一種制備成熟紅細(xì)胞的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物制品領(lǐng)域，涉及一種制備成熟紅細(xì)胞的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 輸血是安全用血的主要任務(wù)，在戰(zhàn)時，傷員的出血是死亡的重要原因，如果能快速 輸血可以拯救戰(zhàn)士的生病，而驗(yàn)血，配血要消耗大量時間，但如果有萬能用血，直接輸血，則 可救治生命；在平時，血液的充份供給，輸血的感染，污染問題的解決，稀有血型的用血，如 中國人98 %以為Rh陽性，如果有Rh陰性用血，則會非常難獲得，因而離發(fā)現(xiàn)一條能夠大 量造成萬能用血的來源，思考和研宄如何能夠獲得更為安全和更有廣泛來源的血液制備制 品，尤其是生產(chǎn)萬能紅細(xì)胞，（所謂萬能用血，就是采用來自于胎盤中Rh陰性"0"型血）這 是保障用血的供應(yīng)和安全的重要方法。國內(nèi)外都對開發(fā)這類產(chǎn)品高度重視，投入很大的財 力和物力。
[0003] 人體內(nèi)紅細(xì)胞的生成過程是非常復(fù)雜的。在成年人的體內(nèi)，紅細(xì)胞是在骨髓中生 成的，但是在早期的胚胎中，紅細(xì)胞是在主動脈弓及胎盤、卵黃囊的中胚層細(xì)胞中生成的。 隨著胎齡的增長，在3個月后紅細(xì)胞的生成轉(zhuǎn)到脾和肝臟，5個月后在骨髓。而且目前有文 章和試驗(yàn)指出，胎盤是為胎兒提供干細(xì)胞以及幫助干細(xì)胞成熟的重要組織。雖然有研宄者 也對其它可大量生成紅細(xì)胞的祖系細(xì)胞進(jìn)行了研宄，包括臍帶血、骨髓以及外周血，但是都 不能滿足臨床的需要，臍帶血量少，而骨髓和周圍血來源困難。此外，對于急診以及外傷患 者中非常少見的〇型陰性（〇_)血患者，血源緊張的問題就更加嚴(yán)重，所以，此研宄解決血源 問題意義尤其重大。
[0004] 紅細(xì)胞對于人體來說之所以重要，是因?yàn)樗軐⒀鯕膺\(yùn)輸?shù)矫總€細(xì)胞。評價紅細(xì) 胞功能方法之一就是檢測其攜氧能力以及穩(wěn)定性，即氧離曲線。用人類胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)出 的紅細(xì)胞的氧離曲線，與正常紅細(xì)胞是相似的，而且也隨著PH值、2,3-二磷酸甘油酸的改 變而改變，攜帶和釋放氧的能力也符合標(biāo)準(zhǔn)。成熟紅細(xì)胞沒有細(xì)胞核，胞漿內(nèi)充滿血紅蛋 白，具有攜帶氧氣和二氧化碳的功能。因?yàn)槟ど虾蠥BO糖蛋白血型抗原，輸血前需要檢 測血型。利用人胚胎干細(xì)胞培育出的紅細(xì)胞與成熟紅細(xì)胞相近。另外人們開發(fā)了誘導(dǎo)多能 干細(xì)胞（iPS)，它能夠在體外無限量制造成熟紅細(xì)胞。這一研宄有望減少人們對獻(xiàn)血的依 賴，對多種疾病進(jìn)行研宄，例如鐮狀細(xì)胞病。雖然成熟的紅細(xì)胞不能自我復(fù)制，但在干細(xì)胞 的分化過程中，由胚胎干細(xì)胞一一多能干細(xì)胞一紅系祖細(xì)胞具有復(fù)制能力，可以誘導(dǎo)性多 能干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞，成功培育出在實(shí)驗(yàn)室中幾乎可以無限復(fù)制增殖的紅系祖細(xì)胞，并 分化為成熟的紅細(xì)胞。但是與成熟的紅細(xì)胞相比，胚胎和iPS干細(xì)胞源性的紅細(xì)胞有2個 大問題，1.這更像胎兒紅細(xì)胞，盡管在體外經(jīng)過培養(yǎng)后，還是表現(xiàn)出了成年紅細(xì)胞的特征。 2.這種干細(xì)胞的來源是種無限增殖能力的細(xì)胞，具有腫瘤細(xì)胞的特性。
