專(zhuān)利名稱(chēng)：在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行位點(diǎn)特異性重組的方法及系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)和遺傳工程領(lǐng)域。更具體而言，本發(fā)明涉及可在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的新的整合酶(Intergrase)以及采用該整合酶的哺乳動(dòng)物細(xì)胞位點(diǎn)特異性重組方法。
背景技術(shù)：
位點(diǎn)特異性重組(site-specific recombination)，是發(fā)生在兩條DNA鏈特異位點(diǎn)上的重組，該重組的發(fā)生需一段同源序列(即特異性位點(diǎn)，又稱(chēng)附著點(diǎn)attachment site,att)和位點(diǎn)特異性的蛋白因子(即重組酶)參與催化。重組酶只能催化特異性位點(diǎn)間的重組，不能催化其它任何兩條同源或非同源序列之間的重組，因而重組具有特異性和高度保守性。據(jù)此，位點(diǎn)特異性重組又稱(chēng)保守重組(conservation recombination)，該重組過(guò)程不需RecA蛋白參與。目前在小鼠及小鼠ES細(xì)胞基因操作中應(yīng)用較多的有Cre/loxP、FLP/FRT和PB轉(zhuǎn)座子系統(tǒng).其中Cre、FLP和PBase均為特異性重組酶，屬重組酶整合酶家族，它們催化的反應(yīng)類(lèi)型、靶位點(diǎn)及重組機(jī)制十分相似，loxP.FRT和RS為特異性位點(diǎn)，也有相似的結(jié)構(gòu)[1]。 此外，基于已研究得非常清楚的λ嗜菌體位點(diǎn)特異重組系統(tǒng)(attBXattP — attLXattR) 的Gateway 技術(shù)在本領(lǐng)域中也有廣泛的應(yīng)用。Cre/loxP 重組系統(tǒng)Cre/loxp重組系統(tǒng)策略是進(jìn)行基因組定點(diǎn)突變的新途徑[2]。該系統(tǒng)在80年代被引入后，已被成功的應(yīng)用于酵母菌、植物、哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)及小鼠身上。Cre/loxp重組系統(tǒng)包括Cre重組酶和Ioxp位點(diǎn)兩個(gè)部分，Cre重組酶由大腸桿菌噬菌體Pl的Cre基因編碼，是由343個(gè)氨基酸組成的單體蛋白，它不僅具有催化活性，而且跟限制酶相似，識(shí)別特異的DNA序列，如=Loxp位點(diǎn)，引起重組。Loxp位點(diǎn)是Cre重組酶作用的特異性重組位點(diǎn)， 由34bp組成，包含兩個(gè)13bp的反向重復(fù)順序和8bp的間隔區(qū)域。Cre重組酶有70%的重組效率，不借助任何輔助因子，作用于多種結(jié)構(gòu)的DNA底物，如線形、環(huán)狀，甚至超螺旋(被 Cre重組酶解螺旋成為線形結(jié)構(gòu))[2’3]。任何序列的DNA，當(dāng)其位于兩個(gè)IoxP位點(diǎn)之間的時(shí)候，在Cre重組酶的作用下要么被缺失(兩個(gè)IoxP位點(diǎn)的方向相同)，要么方向發(fā)生倒轉(zhuǎn)(兩IoxP位點(diǎn)的方向相反)，如

圖1所示。Cre/loxP重組系統(tǒng)可在哺乳類(lèi)細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因鼠中因IoxP位點(diǎn)設(shè)計(jì)的不同而產(chǎn)生特異性重組[4]。其應(yīng)用主要包括基因失活或敲除、基因激活、基因顛換、基因易位，還可以利用此系統(tǒng)進(jìn)行載體的構(gòu)建。相對(duì)傳統(tǒng)的基因突變技術(shù)，Cre/Loxp系統(tǒng)借助Cre重組酶表達(dá)的特異性，條件性敲除基因，大大降低了小鼠的死亡率[5]。