專利名稱：miR-125b在紅細(xì)胞成熟化中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體的，本發(fā)明涉及miR-125b在紅細(xì)胞成熟化中的用途。
背景技術(shù)：
戰(zhàn)傷救治和常規(guī)治療中，輸血都是及其關(guān)鍵的一個(gè)環(huán)節(jié)，我國(guó)血液供應(yīng)長(zhǎng)期處于供不應(yīng)求的狀況，近年來，我國(guó)多個(gè)城市甚至出現(xiàn)“血荒”的說法。要解決血液來源匱乏的問題，開發(fā)新的血源已經(jīng)成為當(dāng)前醫(yī)療中的迫切需要，其中干細(xì)胞研究為體外制備紅細(xì)胞提供了新希望，包括胚胎干細(xì)胞、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSC)及臍帶、骨髓、外周血來源的造血干祖細(xì)胞都可能作為種子細(xì)胞，通過大量誘導(dǎo)擴(kuò)增生成可用于移植的紅細(xì)胞。然而，目前關(guān)于成熟紅細(xì)胞的制備仍有待改進(jìn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在至少在一定程度上解決上述技術(shù)問題之一或至少提供一種有用的商業(yè)選擇。為此，本發(fā)明的一個(gè)目的在于提出一種具有能夠有效地制備成熟紅細(xì)胞的手段。本發(fā)明是基于發(fā)明人的下列發(fā)現(xiàn)而完成的:通過在紅細(xì)胞前體細(xì)胞中引入miR-125b，可以提高紅細(xì)胞脫核效率。在本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提出了一種構(gòu)建體。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該構(gòu)建體包括編碼miR-125b的核酸分子，所述miR-125b具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。由此，利用該構(gòu)建體， 可以有效地將表達(dá)miR-125b的核酸分子引入到紅細(xì)胞前體細(xì)胞中，并進(jìn)一步可以在該細(xì)胞中表達(dá)miR-125b，從而可以促進(jìn)該紅細(xì)胞前體細(xì)胞轉(zhuǎn)化為成熟的紅細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，編碼miR-125b的核酸分子具有選自SEQ ID NO:2和SEQ IDNO:3的至少一種所示的核苷酸序列。由此，可以進(jìn)一步提高表達(dá)miR-125b的效率，從而進(jìn)一步提高使得紅細(xì)胞前體細(xì)胞轉(zhuǎn)化為成熟的紅細(xì)胞的效率。在本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明提出了一種制備成熟紅細(xì)胞的方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該方法包括:使紅細(xì)胞前體細(xì)胞表達(dá)miR-125b，所述miR-125b具有SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列；以及培養(yǎng)表達(dá)miR-125b的紅細(xì)胞前體細(xì)胞，以便獲得成熟紅細(xì)胞，其中，該紅細(xì)胞前體細(xì)胞為選自原成紅細(xì)胞、嗜堿性成紅細(xì)胞、多染性成紅細(xì)胞、正染性成紅細(xì)胞和網(wǎng)織紅細(xì)胞的至少一種。由此，通過在紅細(xì)胞前體細(xì)胞中表達(dá)miR-125b，可以使得紅細(xì)胞前體細(xì)胞轉(zhuǎn)化為成熟紅細(xì)胞，從而獲得成熟紅細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)紅細(xì)胞的體外成熟化。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該制備成熟紅細(xì)胞的方法，還可以進(jìn)一步包括下列附加技術(shù)特征:根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，使紅細(xì)胞前體細(xì)胞表達(dá)miR-125b進(jìn)一步包括利用前面所述的構(gòu)建體，將編碼miR-125b的核酸分子引入到紅細(xì)胞前體細(xì)胞中。由此，可以進(jìn)一步提高在紅細(xì)胞前體細(xì)胞中表達(dá)miR-125b的效率，從而進(jìn)一步提高制備成熟紅細(xì)胞的效率。