[0005] 更多的人用骨髓、臍帶血的造血干細(xì)胞分化成為成熟紅細(xì)胞，也有用周圍血的白 細(xì)胞實(shí)現(xiàn)了在實(shí)驗(yàn)室里從干細(xì)胞中培養(yǎng)出功能性紅血球，然后再輸入人體，為建立輸血用 途的干細(xì)胞庫做出了貢獻(xiàn)。在造血微環(huán)境的幫助下，可以體外從干細(xì)胞生成正常的紅細(xì)胞。 但以上來源的干細(xì)胞問題是：胚胎或誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPS)因?yàn)閬碓醇?xì)胞有無限繁殖的可 能，會形成腫瘤，一般不能應(yīng)用于臨床。骨髓來源困難；而臍帶血和周圍血擴(kuò)增水平有限，所 以如何可以達(dá)到數(shù)百萬的擴(kuò)增，滿足臨床輸血的需要，可以進(jìn)行大批量生產(chǎn)，是科研人員的 努力方向。國外在這方面投入大批資金和人員，國內(nèi)也有多人在做。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種制備成熟紅細(xì)胞的方法。
[0007] 本發(fā)明的目的可通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0008] 本發(fā)明的發(fā)明點(diǎn)在于：
[0009] 利用來自于胎盤源血的造血干細(xì)胞不同發(fā)育階段群、來自于胎盤源組織的間充質(zhì) 干細(xì)胞，或聯(lián)合利用來自于同源性臍帶血和胎盤的造血干細(xì)胞不同發(fā)育階段群，以這三種 干細(xì)胞來建立人造血庫。
[0010] 目前國內(nèi)外體外制備紅細(xì)胞的方法使用臍血、骨髓或外周動員的CD34+細(xì)胞或胚 胎干細(xì)胞作為原料，而本發(fā)明利用胎盤源血單個核細(xì)胞為原料在體外生產(chǎn)成熟紅細(xì)胞。從 胎盤源血中分離出單個核細(xì)胞，可以用此細(xì)胞，也可以進(jìn)步純化為各個造血干細(xì)胞群，然后 通過培養(yǎng)、制備和生產(chǎn)成熟的紅細(xì)胞。這種通過加過不同細(xì)胞因子組合的誘導(dǎo)以及來自于 胎盤或臍帶組織采用絲烈霉素 C或同位素滅活的間充質(zhì)干細(xì)胞和造血干細(xì)胞共同培養(yǎng)，形 成無核成熟紅細(xì)胞。本發(fā)明的培養(yǎng)體系可使單個核細(xì)胞中的干細(xì)胞不斷增殖并且只向紅系 方向分化。結(jié)構(gòu)和功能分析結(jié)果表明，體外培養(yǎng)出的紅細(xì)胞的平均細(xì)胞體積（MCV)，平均血 紅蛋白含量（MCH)，紅細(xì)胞的最大變形指數(shù)，葡萄糖6磷酸脫氫酶及丙酮酸激酶的含量都 和成人紅細(xì)胞的特性類似。利用胎盤或胎盤和臍帶血含有的造血干祖細(xì)胞，通過體外培養(yǎng) 能大量生產(chǎn)出成人紅細(xì)胞，從而為建立人造血庫提供條件。
[0011] 發(fā)明是發(fā)現(xiàn)胎盤源血內(nèi)還含有紅細(xì)胞干/祖細(xì)胞，這是臍帶血中不含有的，（利用 同源性臍帶血和胎盤源血一起可以增加干細(xì)胞的含量）（這兒指的是血液里自然形成的干 /祖細(xì)胞簇，不是干細(xì)胞，如圖10所示）這種細(xì)胞不會形成白細(xì)胞克隆，但能形成大量的紅 細(xì)胞克隆。
[0012] 本發(fā)明發(fā)現(xiàn)利用臍帶血和胎盤源血內(nèi)的干細(xì)胞可以在體外用刺激因子使干細(xì)胞 定向紅細(xì)胞擴(kuò)增數(shù)百萬倍，擴(kuò)增后的干細(xì)胞和紅細(xì)胞干/祖細(xì)胞在體外用刺激因子并和間 充質(zhì)干細(xì)胞共同培養(yǎng)和繼續(xù)擴(kuò)增，可以形成成熟的紅細(xì)胞，其數(shù)量可以達(dá)到每個胎盤生成 20到50個單位，每個單位IO 12個紅細(xì)胞，這些細(xì)胞具有正常紅細(xì)胞的功能，可以用于臨床 用血。
[0013] 本發(fā)明也發(fā)現(xiàn)胎盤源血內(nèi)也含有大量的紅細(xì)胞干/祖細(xì)胞簇，也可以用于生成成 熟紅細(xì)胞。
[0014] 基于上述發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的目的可通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0015] 一種制備成熟紅細(xì)胞的方法，包含以下步驟：