2006年，Berton等[6]利用上述方法把大鼠腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain, derivedneurotrophic factor, BDNF)的局部表達(dá)降低，產(chǎn)生類(lèi)似長(zhǎng)期服用抗抑郁藥的抗抑郁效果，從而證明了 BDNF參與到神經(jīng)環(huán)路和行為可塑性的過(guò)程中。利用Cre/Loxp系統(tǒng)不僅可對(duì)基因進(jìn)行敲除，還可對(duì)基因進(jìn)行特定激活，了解基因的正向效應(yīng)。Hnasko等[7]選用多巴胺缺陷的小鼠，在表達(dá)內(nèi)源性酪氨酸羥化酶基因的前面加了 1個(gè)Loxp-pgk-neo-Loxp，(pgk為酪氨酸羥化酶的終止信號(hào)，neo為篩選標(biāo)記)，正常情況下，小鼠表達(dá)pgk，后面的酪氨酸羥化酶不表達(dá)；在小鼠尾狀核注入Cre重組酶的情況下， Cre重組酶切掉終止信號(hào)pgk和1個(gè)Loxp位點(diǎn)，酪氨酸羥化酶便表達(dá)，尾狀核部位生成多巴胺，從而研究神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺在這個(gè)部位的功能。采用同源重組技術(shù)，在基因組上人工構(gòu)建兩個(gè)Loxp位點(diǎn)，借助構(gòu)建的兩個(gè)Loxp位點(diǎn)，把兩端帶有Loxp位點(diǎn)的外源基因重組到基因組上，此種重組是雙向的，既可以把外源基因重組N4，鼠基因組內(nèi)，也可把小鼠基因組內(nèi)源基因重組出來(lái)，這是定點(diǎn)整合的重要手段之一。在同一染色體上構(gòu)建兩個(gè)相反的Loxp位點(diǎn)，在Cre重組酶的作用下，Loxp位點(diǎn)之間的靶基因反方向倒轉(zhuǎn)。在不同染色體上分別構(gòu)建1個(gè)Loxp位點(diǎn)，在Cre重組酶的作用下， Loxp位點(diǎn)后面的基因發(fā)生重組，不同染色體上大片段基因互相交換，染色體易位。Testa等 [8]利用此原理進(jìn)行了如下操作，實(shí)現(xiàn)了基因易位。Flp/FRT 系統(tǒng)該系統(tǒng)與Cre/loxP系統(tǒng)相同，也是由一個(gè)重組酶和一段特殊的DNA序列組成。從進(jìn)化的角度上考慮，F(xiàn)lp/FRT系統(tǒng)是Cre/loxP系統(tǒng)在真核細(xì)胞內(nèi)的同源系統(tǒng)。其中.重組酶Flp是酵母細(xì)胞內(nèi)的一個(gè)由423個(gè)氨基酸組成的單體蛋白。與Cre相似，F(xiàn)lp發(fā)揮作用也不需要任何輔助因子，同時(shí)在不同的條件下具有良好的穩(wěn)定性。該系統(tǒng)的另一個(gè)成分Flp 識(shí)別位點(diǎn)(Flp recognition target, FRT)與IoxP位點(diǎn)非常相似，同樣由兩個(gè)長(zhǎng)度為13bp 的反向重復(fù)序列和一個(gè)長(zhǎng)度為8bp的核心序列構(gòu)成。在該系統(tǒng)發(fā)揮作用時(shí)，F(xiàn)RT位點(diǎn)的方向決定了目的片段的缺失還是倒轉(zhuǎn)。Flp/FRT系統(tǒng)與Cre/loxP系統(tǒng)的明顯區(qū)別是它們發(fā)揮作用的最佳溫度不同，F(xiàn)lp重組酶發(fā)揮作用的最佳溫度為30°C，而Cre重組酶為37°C。因此，Cre/loxP系統(tǒng)最適宜在動(dòng)物體內(nèi)使用。IoxP和FRT位點(diǎn)的序列如圖2所示。PiRRyBac轉(zhuǎn)座子重組技術(shù)piggyBac轉(zhuǎn)座子(PB轉(zhuǎn)座子)最初是從侵染粉紋夜蛾Trichoplusia ni TN-368 細(xì)胞株系的苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(簡(jiǎn)稱(chēng)AcNPV)內(nèi)分離得到的，并命名為IFP2[9]， 其在分類(lèi)上屬于真核生物的第二類(lèi)轉(zhuǎn)座子，是一個(gè)自主因子，長(zhǎng)M67bp，其中含有1個(gè)RNA 聚合酶II啟動(dòng)子、1個(gè)聚腺苷酸信號(hào)和1個(gè)編碼594個(gè)氨基酸轉(zhuǎn)座酶的可讀編碼框[1°]， 末端是長(zhǎng)13bp的反向末端重復(fù)序列(ITR)，兩端不對(duì)稱(chēng)分布著19bp反向亞末端重復(fù)序列 (inverted sub-terminal repeats, ITR)(圖 3，引自 Handler[11])。