根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述紅細(xì)胞前體細(xì)胞為成紅細(xì)胞。由此，可以進(jìn)一步提高制備成熟紅細(xì)胞的效率。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，利用添加100ng/ml的SCF、40ng/ml的IGF、5U/ml的ΕΡ0、2mM的L-谷氨酰胺、I μ M的地塞米松、40ng/ml的類脂和100 μ g/m的轉(zhuǎn)鐵蛋白的Stem span培養(yǎng)基，培養(yǎng)表達(dá)miR-125b的紅細(xì)胞前體細(xì)胞。由此，可以進(jìn)一步提高將紅細(xì)胞前體細(xì)胞轉(zhuǎn)化為成熟紅細(xì)胞的效率，進(jìn)而進(jìn)一步提高制備成熟紅細(xì)胞的效率。在本發(fā)明的第三方面，本發(fā)明還提出了前面所述的構(gòu)建體、或者miR_125b在制備成熟紅細(xì)胞中的用途。在本發(fā)明的第四方面，本發(fā)明還提出了一種用于制備成熟紅細(xì)胞的試劑盒。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該試劑盒包括:適于使紅細(xì)胞前體細(xì)胞表達(dá)miR-125b的試劑。由此，利用該試劑盒，能夠有效地通過紅細(xì)胞前體細(xì)胞表達(dá)miR-125b，可以從紅細(xì)胞前體細(xì)胞制備成熟紅細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該試劑盒還可以具有下列附加技術(shù)特征:在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述適于使紅細(xì)胞前體細(xì)胞表達(dá)miR_125b的試劑為前面所述的構(gòu)建體。由此，可以進(jìn)一步提高利用該試劑盒使得紅細(xì)胞前體細(xì)胞表達(dá)miR-125b的效率，進(jìn)而可以進(jìn)一步提高從紅細(xì)胞前體細(xì)胞制備成熟紅細(xì)胞的效率。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，可以進(jìn)一步包括:培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基為添加100ng/ml的SCF、40ng/ml的IGF、5U/ml的EP0、2mM的L-谷氨酰胺、I μ M的地塞米松、40ng/ml的類脂和100 μ g/m的轉(zhuǎn)鐵蛋白的Stem span培養(yǎng)基，其中，該培養(yǎng)基與該適于使紅細(xì)胞前體細(xì)胞表達(dá)miR-125b的試劑設(shè)置在不同的容器中。由此，可以進(jìn)一步提高將紅細(xì)胞前體細(xì)胞轉(zhuǎn)化為成熟紅細(xì)胞的效率，進(jìn)而進(jìn)一步提高制備成熟紅細(xì)胞的效率。本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點(diǎn)將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發(fā)明的實(shí)踐了解到。


本發(fā)明的上述和/或附加的方面和優(yōu)點(diǎn)從結(jié)合下面附圖對(duì)實(shí)施例的描述中將變得明顯和容易理解，其中:圖1顯示了根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例，紅細(xì)胞成熟脫核過程中，miR-125b內(nèi)源性表達(dá)檢測(cè)的結(jié)果，其中，A.臍帶血來源的造血干細(xì)胞在14天的紅系誘導(dǎo)過程中紅細(xì)胞表面標(biāo)志⑶71/⑶235表達(dá)的檢測(cè)結(jié)果，B.