轉(zhuǎn)運(yùn)器特異地超表達(dá)于根部，將有效地提高施肥效率。目前已經(jīng)成功鑒定分離出多 種S、 P、 K轉(zhuǎn)運(yùn)器，如AKT1和SULTR等，利用根特異性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)這些基因在 根部表達(dá)，可以提高養(yǎng)分的生物利用率。同時(shí)，許多經(jīng)濟(jì)作物是以根作為儲(chǔ)藏器官， 如土豆，可以將與淀粉和糖類代謝相關(guān)的基因在根部特異的增強(qiáng)其表達(dá)水平，從而提高其利用價(jià)值。隨著功能基因組學(xué)研究的發(fā)展，更多的功能基因被克隆，但是要獲得更好的轉(zhuǎn) 基因植株，選擇適當(dāng)?shù)膯?dòng)子使其在特異部位.高效表達(dá)是首先要考慮的問(wèn)題。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種植物根特異性啟動(dòng)子。本發(fā)明提供的植物根特異性啟動(dòng)子，名稱為SP，是如下a)或b)或c)的DNA 分子a) 由序列表中序列1所示的脫氧核糖核苷酸序列組成的DNA分子；b) 在嚴(yán)格條件下與a)限定的DNA序列雜交且能調(diào)控目的基因在植物的根中特 異表達(dá)的DNA分子；c) 與a)限定的DNA序列具有90X以上的同源性且能調(diào)控目的基因在植物的 根中特異表達(dá)的DNA分子。所述步驟c)中的啟動(dòng)子，與a)的啟動(dòng)子最好有95%以上的同源性。 上述植物根特異性啟動(dòng)子能調(diào)控目的基因在植物根部的維管束組織中表達(dá)。 含有本發(fā)明的啟動(dòng)子的表達(dá)盒、重組載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系和重組菌也屬于本發(fā) 明的保護(hù)范圍。所述表達(dá)盒從上游至下游依次為本發(fā)明的啟動(dòng)子、目的基因和轉(zhuǎn)錄終止子。 擴(kuò)增所述SP啟動(dòng)子全長(zhǎng)及其任意片段的引物對(duì)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。 所述重組表達(dá)載體具體可為如圖1所示的表達(dá)載體或?qū)D1所示的表達(dá)載體的 GUS基因替換為所需的目的基因得到的載體。本發(fā)明所述SP啟動(dòng)子和所述重組表達(dá)載體可用于培育在植物根中特異表達(dá)目 的基因的轉(zhuǎn)基因植物。將含有所述SP啟動(dòng)子的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入單子葉植物或雙子葉植物中時(shí)，可 在單子葉植物或雙子葉植物的根中高效表達(dá)目的基因；所述植物優(yōu)選為擬南芥。實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)目的基因在根中特異表達(dá)。通過(guò)在線數(shù)據(jù)庫(kù)比 對(duì)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該845bp的DNA序列中含有兩個(gè)已知的根特異性表達(dá)的順式作 用元件。ATATT是一種根特異性相關(guān)的元件，稱為rootmotif，是根瘤農(nóng)桿菌中rolA 基因啟動(dòng)子的片段。在AtSBP3啟動(dòng)子中含有13個(gè)ATATT順式作用元件。在該啟動(dòng) 子序列中還包含一個(gè)木質(zhì)部特異表達(dá)的順式作用元件ACAAAGAA。本發(fā)明提供的根特異性啟動(dòng)子可以替代35S啟動(dòng)子應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因植株，使目的基因定位于根部，或者作為啟動(dòng)子的一部分，連接其它順式作用元件后獲得其它特 性，如增強(qiáng)表達(dá)活性或增加誘導(dǎo)表達(dá)能力，從而廣泛應(yīng)用于以此為目的的轉(zhuǎn)基因過(guò) 程。


圖1為重組表達(dá)載體pCAMBIA1391-SP的物理圖譜 圖2為SP啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GUS基因在擬南芥根中特異表達(dá) 圖3為SP啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GUS基因在根部表達(dá)的顯微照片具體實(shí)施方式
