步驟：
[0075] 1.收集胎盤源血：在無菌環(huán)境下，收集殘留在胎盤內(nèi)的血，命名為胎盤源血。
[0076] 收集的胎盤源血均通過各層尼龍或鋼絲濾網(wǎng)，最小的為50um，最大的為100mm，收 集單個(gè)核細(xì)胞。臍帶血不用過濾。
[0077] 將來自于胎盤源血的細(xì)胞收集到50毫升的離心管內(nèi)，在離心機(jī)中以800離心10 分鐘，去掉70%的液體。然后可有以下二種方法。
[0078] -種是：收集的細(xì)胞和淋巴細(xì)胞分離液按1:4的比例混合。在離心機(jī)中以 3, OOOrpm離心30分鐘，去掉殘存紅細(xì)胞以及成熟的粒細(xì)胞，收集液面間的細(xì)胞，細(xì)胞用 1640培養(yǎng)液洗二次。
[0079] 另一種方法是將臍帶血或胎盤源血和6%高分子輕乙基淀粉（Hespan,大于60， 000道爾頓）按1:3到1:6比例混合，800rpm(500到1，000g)，4°C離心5到20分鐘，棄去紅 細(xì)胞，保留上清液，然后用低分子右旋糖酐（含鹽）將其洗滌三次，把所收集的細(xì)胞為濃縮 單個(gè)核細(xì)胞，將其制成單個(gè)核細(xì)胞混懸液，并做單個(gè)核細(xì)胞計(jì)數(shù)，測(cè)定細(xì)胞活性，計(jì)算CD34、 CD4、CD8細(xì)胞含量及做體外培養(yǎng)的白細(xì)胞集落（CFU-GM)，紅，白細(xì)胞集落（CFU-GEMM)和間 充質(zhì)集落（CFU-F)。
[0080] 提取胎盤造血前體干細(xì)胞（以此為例）：MACS?技術(shù)已經(jīng)成為細(xì)胞磁性可以分選 CD34陽(yáng)性和CD133陽(yáng)性的細(xì)胞金標(biāo)準(zhǔn)，有其強(qiáng)大的優(yōu)勢(shì)和廣泛的用途：從小量分選到大規(guī) 模分選，從高頻細(xì)胞到稀有亞群的細(xì)胞分選，可以高效的、可重復(fù)的及高質(zhì)量的細(xì)胞分離結(jié) 果來自于胎盤內(nèi)的干細(xì)胞群，可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的全自動(dòng)分選，而不需要專門的人員或技巧。細(xì) 胞分選試劑可以從各種物種和樣品中獲得幾乎所有類型的細(xì)胞，選柱用于快速分選被MCS 磁珠標(biāo)記的細(xì)胞，細(xì)胞即可被分選柱放大的磁場(chǎng)捕獲。溫和的分選環(huán)境，在保證細(xì)胞的回收 率和純度的同時(shí)，更保護(hù)了細(xì)胞表面抗原表位，因此，分選得到的細(xì)胞表位完好，細(xì)胞功能 不受影響，用于從抗凝處理的全血中快速進(jìn)行細(xì)胞的陰性分選，最多一次處理30mL全血， 無需密度梯度離心等步驟，可以加速紅細(xì)胞的沉降，以便去除非目的細(xì)胞，即可方便地從上 清液中獲得目的細(xì)胞。先采用含抗CD 133的磁珠抗體從胎盤干細(xì)胞中濃縮純化含CD 133+的 細(xì)胞，再用抗⑶34磁珠抗體從含⑶133+的細(xì)胞群內(nèi)分離出⑶133 +CD34_的干細(xì)胞群，從磁 珠柱子流出的細(xì)胞即為早期造血前體干細(xì)胞。（4)還包含從臍帶血和胎盤源血中其它組分 的造血干細(xì)胞群：
[0081] 1)這種細(xì)胞群來自于去除臍帶血后殘留在胎盤內(nèi)的血液獲得的單個(gè)核細(xì)胞。
[0082] 2)這種細(xì)胞群在流式細(xì)胞儀（FACS)的檢測(cè)中為⑶34+⑶38XDlirT和⑶34+⑶38+CD lin+，幾乎不存在于正常人周圍血，但也存在于臍帶血中。
[0083] 3)這種干細(xì)胞包括二類干細(xì)胞，一類為⑶34+⑶38TDlin_，的干細(xì)胞群，另一類為 和⑶34+⑶38+⑶Iin +的干細(xì)胞，這2類干細(xì)胞都存在于提取的胎盤源血干細(xì)胞內(nèi)，它可以 通過胎盤分離濃縮后于液氮內(nèi)長(zhǎng)期保存。
[0084] 4)這種細(xì)胞在有干細(xì)胞刺激因子（G-CSF，ΕΡ0)的培養(yǎng)液中，具有大量增殖的功 能，可以擴(kuò)增到1000倍以上，其擴(kuò)增后的終未細(xì)胞主要為紅細(xì)胞系，（ΕΡ0的刺激下），但如 果和白細(xì)胞刺激因子共同培養(yǎng)，也可擴(kuò)增為大量的白細(xì)胞。