未分化的造血干細(xì)胞以及紅系分化不同成熟階段的紅細(xì)胞的miR-125b表達(dá)的檢測(cè)結(jié)果，C.TF-1細(xì)胞及其經(jīng)紅系誘導(dǎo)分化體系誘導(dǎo)分化的第一階段的表面標(biāo)志⑶71/⑶235的表達(dá)檢測(cè)結(jié)果，以及第二階段的表面標(biāo)志⑶71陽性/核標(biāo)志LDS751陰性的表達(dá)檢測(cè)結(jié)果，D.TF-1細(xì)胞及其經(jīng)紅系誘導(dǎo)分化體系誘導(dǎo)分化的兩個(gè)階段的細(xì)胞的miR-125b表達(dá)的檢測(cè)結(jié)果；圖2顯示了根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例，紅白血病細(xì)胞K562中過表達(dá)miR_125b對(duì)紅系分化和脫核影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其中，A.穩(wěn)定過表達(dá)miR-125b的K562細(xì)胞經(jīng)紅系誘導(dǎo)分化后的聯(lián)苯胺染色結(jié)果，B.過表達(dá)miR-125b的細(xì)胞經(jīng)紅系誘導(dǎo)分化后的表面標(biāo)志⑶71/CD235雙陽性細(xì)胞的流式細(xì)胞 術(shù)檢測(cè)結(jié)果，C.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)LDS751陰性/CD71陽性的脫核細(xì)胞比例的結(jié)果，D.實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)基因修飾的K562細(xì)胞系中miR-125b的表達(dá)情況，E.實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)過表達(dá)miR-125b的K562細(xì)胞經(jīng)紅系誘導(dǎo)分化后α和γ血紅蛋白的表達(dá)情況；以及圖3顯示了根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例，過表達(dá)miR_125b的成紅細(xì)胞與轉(zhuǎn)染隨機(jī)對(duì)照(NO組進(jìn)一步誘導(dǎo)成熟后的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果。
具體實(shí)施例方式下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)施例，這些實(shí)施例旨在用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制。本發(fā)明是基于發(fā)明人對(duì)紅細(xì)胞成熟的深入研究而完成的。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，多種類型的干細(xì)胞誘導(dǎo)生成的成紅細(xì)胞(erythiOblast)，若要在體外環(huán)境下成為成熟紅細(xì)胞，脫核是關(guān)鍵的一步:因?yàn)橛泻思t細(xì)胞的攜氧能力低于脫核紅細(xì)胞，而且有核紅細(xì)胞在跨越狹窄的毛細(xì)血管時(shí)容易發(fā)生溶血；此外，由于脫核細(xì)胞丟失了染色體和分裂能力，移植后導(dǎo)致受者惡性轉(zhuǎn)化的風(fēng)險(xiǎn)也明顯降低。雖然紅細(xì)胞的脫核成熟對(duì)于輸注應(yīng)用意義重大，但是迄今為止在誘導(dǎo)干細(xì)胞紅系分化的體系中，只有在基質(zhì)細(xì)胞的輔助下誘導(dǎo)造血干祖細(xì)胞能實(shí)現(xiàn)較為高效的成熟和脫核，而無基質(zhì)細(xì)胞體系、或是以胚胎干細(xì)胞、iPSC為起始細(xì)胞的誘導(dǎo)體系中，紅細(xì)胞成熟和脫核效率仍然很低。在生理?xiàng)l件下，造血干細(xì)胞向紅系定向分化的過程經(jīng)歷了原成紅細(xì)胞(也稱為原始紅細(xì)胞)(proerythroblast)—嗜堿性成紅細(xì)胞(也稱為早幼紅細(xì)胞)(basophilic erythroblast)—多染性成紅細(xì)胞(也稱為中幼紅細(xì)胞)(ploychromatophilic erythroblast)—正染性成紅細(xì)胞(也稱為晚幼紅細(xì)胞)(orhtochromatic erythroblast)—網(wǎng)織紅細(xì)胞(rticulocyte)—成熟紅細(xì)胞(redbloodcells)幾個(gè)階段，其中具有攜氧作用的血紅蛋白的產(chǎn)生起始于早幼紅細(xì)胞階段，而細(xì)胞核的排出則發(fā)生在網(wǎng)織紅細(xì)胞階段。