[0016] (1)提取并純化來自胎盤源血、臍帶血的單個核細(xì)胞，或提取純化來自于臍帶血和 /或胎盤源血的造血干細(xì)胞⑶34+⑶38+、⑶34+CD38-、造血前體干細(xì)胞⑶133+⑶34+'、早期造 血前體干細(xì)胞⑶133+⑶34_或紅系干/祖細(xì)胞⑶34 +CD72+中的一種或多種；
[0017] (2)從純化的單個核細(xì)胞或純化的CD34+CD38+、CD34+CD38-、CD133+細(xì)胞、紅系干 /祖細(xì)胞CD34+CD72+中的一種或多種中擴(kuò)增干細(xì)胞：取IxlO 6/ml的單個核細(xì)胞置入培養(yǎng) 瓶，所用的培養(yǎng)液為無血清培養(yǎng)液SFEM并和以下細(xì)胞因子共同培養(yǎng)細(xì)胞：l-10Xl(T6m〇l/ L 糖皮質(zhì)激素，50-200ng/ml SCF，50-200ng/ml Flt3-L，10-100ng/ml BMP4，10-100ng/ml IL-3，10-100ng/mlIL-ll和l-10單位/mlEP0，每3-5天取細(xì)胞離心，更換新培養(yǎng)液，在換 2-5次培養(yǎng)液后收集細(xì)胞用于下一步培養(yǎng)；
[0018] (3)細(xì)胞定向培養(yǎng)：取收集的上一步培養(yǎng)的細(xì)胞，離心lOOOrpm，去上清液，換用 新的無血清SFEM培養(yǎng)液，并和以下細(xì)胞因子共同培養(yǎng)細(xì)胞：1-10 X l(T6m〇l/L糖皮質(zhì)激素， 50-200ng/ml SCF，10-100ng/ml BMP4，10-100ng/ml IL-3,IO-IOOng IL-ll，50-200ng/ml IGF-I和2-100單位/ml的EPO每2-5天換新培養(yǎng)液，在換2-5次培養(yǎng)液后，獲得有核紅細(xì) 胞，收集細(xì)胞用于下一步培養(yǎng)；
[0019] (4)取收集的上一步獲得的有核細(xì)胞，將其轉(zhuǎn)移到間充質(zhì)干細(xì)胞鋪底的培養(yǎng)瓶內(nèi) 培養(yǎng)3~7天，其中所用的培養(yǎng)液為含2-10單位EPO的無血清培養(yǎng)液SFEM，或者含2-10單 位EPO的加20 %間充質(zhì)干細(xì)胞滋養(yǎng)液的無血清培養(yǎng)液SFEM ;
[0020] (5)取上一步培養(yǎng)的細(xì)胞在換液時使用不加任何細(xì)胞因子的培養(yǎng)液，還在間充質(zhì) 干細(xì)胞的環(huán)境下培養(yǎng)，此時擴(kuò)增生成的紅細(xì)胞，即為無核成熟的紅細(xì)胞；其中所使用的培養(yǎng) 液選自無血清培養(yǎng)液SFEM，或者加20 %間充質(zhì)干細(xì)胞滋養(yǎng)液的無血清培養(yǎng)液SFEM。
[0021] 步驟（1)所述的單個核細(xì)胞為單獨(dú)提取自胎盤源血或者臍帶血的單個核細(xì)胞，或 者為從胎盤源血或者臍帶血中提取的單個核細(xì)胞的混合物。
[0022] 所述的從胎盤源血中分離單個核細(xì)胞的方法優(yōu)選：
[0023] (1)采用有機(jī)溶劑及生理緩沖液清除胎盤組織和臍帶外表的透明質(zhì)粘液，采用機(jī) 械擠壓及酶和生理緩沖液沖洗的方法，沖洗掉任何殘留的血液；
[0024] (2)收集后的胎盤源血通過各層尼龍或鋼絲濾網(wǎng)，最小的為50um，最大的為 100mm，收集單個核細(xì)胞；
[0025] (3)將以上細(xì)胞收集到50毫升的離心管內(nèi)，在離心機(jī)中以1，OOOrpm離心10分鐘， 去掉70 %的液體，然后按照以下任一方法進(jìn)行處理：
[0026] (a)收集的細(xì)胞和淋巴細(xì)胞分離液按1:4的比例混合，在離心機(jī)中以3, OOOrpm離 心30分鐘，去掉殘存紅細(xì)胞以及成熟的粒細(xì)胞，收集液面間的細(xì)胞，細(xì)胞用1640培養(yǎng)液洗 二次；
[0027] (b)將提取的含有胎盤源血干細(xì)胞溶液和6%高分子羥乙基淀粉按1:3到1:6比 例混合，800rpm，4°C離心5到20m