[0085] 表 1
[0086]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種制備成熟紅細(xì)胞的方法，其特征在于包含以下步驟： (1) 提取并純化來自胎盤源血、臍帶血的單個(gè)核細(xì)胞，或提取純化來自于臍帶血和/或 胎盤源血的造血干細(xì)胞⑶34+⑶38+、⑶34+CD38\造血前體干細(xì)胞⑶133+⑶34+'、早期造血前 體干細(xì)胞⑶133+⑶34_或紅系干/祖細(xì)胞⑶34 +CD72+中的一種或多種； (2) 從純化的單個(gè)核細(xì)胞或純化的⑶34+⑶38+、⑶34+⑶38-、⑶133+細(xì)胞、紅系干/祖 細(xì)胞CD34+CD72+中的一種或多種中擴(kuò)增干細(xì)胞：取IxIO6AiI的單個(gè)核細(xì)胞置入培養(yǎng)瓶， 所用的培養(yǎng)液為無血清培養(yǎng)液SFEM并和以下細(xì)胞因子共同培養(yǎng)細(xì)胞1-10X KT6moVL 糖皮質(zhì)激素，50_200ng/ml SCF, 50-200ng/ml Flt3-L, 10-100ng/ml BMP4, 10-100ng/ml 幾-3，10-1001^/1111幾-11和1-10單位/1111￡?0，每3-5天取細(xì)胞離心，更換新培養(yǎng)液，在換 2-5次培養(yǎng)液后收集細(xì)胞用于下一步培養(yǎng)； (3) 細(xì)胞定向培養(yǎng)：取收集的上一步培養(yǎng)的細(xì)胞，離心lOOOrpm，去上清液，換用新 的無血清SFEM培養(yǎng)液，并和以下細(xì)胞因子共同培養(yǎng)細(xì)胞：1-10 X KT6moVL糖皮質(zhì)激素， 50-200ng/mlSCF，10-100ng/ml BMP4，10-100ng/ml IL-3,IO-IOOng IL-ll，50-200ng/ml IGF-I和2-100單位/ml的EPO每2-5天換新培養(yǎng)液，在換2-5次培養(yǎng)液后，獲得有核紅細(xì) 胞，收集細(xì)胞用于下一步培養(yǎng)； (4) 取收集的上一步獲得的有核細(xì)胞，將其轉(zhuǎn)移到間充質(zhì)干細(xì)胞鋪底的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng) 3~7天，其中所用的培養(yǎng)液為含2-10單位EPO的無血清培養(yǎng)液SFEM，或者含2-10單位 EPO的加20%間充質(zhì)干細(xì)胞滋養(yǎng)液的無血清培養(yǎng)液SFEM ; (5) 取上一步培養(yǎng)的細(xì)胞在換液時(shí)使用不加任何細(xì)胞因子的培養(yǎng)液，還在間充質(zhì)干細(xì) 胞的環(huán)境下培養(yǎng)，此時(shí)擴(kuò)增生成的紅細(xì)胞，即為無核成熟的紅細(xì)胞；其中所使用的培養(yǎng)液選 自無血清培養(yǎng)液SFEM，或者加20%間充質(zhì)干細(xì)胞滋養(yǎng)液的無血清培養(yǎng)液SFEM。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備成熟紅細(xì)胞的方法，其特征在于步驟（1)所述的單個(gè)核 細(xì)胞為單獨(dú)提取自胎盤源血或者臍帶血的單個(gè)核細(xì)胞，或者為從胎盤源血或者臍帶血中提 取的單個(gè)核細(xì)胞的混合物。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備成熟紅細(xì)胞的方法，其特征在于步驟（1)采用MCS磁珠 從濃縮后的胎盤源血和臍帶血單個(gè)核細(xì)胞中分選⑶133+⑶34+的造血前體干細(xì)胞，或者采 用任何抗CD34或抗CD133的抗體和生物反應(yīng)素結(jié)合，或者和第二抗體結(jié)合從濃縮后的胎盤 單個(gè)核細(xì)胞中去分選⑶34+⑶38+，⑶34+⑶38_或⑶133 +CD34+的造血前體干細(xì)胞以及紅系干 / 祖細(xì)胞 CD34+CD72+。