血紅蛋白的生成和細(xì)胞核的排出是紅細(xì)胞成熟的指標(biāo)。其中，脫核過程又可以具體到細(xì)胞核凝集、核極化、膜蛋白聚類、核排出并被巨噬細(xì)胞吞噬幾個(gè)階段。目前，關(guān)于脫核過程的機(jī) 制仍不明確。微小RNA(microRNA, miRNA)是一種廣泛存在于動(dòng)植物中的內(nèi)源性非編碼RNA，它們通常靶向一個(gè)或者多個(gè)mRNA，發(fā)揮抑制作用。研究發(fā)現(xiàn)，在造血分化中，miRNA的表達(dá)也發(fā)生有規(guī)律的變化，它們通過瞄靶轉(zhuǎn)錄因子、生長(zhǎng)因子受體以及響應(yīng)細(xì)胞外刺激的特異轉(zhuǎn)錄本發(fā)揮作用。在紅系發(fā)育調(diào)控中，miR-150、miR-155、miR-221和miR-222在紅系分化和成熟過程中下調(diào)表達(dá)，miR-451 (紅系特異表達(dá))和miR-16 (網(wǎng)織紅細(xì)胞中特異表達(dá))隨紅系分化上調(diào)，而miR-339和miR-378則表現(xiàn)出分階段表達(dá)模式。此外，miR-191是目前報(bào)道的對(duì)紅細(xì)胞脫核有關(guān)鍵促進(jìn)作用的微小RNA，它通過下調(diào)Riok3和Mxil發(fā)揮作用，而Riok3和Mxil都能調(diào)控組蛋白的乙?；?、促進(jìn)細(xì)胞核凝集，從而產(chǎn)生促脫核的效應(yīng)。miR-125b (其核酸序列如SEQ ID NO:1所示)是發(fā)育分化調(diào)控和腫瘤生發(fā)研究中的一個(gè)明星分子，來自不同研究小組的報(bào)道顯示，miR-125b能調(diào)控中內(nèi)胚層、神經(jīng)、造骨細(xì)胞、脂肪、造血干/祖細(xì)胞等多種干細(xì)胞的分化，在造血系統(tǒng)中miR-125b也發(fā)揮重要的調(diào)控作用:miR-125b及其同系物miR-125a在HSC中高表達(dá)，而隨著前體細(xì)胞的分化發(fā)育其表達(dá)逐漸降低。在小鼠HSC中過表達(dá)miR-125b能擴(kuò)增HSC和傾向淋系分化的干/祖細(xì)胞亞群，它靶向兩個(gè)促凋亡分子Bmf和KLF 13的mRNA，其抗凋亡效應(yīng)在傾向淋系分化的HSC亞群中更加顯著。過表達(dá)miR-125b還能干擾人原代⑶34+細(xì)胞的分化，抑制HL60和NB4白血病細(xì)胞系向單核和粒系的終末分化。對(duì)miR-125a的過表達(dá)同樣能通過抗凋亡的機(jī)制擴(kuò)增HSC組分，其效應(yīng)可能是通過靶向促凋亡基因Bakl實(shí)現(xiàn)的?？梢妋iR-125b能調(diào)控干細(xì)胞池的規(guī)模并賦予移植的造血細(xì)胞競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)。miR-125b的表達(dá)異常則參與多種白血病的發(fā)生。大量關(guān)于miR-125b調(diào)控機(jī)制的研究證實(shí)，miR-125b對(duì)p53信號(hào)網(wǎng)絡(luò)中的多個(gè)分子都可能發(fā)揮調(diào)控作用，在miR_125b的祀基因中，與凋亡相關(guān)的包括Bakl、Igfbp3、Itch、Puma、Prkra、Tp53inpl、Tp53、Zac I,而與細(xì)胞周期相關(guān)的包括 eye I in C、Cdc25c、Cdkn2c、Ednl、Ppplca、Selll0正是由于其靶基因的復(fù)雜性，miR-125b功能的最終體現(xiàn)還需要根據(jù)其所在細(xì)胞的特性決定。miR-125b對(duì)于紅系細(xì)胞的作用研究相對(duì)較少，Klusmann等人的研究提示，miR-125b_2 對(duì)紅系 / 巨核共祖細(xì)胞(megakaryocytic/erythroid progenitors, MEPs)的增殖和自我更新有促進(jìn)作用。