實(shí)施例l、 SP啟動(dòng)子序列的獲得以1周齡哥倫比亞生態(tài)型野生型擬南芥植株為實(shí)驗(yàn)材料，提取其基因組DNA并 以其為模板，從公布的擬南芥基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增SP啟動(dòng)子序列。 在引物兩端分別引入^a/^I和^^ I酶切位點(diǎn)，引物序列如下上游 5' -ACGGGATCCACCATTCACGGTAGGTTCTTTTAT-3'，引入A柳〃I酶切位點(diǎn)；下游 5' -ACGGAATTCTCTTGCGTTTACTGTTTTTGC-3'，引入I酶切位點(diǎn)。對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，切下目的條帶純化回收，將酶切產(chǎn) 物連接到pGEM-T Easy載體上并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10(3感受態(tài)細(xì)胞，挑取在A卿抗 性平板上長(zhǎng)出的單克隆，提取質(zhì)粒、酶切鑒定并進(jìn)行測(cè)序，將轉(zhuǎn)入SP啟動(dòng)子序列 的質(zhì)粒命名為p-SP。測(cè)序結(jié)果表明，擴(kuò)增得到的SP啟動(dòng)子的脫氧核糖核苷酸序列 如序列表中序列1所示。實(shí)施例2、攜帶SP啟動(dòng)子和GUS基因的重組表達(dá)載體的構(gòu)建將質(zhì)粒p-SP和質(zhì)粒pCAMBIA1391 (購(gòu)自pCAMBIA公司)37"C條件下分別用 和雙酶切3h，酶切產(chǎn)物分別進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳分析，回收845bp 的SP啟動(dòng)子序列和12kb的質(zhì)粒pCAMBIA1391酶切后的大片段，用T4 DNA連接 酶4。C連接過(guò)夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10(3感受態(tài)細(xì)胞，挑取在Kan抗性平板 上長(zhǎng)出的單克隆，提取質(zhì)粒，進(jìn)行PCR鑒定和酶切鑒定。將獲得的重組表達(dá)載體 命名為pCAMBIA1391-SP，重組表達(dá)載體pCAMBIA1391-SP的物理圖譜如圖1所 示。實(shí)施例3、 SP啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GUS基因在擬南芥根中特異表達(dá)一、重組表達(dá)載體pCAMBIA1391-SP轉(zhuǎn)化野生型擬南芥將實(shí)施例2構(gòu)建的重組表達(dá)載體pCAMBIA1391-SP轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞，挑取在Rif和卡那霉素(Kan)抗性平板上生長(zhǎng)的單菌落進(jìn)行PCR鑒 定。將含有重組表達(dá)載體pCAMBIA1391-SP的農(nóng)桿菌用Floral dip法轉(zhuǎn)化哥倫比亞 生態(tài)型野生型擬南芥，收獲該當(dāng)代轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的種子(Ti代)，在添加25mg/L 潮霉素(Hyg)的MS培養(yǎng)基上篩選陽(yáng)性苗。收獲該L代轉(zhuǎn)基因擬南芥的種子(T2代)，將T2代轉(zhuǎn)基因擬南芥種子播種到上述培養(yǎng)基中，對(duì)長(zhǎng)出的T2代轉(zhuǎn)基因擬南芥的10d齡幼苗和成熟植株的各器官進(jìn)行GUS基因的檢測(cè)。 二、 GUS染色分析GUS染液的配制(lmL):稱取lmg的X-Gluc，加入1-2滴N,N-二甲基甲酰胺 至X-Gluc完全溶解，然后加入pH 7.0的0.1mol/L磷酸緩沖液980 (iL、 5mmo1 /L的 鐵氰化鉀10和5mmo1 /L的亞鐵氰化鉀10 ^L，將混合物攪拌均勻，最后加入1 |uL Triton X-謂。選取轉(zhuǎn)入SP啟動(dòng)子序列的T2代轉(zhuǎn)基因擬南芥的10d齡幼苗、成熟植株的不同 組織，分別放入裝有100)iLGUS染液的EP管中，37。C溫浴4h，用50%和70%的 酒精依次洗脫12h，之后在體視鏡和顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)基因擬南芥各器官的染色情況， 并通過(guò)CCD攝取圖像。轉(zhuǎn)入SP啟動(dòng)子序列的丁2代轉(zhuǎn)基因擬南芥的10d齡苗染色 后的體視鏡下觀察結(jié)果如圖2所示，其顯微鏡下觀察結(jié)果如圖3所示。圖2表明， 轉(zhuǎn)入SP啟動(dòng)子序列的T2代轉(zhuǎn)基因擬南芥的根部有藍(lán)色的著色，說(shuō)明SP啟動(dòng)子驅(qū) 動(dòng)GUS基因僅在根部表達(dá)，即SP啟動(dòng)子為根特異性啟動(dòng)子。圖3表明SP啟動(dòng)子驅(qū) 動(dòng)GUS基因在根部的維管束組織中表達(dá)。