PB 轉(zhuǎn)座子可以在基因組中切出和轉(zhuǎn)座，切出和轉(zhuǎn)座總是發(fā)生在特征性的TTAA四核苷酸目標(biāo)位點(diǎn)序列，轉(zhuǎn)座頻率較高，而且piggBac轉(zhuǎn)座子受生物體種類(lèi)的限制性較少。同其他大多數(shù)DNA轉(zhuǎn)座子一樣，PB轉(zhuǎn)座子也是在轉(zhuǎn)座酶的催化下通過(guò)“剪切和粘貼”機(jī)制發(fā)生轉(zhuǎn)座。由于轉(zhuǎn)座子的整合與切離發(fā)生在真核生物細(xì)胞核內(nèi)，而PB轉(zhuǎn)座酶的預(yù)測(cè)分子質(zhì)量為68kDa，因此，需要在核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的介導(dǎo)下主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)通過(guò)核孔復(fù)合體進(jìn)入核內(nèi)。 Sarkar等通過(guò)PSORT II分析預(yù)測(cè)PB轉(zhuǎn)座酶雙向核定位信號(hào)位于C端551 571位的氨基酸簇內(nèi)[12]。隨后，Keith等通過(guò)研究證明了 PB轉(zhuǎn)座酶雙向核定位信號(hào)位于C端501 571 位氨基酸簇內(nèi)，其上游的一些帶負(fù)電荷氨基酸對(duì)于PB轉(zhuǎn)座酶的核定位也很重要[13]。PB轉(zhuǎn)座子在切出和插入時(shí)都需要其本身編碼的轉(zhuǎn)座酶的作用[14]，并發(fā)生在特征性的序列TTAA目標(biāo)位點(diǎn)[15]。PB轉(zhuǎn)座子以一種特定的模式從切出位點(diǎn)完全切出[16]，在切出點(diǎn)總是留下一段單一的四核苷酸TTAA[15’17]。PB轉(zhuǎn)座子進(jìn)入目標(biāo)基因組中時(shí)，通常在富含 A+T的區(qū)域插入，有一個(gè)5’ TTAA3’四核苷酸的目標(biāo)位點(diǎn)，并且復(fù)制一段目標(biāo)序列TTAA[18]。 PB轉(zhuǎn)座子從感染細(xì)胞內(nèi)的桿狀病毒基因組的切出和從質(zhì)粒到桿狀病毒基因組的轉(zhuǎn)座都表現(xiàn)了以上這些特征。PB轉(zhuǎn)座子以一定的模式切出[19]，其模型為PB轉(zhuǎn)座子切出時(shí)，雙鏈分開(kāi)，產(chǎn)生鈍的末端，并在切出溝處有DNA鏈的重新連接。也就是說(shuō)含有雙鏈的PiggyBac轉(zhuǎn)座子切出時(shí)，打破了側(cè)面TTAA目標(biāo)位點(diǎn)上的某些序列，被切出的轉(zhuǎn)座子留下的缺口直接被自由的DNA末端所修復(fù)。在PB切出位點(diǎn)沒(méi)有發(fā)現(xiàn)末端反向重復(fù)序列的殘基或填充序列 ("filler"sequence)0 PB轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座是一個(gè)簡(jiǎn)單的剪切-連接過(guò)程。PB轉(zhuǎn)座子的切出模式是唯一的，總是在切出的地方留下準(zhǔn)確的切出痕跡，而其它兩類(lèi)轉(zhuǎn)座子通常在切出溝里留下完整的核苷酸或末端殘基，導(dǎo)致不準(zhǔn)確的切出痕跡。哺乳動(dòng)物缺乏有活性的天然轉(zhuǎn)座因子。人們?cè)?jīng)從魚(yú)的基因組中通過(guò)比較系統(tǒng)發(fā)生學(xué)方法人工復(fù)活了 SB轉(zhuǎn)座因子，發(fā)現(xiàn)其能在培養(yǎng)細(xì)胞和小鼠中作用_]。