本發(fā)明的發(fā)明人通過對(duì)由造血干細(xì)胞誘導(dǎo)生成的紅細(xì)胞的連續(xù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，miR-125b隨紅系分化逐漸下調(diào)，但在成熟紅細(xì)胞中卻維持很高的表達(dá)水平；同時(shí)我們也發(fā)現(xiàn)紅白血病細(xì)胞TF-1與基質(zhì)細(xì)胞0P9共培養(yǎng)之后伴隨脫核細(xì)胞比例的提高miR-125b的表達(dá)也明顯提高，這些結(jié)果暗示該非編碼RNA參與了脫核調(diào)控(圖1)，過表達(dá)miR-125b的紅白血病細(xì)胞系K562在紅系誘導(dǎo)條件下能表達(dá)出大量的α、y血紅蛋白，紅系表面標(biāo)志⑶71的表達(dá)明顯提高，與對(duì)照組相比，其脫核效率也出現(xiàn)明顯提高(圖2)，在臍帶血來源的紅系祖細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染miR-125b mimics(其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示),發(fā)明人同樣也觀察到脫核效率的提聞。由此，本發(fā)明提出了通過引入miR_125b來提高造血干細(xì)胞/胚胎干細(xì)胞的紅系誘導(dǎo)分化和紅細(xì)胞脫核效率，高效獲得功能性紅細(xì)胞(即成熟紅細(xì)胞)的技術(shù)方案，實(shí)現(xiàn)大規(guī)模紅細(xì)胞誘導(dǎo)擴(kuò)增，滿足臨床需求也有重要意義。構(gòu)建體在本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提出了一種構(gòu)建體。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該構(gòu)建體包括編碼miR_125b的核酸分子(在本文中也可以稱為目的核酸分子)，所述miR_125b具有SEQ ID NO:1 (UCCCUGAGACCCUAACUUGUGA)所示的核苷酸序列。由此，利用該構(gòu)建體，可以有效地將表達(dá)miR-125b的核酸分子引入到紅細(xì)胞前體細(xì)胞中，進(jìn)一步可以在該細(xì)胞中表達(dá)miR-125b，從而可以使得該紅細(xì)胞前體細(xì)胞轉(zhuǎn)化為成熟的紅細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，編碼 miR-125b 的核酸分子具有選自 SEQ ID NO:2(TGCGCTCCTCTCAGTCCCTGAGACCCTAACTTGTGATGTTTACCGTTTAAATCCACGGGTTAGGCTCTTGGGAGCTGCGAGTCGTGCT^PSEQ ID NO:3(ACCAGACTTTTCCTAGTCCCTGAGACCCTAACTTGTGAGGTATTTTAGTAACATCACAAGTCAGGCTCTTGGGACCTAGGCGGAGGGGA)的至少一種所示的核苷酸序列。由此，可以進(jìn)一步提高表達(dá)miR-125b的效率，從而能夠進(jìn)一步提高使得紅細(xì)胞前體細(xì)胞轉(zhuǎn)化為成熟的紅細(xì)胞的效率。術(shù)語“構(gòu)建體”意指能夠運(yùn)輸與之連接的另一種核酸(目的核酸分子)的核酸分子。一種類型的構(gòu)建體是“質(zhì)?！保噶硗獾腄NA區(qū)段可以連接到其內(nèi)的環(huán)狀雙鏈DNA環(huán)。另一種類型的構(gòu)建體是病毒構(gòu)建體，其中另外的DNA區(qū)段可以連接到病毒基因組內(nèi)。某些構(gòu)建體能夠在它們已引入其內(nèi)的 宿主細(xì)胞中自主復(fù)制(例如，具有細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)的細(xì)菌構(gòu)建體和游離型哺乳動(dòng)物構(gòu)建體)。其他構(gòu)建體(例如非游離型哺乳動(dòng)物構(gòu)建體)在引入宿主細(xì)胞內(nèi)后可以整合到宿主細(xì)胞基因組內(nèi)，且因此連同宿主基因組一起進(jìn)行復(fù)制。