序列表〈160> 1〈210〉 1〈211> 845<212> 醒<213〉 擬南芥(乂ra歸ops/s細(xì)/Zawa)〈400〉 1cattcacggtaggttcttttattcgctctcactgataatcctttaatatgcaactcaaag60atttgaacctcatgtgaacgttctatgaatatcgttacagata^c犯cggtttaatgac120accgac犯tggggac卿gtggttgatcaatacaag8Latg180actctacaagtagactagaaattt"tagca^cctctttattttacaattatcttgttaagg240attagcaaatgtgaaccagttcttactccattgttaatataagctgcatatatctttgtt300catca^ct8gggatttccaagttctgcagcax:tatggal:Bcttattgagtctaatagaat360caMaattgga^g^gca^gttaaaccggtcaaaagacctaagtatgttggagggtttgag420atatcttgacattctgtgttt卿ggaaggctagatgttgatacaatattgtataatttg■ttatccgttc犯tccaaaagcatttaagtgcgatgtaaagtgatggtttt540ttctagttta犯tgatteigtctcactctctagtcgat￡Lg￡Latattgceiac600ttgtttataaatttgattaggtgagctatg3tt3gt3gtgcataaatacattatctatga660gacaaag3犯cgtgataggttattgttttt"tcttgtttgcgtctggcatatgtatgt8t3720aaaccaaatatcaagcagaacatatgcgattttcaaaatgtgggcggtgctgaaaacata780tattagtttactccaacttgcagaatatttgagtatattaatgcaa^aiacagtaaacgca840卿gc84權(quán)利要求
1. 一種啟動(dòng)子，是如下a)或b)或c)的DNA分子a)由序列表中序列1所示的脫氧核糖核苷酸序列組成的DNA分子；b)在嚴(yán)格條件下與a)限定的DNA序列雜交且能調(diào)控目的基因在植物的根中特異表達(dá)的DNA分子；c)與a)限定的DNA序列具有90％以上的同源性且能調(diào)控目的基因在植物的根中特異表達(dá)的DNA分子。
2、 含有權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子的外源目的基因的表達(dá)盒。
3、 含有權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子或權(quán)利要求2所述的外源目的基因的表達(dá)盒 的重組表達(dá)載體。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述重組表達(dá)載體，其特征在于所述重組表達(dá)載體的出 發(fā)載體為質(zhì)粒pCAMBIA1391。
5、 根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的重組表達(dá)載體，其特征在于所述重組表達(dá)載 體為如下l)或2)的表達(dá)載體1) 如圖l所示的表達(dá)載體；2) 將圖1所示的表達(dá)載體的GUS基因替換為所需的目的基因得到的表達(dá)載體。
6、 含有權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子或權(quán)利要求2所述的表達(dá)盒或權(quán)利要求3-5中任一所述的重組表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。
7、 權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子或權(quán)利要求2所述的表達(dá)盒或權(quán)利要求3-5中任 一所述的重組表達(dá)載體在培育在植物根中特異表達(dá)目的基因的轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng) 用。
8、 根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于所述植物為單子葉植物或雙子 葉植物。
9、 根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于所述植物為擬南芥。
10、 擴(kuò)增權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子全長(zhǎng)及其任意片段的引物對(duì)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種根特異性啟動(dòng)子及其重組表達(dá)載體。該啟動(dòng)子，是如下a)或b)或c)的DNA分子a)由序列表中序列1所示的脫氧核糖核苷酸組成的DNA分子；b)在嚴(yán)格條件下與a)限定的DNA序列雜交的DNA分子；c)與a)限定的DNA序列具有90％以上的同源性且能調(diào)控目的基因在植物的根中特異表達(dá)的DNA分子。本發(fā)明還公開了含有該啟動(dòng)子的重組表達(dá)載體，該重組表達(dá)載體可應(yīng)用于培育在植物根中特異表達(dá)目的基因的轉(zhuǎn)基因植物。
文檔編號(hào)C12N1/15GK101280313SQ20081011221
公開日2008年10月8日 申請(qǐng)日期2008年5月21日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月21日
發(fā)明者飛 任, 張秀清, 王學(xué)臣, 陳乃芝, 陳其軍, 魏鵬程 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)