但是，SB因子的轉(zhuǎn)座效率不高[21]，并和其他許多轉(zhuǎn)座因子一樣存在過(guò)表達(dá)抑制的現(xiàn)象，即催化轉(zhuǎn)座反應(yīng)的轉(zhuǎn)座酶表達(dá)量上升時(shí)轉(zhuǎn)座效率反而下降[22]，給提高轉(zhuǎn)座效率的嘗試帶來(lái)了嚴(yán)重阻礙。同時(shí)，SB因子攜帶外源DNA的能力不強(qiáng)。原始的SB因子長(zhǎng)度不到21Λ，在此基礎(chǔ)上每多攜帶 Ikb的外源基因其轉(zhuǎn)座效率下降約30%，使得它無(wú)法攜帶較復(fù)雜的結(jié)構(gòu)元件進(jìn)行轉(zhuǎn)基因或插入誘變篩選to]。SB因子轉(zhuǎn)座時(shí)新插入位點(diǎn)主要集中在原始位點(diǎn)周?chē)?，在生殖?xì)胞轉(zhuǎn)座時(shí)尤其顯著@]。多拷貝SB因子轉(zhuǎn)座時(shí)容易發(fā)生染色體缺失和致死性的背景突變@]。這些都妨礙其用于大規(guī)模插入誘變篩選。最后，SB因子切離時(shí)留下的TA重復(fù)也使得用回復(fù)突變確認(rèn)基因功能的工作無(wú)法進(jìn)行@]。由于這些原因，SB因子發(fā)明近10年來(lái)沒(méi)有被廣泛應(yīng)用。復(fù)旦大學(xué)許田等[26]成功改造了來(lái)源于飛蛾的PB因子并將其應(yīng)用于哺乳動(dòng)物。PB 可在人和小鼠細(xì)胞株中高效導(dǎo)入基因并穩(wěn)定表達(dá)，為體細(xì)胞遺傳學(xué)研究和基因表達(dá)提供了一個(gè)高效、便捷的新系統(tǒng)。PB也可用于培育轉(zhuǎn)基因小鼠，具有攜帶基因容量大，操作簡(jiǎn)便高效等優(yōu)點(diǎn)。與傳統(tǒng)方法相比，利用PB進(jìn)行轉(zhuǎn)基因時(shí)轉(zhuǎn)基因以類(lèi)似于內(nèi)源基因的單拷貝形式整合，轉(zhuǎn)基因載體可同時(shí)攜帶多個(gè)基因，轉(zhuǎn)基因整合效率高并可長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)，轉(zhuǎn)基因整合位點(diǎn)易于確定，并可用非損傷性的可見(jiàn)標(biāo)記代替PCR等傳統(tǒng)方法經(jīng)濟(jì)高效地跟蹤轉(zhuǎn)基因。 更令人興奮的是，PB精確切離的特性也可用于復(fù)活被插入的基因。Gateway 技術(shù)(Gateway 技術(shù)是基于已研究的非常清楚的λ嗜菌體位點(diǎn)特異重組系統(tǒng)(attB xattP-attL χ attR)的一種體外技術(shù)，其大大地簡(jiǎn)化了基因克隆和亞克隆的步驟，而同時(shí)典型的克隆效率高達(dá)95%或更高；當(dāng)基因在目的表達(dá)載體之間快速簡(jiǎn)便的穿梭時(shí)，還可以保證正確的方向和閱讀框。Gateway 也有助于進(jìn)行帶不同數(shù)目純化和檢測(cè)標(biāo)簽的表達(dá)。BP和LR兩個(gè)反應(yīng)就構(gòu)成了 (Gateway 技術(shù)(圖4)。BP反應(yīng)利用一個(gè)attB DNA片段或表達(dá)克隆和一個(gè)attP供體載體之間的重組反應(yīng)，創(chuàng)建一個(gè)入門(mén)克隆(圖5)。LR反應(yīng)是一個(gè)attL入門(mén)克隆和一個(gè)attR目的載體之間的重組反應(yīng)。LR反應(yīng)用來(lái)在平行的反應(yīng)中轉(zhuǎn)移目的序列到一個(gè)或更多個(gè)目的載體(圖6)。
在Gateway技術(shù)中，主要用到三種工具酶(表1)，λ噬菌體整合酶 integraseant)、整合作用宿主因子(IHF)和XIS。表1. Gateway技術(shù)中三種工具酶及其功能
權(quán)利要求