此外，某些構(gòu)建體能夠指導(dǎo)它們與之可操作地連接的基因表達(dá)。一般而言，在重組DNA技術(shù)中使用的表達(dá)構(gòu)建體通常為質(zhì)粒的形式。在本說明書中，“質(zhì)?！焙汀皹?gòu)建體”可以互換使用，因?yàn)橘|(zhì)粒是最常用的構(gòu)建體形式。然而，本發(fā)明預(yù)期包括此種其他形式的表達(dá)構(gòu)建體，例如提供等價(jià)功能的病毒構(gòu)建體(例如復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺伴隨病毒)。構(gòu)建體的RNA形式(其包括RNA病毒構(gòu)建體)也可在本發(fā)明中發(fā)現(xiàn)用途。在本發(fā)明中所使用的術(shù)語“核酸”可以是任何包含脫氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸的聚合物，包括但不限于經(jīng)過修飾的或者未經(jīng)修飾的DNA、RNA，其長(zhǎng)度不受任何特別限制。對(duì)于用于構(gòu)建體，優(yōu)選所述核酸為DNA，因?yàn)镈NA相對(duì)于RNA而言，其更穩(wěn)定，并且易于操作。另外，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例的表達(dá)構(gòu)建體還可以進(jìn)一步包含其他的元件，從而為表達(dá)構(gòu)建體賦予額外的有益效果。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)需要，選擇這些元件在表達(dá)構(gòu)建體上與編碼miR_125b的核酸分子的相對(duì)位置。即可以設(shè)置在編碼miR_125b的核酸分子的上游，也可以設(shè)置在編碼miR-125b的核酸分子的下游，只要這些元件能夠發(fā)揮其相應(yīng)的功能即可。在本發(fā)明中所使用的術(shù)語“5’側(cè)”可以與“上游”互換使用，“3’側(cè)”可以與“下游”互換使用。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，表達(dá)構(gòu)建體可以進(jìn)一步包含啟動(dòng)子序列，所述啟動(dòng)子序列與所述編碼miR-125b的核酸分子可操作地相連。在本發(fā)明中所使用的術(shù)語“啟動(dòng)子”指的是這樣一種核酸序列，其能夠指導(dǎo)與其可操縱地連接的核酸分子的轉(zhuǎn)錄。在本發(fā)明中所使用的術(shù)語“可操縱地”指的是核酸表達(dá)控制序列例如啟動(dòng)子、信號(hào)序列、增強(qiáng)子等與目標(biāo)核酸序列之間的功能連接，其中當(dāng)合適的分子例如轉(zhuǎn)錄活化分子與表達(dá)控制序列結(jié)合時(shí)，表達(dá)控制序列影響著對(duì)應(yīng)于目標(biāo)核酸序列的核酸的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。由此，可以直接通過表達(dá)構(gòu)建體在動(dòng)物細(xì)胞中弓I入特定的啟動(dòng)子，并且該啟動(dòng)子可以用于啟動(dòng)編碼miR-125b的核酸分子的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，由此，可以提高所獲得的重組細(xì)胞中編碼miR-125b的核酸分子的表達(dá)效率。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)例，所述啟動(dòng)子為CAG啟動(dòng)子。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，當(dāng)采用該啟動(dòng)子時(shí)，可以有效地在動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)miR-125b。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，表達(dá)構(gòu)建體可以進(jìn)一步包括編碼報(bào)告蛋白的序列。