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備成熟紅細(xì)胞的方法，其特征在于采用MACS磁珠從濃縮后 的胎盤單個(gè)核細(xì)胞中分選⑶133+CD34 _的早期造血前體干細(xì)胞的方法為：用抗⑶133磁珠 單克隆抗體從單個(gè)核細(xì)胞中先分選出CD133陽(yáng)性細(xì)胞群，然后再?gòu)腃D133陽(yáng)性細(xì)胞群中應(yīng) 用抗⑶34磁珠單克隆抗體分選出其中的⑶133+CD34lffl胞群。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備成熟紅細(xì)胞的方法，其特征在于步驟（2)中所述的細(xì) 胞因子及其濃度為 lX10_6m〇l/L 糖皮質(zhì)激素，lOOng/ml SCF，100ng/ml Flt3-L，15ng/ml BMP4，15ng/ml IL-3，15ng/ml IL-Il 和 3 單位/ml EP0。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備成熟紅細(xì)胞的方法，其特征在于步驟（4)和步驟（5)中 所述的間充質(zhì)干細(xì)胞通過以下方法獲得：提取并培養(yǎng)胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞，待其其長(zhǎng)滿培養(yǎng) 皿，然后采用絲裂要素C滅活間充質(zhì)干細(xì)胞，使其不能再繁殖和生長(zhǎng)，然后再和定向培養(yǎng)后 的胎盤源血和臍帶血單個(gè)核細(xì)胞或造血干細(xì)胞共同培養(yǎng)置備成熟紅細(xì)胞。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備成熟紅細(xì)胞的方法，其特征在于所述的制備成熟紅細(xì)胞 的方法還包括收集無核的成熟紅細(xì)胞，用于紅細(xì)胞功能的各種鑒定以及保存無核的成熟紅 細(xì)胞。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備成熟紅細(xì)胞的方法，其特征在于所述的制備成熟紅細(xì) 胞的方法還包括對(duì)需要擴(kuò)增和制備成熟紅細(xì)胞的臍帶血和胎盤源血先做血型檢測(cè)，如果是 〇_，這樣獲得的無核成熟紅細(xì)胞為萬能用血。
9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備成熟紅細(xì)胞的方法，其特征在于無核的成熟紅細(xì)胞采用 加甘油深低溫冰箱-80-120°C保存方法；在需要細(xì)胞時(shí)，用甘油保存的細(xì)胞采用快速?gòu)?fù)溫 的方法，對(duì)無核成熟紅細(xì)胞復(fù)蘇，然后用生理鹽水洗滌去甘油。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1或5所述的制備成熟紅細(xì)胞的方法，其特征在于所述的糖皮質(zhì)激素 選自強(qiáng)多松，強(qiáng)的松龍，可的松，地塞米松，優(yōu)選地塞米松。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種制備成熟紅細(xì)胞的方法。本發(fā)明利用同源性臍帶血和胎盤源血內(nèi)的干細(xì)胞在體外用刺激因子使干細(xì)胞定向紅細(xì)胞擴(kuò)增數(shù)十萬倍，擴(kuò)增后的干細(xì)胞和紅細(xì)胞干/祖細(xì)胞在體外用刺激因子并和間充質(zhì)干細(xì)胞共同培養(yǎng)和繼續(xù)擴(kuò)增，形成成熟的紅細(xì)胞，其數(shù)量可以達(dá)到每個(gè)胎盤生成20到50個(gè)單位，每個(gè)單位1012個(gè)紅細(xì)胞，這些細(xì)胞具有正常紅細(xì)胞的功能，可以用于臨床用血。本發(fā)明為體外大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)用于臨床的成熟紅細(xì)胞提供了新方法。
【IPC分類】C12N5-078
【公開號(hào)】CN104877965
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510278947
【發(fā)明人】周勝利, 鄭超, 戚媛紅, 毛金明, 蘇建強(qiáng), 司正凱, 夏永化
【申請(qǐng)人】賽歐帕克（江蘇）干細(xì)胞生物工程有限公司
【公開日】2015年9月2日
【申請(qǐng)日】2015年5月27日