1.一種可在哺乳動(dòng)物內(nèi)表達(dá)的整合酶基因，其選自下組(a)由SEQID NO 1所示的序列構(gòu)成的核苷酸序列；(b)具有SEQID NO :1所示的核苷酸序列，且能在哺乳動(dòng)物內(nèi)表達(dá)并介導(dǎo)位點(diǎn)特異性重組的核苷酸序列；(c)在嚴(yán)格條件下與(a)或(b)所限定的核苷酸序列雜交，且能在哺乳動(dòng)物內(nèi)表達(dá)并介導(dǎo)位點(diǎn)特異性重組的核苷酸序列；或(d)與(a)-(c)中任一項(xiàng)所限定的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列。
2.如權(quán)利要求1所述的整合酶基因，其特征在于，所述基因是由SEQID N0:1所示的序列構(gòu)成的核苷酸序列。
3.—種可在哺乳動(dòng)物內(nèi)表達(dá)的整合酶，其特征在于，所述整合酶選自下組 (i)由權(quán)利要求1所述的整合酶基因所編碼的氨基酸序列；( )在(i)限定的氨基酸序列中經(jīng)過(guò)取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸，且能在哺乳動(dòng)物內(nèi)介導(dǎo)位點(diǎn)特異性重組的氨基酸序列；或(iii) (i)或(ii)中所述氨基酸序列的保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
4.如權(quán)利要求3所述的整合酶，其特征在于，所述整合酶由SEQID NO :2所示的氨基酸序列構(gòu)成。
5.一種載體，所述載體包含權(quán)利要求1所述的基因。
6.一種遺傳工程化的宿主細(xì)胞，其特征在于，它含有權(quán)利要求5所述的載體。
7.一種在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行位點(diǎn)特異性重組的方法，所述方法包括(A)將權(quán)利要求1所述的整合酶基因轉(zhuǎn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)，或?qū)?quán)利要求3所述的整合酶導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)；(B)在適合位點(diǎn)特異性重組的條件下培養(yǎng)所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述整合酶基因是SEQID NO :1所示的核苷酸序列。
9.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述整合酶是SEQID NO :2所示的氨基酸序列。
10.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述哺乳動(dòng)物選自人、大鼠、小鼠、犬、猴、豬、馬、牛或羊。
全文摘要
本發(fā)明中提供了一種在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行位點(diǎn)特異性重組的方法及系統(tǒng)。具體而言，本發(fā)明中提供了可在哺乳動(dòng)物內(nèi)表達(dá)并介導(dǎo)位點(diǎn)特異性重組的整合酶基因，由其表達(dá)的整合酶或該整合酶的保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物，以及采用所述整合酶基因或整合酶在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行位點(diǎn)特異性重組的方法。本發(fā)明的整合酶或其基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中所介導(dǎo)的位點(diǎn)特異性重組具有簡(jiǎn)便、穩(wěn)定等諸多優(yōu)點(diǎn)，為本領(lǐng)域提供了有力的研究和開(kāi)發(fā)工具。
文檔編號(hào)C12N9/00GK102234656SQ20101015952
公開(kāi)日2011年11月9日 申請(qǐng)日期2010年4月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月29日
發(fā)明者劉愷, 楊淑偉 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院