在本發(fā)明中所使用的術(shù) 語“報(bào)告蛋白”是指這樣的一種蛋白質(zhì)，其在表達(dá)后，能夠產(chǎn)生可以直接或者間接檢測(cè)的信號(hào)，進(jìn)而能夠反映表達(dá)構(gòu)建體所攜帶的外源核酸序列是否已經(jīng)在細(xì)胞中被成功表達(dá)。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，報(bào)告蛋白的種類并不受特別限制，只要其具有可檢測(cè)的活性即可。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，報(bào)告蛋白可以是一種能夠產(chǎn)生光學(xué)信號(hào)的蛋白質(zhì)例如發(fā)光蛋白或者熒光蛋白例如綠色熒光蛋白等?；蛘邎?bào)告蛋白可以是一種能夠與底物相互作用以產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)的酶，例如IacZ基因編碼的β_半乳糖苷酶。β_半乳糖苷酶能催化一系列底物轉(zhuǎn)化成極易檢測(cè)的不同顏色的產(chǎn)物。但是IacZ在細(xì)胞內(nèi)本底表達(dá)較高，并且檢測(cè)需要破碎細(xì)胞壁，從而限制了其應(yīng)用。因而，根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，報(bào)告蛋白可以為選自發(fā)光蛋白、熒光蛋白、酶的至少一種。由此，可以根據(jù)常規(guī)的方法，對(duì)所述報(bào)告蛋白進(jìn)行監(jiān)測(cè)。例如可以采用:比色法、熒光法、生物發(fā)光法、化學(xué)發(fā)光法、酶聯(lián)免疫法(ELISA)及原位染色法對(duì)報(bào)告蛋白進(jìn)行檢測(cè)。這其中，優(yōu)選發(fā)光蛋白，因?yàn)榘l(fā)光蛋白能夠發(fā)出特定波長(zhǎng)的光，因而能夠容易對(duì)發(fā)光蛋白進(jìn)行檢測(cè)，并且容易對(duì)其進(jìn)行定量檢測(cè)。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，報(bào)告蛋白為綠色熒光蛋白。由此，可以便捷地通過熒光顯微鏡，就能夠確定表達(dá)構(gòu)建體所攜帶的外源核酸序列是否已經(jīng)在細(xì)胞中被成功表達(dá)。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，表達(dá)構(gòu)建體可以進(jìn)一步包括篩選標(biāo)記基因。在本發(fā)明中所使用的術(shù)語“篩選標(biāo)記基因”指的是這樣的一種基因，其編碼的產(chǎn)物能夠賦予連同構(gòu)建體接受該基因的細(xì)胞一種特殊的性質(zhì)，該特殊的性質(zhì)使得接受該基因的細(xì)胞與未接受該基因的細(xì)胞很容易被區(qū)分開。由此，便于篩選接受表達(dá)構(gòu)建體的動(dòng)物細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，篩選標(biāo)記基因的類型不受特別限制，根據(jù)本發(fā)明的一些示例，所述篩選標(biāo)記基因?yàn)樗幬锟剐曰?。由此，容易地通過接受外源表達(dá)構(gòu)建體的重組細(xì)胞的抗藥性來進(jìn)行篩選，例如在培養(yǎng)基中添加抗生素，則相應(yīng)連同構(gòu)建體接受并表達(dá)抗生素抗性基因的細(xì)胞將在培養(yǎng)基上能夠存活下來。根據(jù)本發(fā)明的具體示例，所述篩選標(biāo)記基因?yàn)樾旅顾乜剐曰?。由此，能夠進(jìn)一步提高篩選接受外源表達(dá)構(gòu)建體的重組細(xì)胞的效率。制備成熟紅細(xì)胞的方法在本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明提出了一種制備成熟紅細(xì)胞的方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該方法包括:首先，使紅細(xì)胞前體細(xì)胞表達(dá)miR-125b，該miR-125b具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。在本文中所使用的術(shù)語“紅細(xì)胞前體細(xì)胞”應(yīng)做廣義理解，其可以為任何可以用來制備成熟紅細(xì)胞的細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，紅細(xì)胞前體細(xì)胞可以為選自原成紅細(xì)胞、嗜堿性成紅細(xì)胞、多染性成紅細(xì)胞、正染性成紅細(xì)胞和網(wǎng)織紅細(xì)胞的至少一種。這些紅細(xì)胞前體細(xì)胞，可以是從生物體例如人分離的，也可以是通過干細(xì)胞的分化獲得的。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，可以由生物體的血液直接提取或通過誘導(dǎo)多能干/祖細(xì)胞獲得前述紅細(xì)胞前體細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述紅細(xì)胞前體細(xì)胞為成紅細(xì)胞。由此，可以進(jìn)一步提高制備成熟紅細(xì)胞的效率。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，使紅細(xì)胞前體細(xì)胞表達(dá)的方法并不受特別限制?？梢酝ㄟ^向細(xì)胞中引入可以表達(dá)miR-125b的核酸分子，也可以直接將miR-125b引入到細(xì)胞中來實(shí)現(xiàn)。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，可以利用前面所述的構(gòu)建體，將編碼miR-125b的核酸分子引入到所述紅細(xì)胞前體細(xì)胞中。由此，可以進(jìn)一步提高在紅細(xì)胞前體細(xì)胞中表達(dá)miR-125b的效率，從而進(jìn)一步提高制備成熟紅細(xì)胞的效率。將構(gòu)建體引入到細(xì)胞中的方法可以包括但不限于，吸收質(zhì)粒穿過細(xì)胞膜、病毒感染、電穿孔、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染和粒子轟擊。接下來，培養(yǎng)上述表達(dá)miR_125b的紅細(xì)胞前體細(xì)胞，以便獲得成熟紅細(xì)胞。由此，通過在紅細(xì)胞前體細(xì)胞中表達(dá)miR-125b，可以使得紅細(xì)胞前體細(xì)胞轉(zhuǎn)化為成熟紅細(xì)胞，從而獲得成熟紅細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)紅細(xì)胞的體外成熟化。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，培養(yǎng)表達(dá)miR-125b的紅細(xì)胞前體細(xì)胞的方法并不受特別限制。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，利用添加100ng/ml的SCF、40ng/ml的IGF、5U/ml的EP0、2mM的L-谷氨酰胺、I μ M的地塞米松、40ng/ml的類脂和100 μ g/m的轉(zhuǎn)鐵蛋白的Stem span培養(yǎng)基，培養(yǎng)所述表達(dá)miR_125b的紅細(xì)胞前體細(xì)胞。由此，可以進(jìn)一步提聞將紅細(xì)胞如體細(xì)胞轉(zhuǎn)化為成熟紅細(xì)胞的效率，進(jìn)而進(jìn)一步提聞制備成熟紅細(xì)胞的效率。由此，在本發(fā)明的第三方面，本發(fā)明還提出了前面所述的構(gòu)建體、或者miR_125b在制備成熟紅細(xì)胞中的用途。在本發(fā)明的第四方面， 本發(fā)明還提出了一種用于制備成熟紅細(xì)胞的試劑盒。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該試劑盒包括:適于使紅細(xì)胞前體細(xì)胞表達(dá)miR-125b的試劑。由此，利用該試劑盒，能夠有效地通過紅細(xì)胞前體細(xì)胞表達(dá)miR-125b，可以從紅細(xì)胞前體細(xì)胞制備成熟紅細(xì)胞。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述適于使紅細(xì)胞前體細(xì)胞表達(dá)miR-125b的試劑為前面所述的構(gòu)建體。由此，可以進(jìn)一步提高利用該試劑盒使得紅細(xì)胞前體細(xì)胞表達(dá)miR-125b的效率，進(jìn)而可以進(jìn)一步提高從紅細(xì)胞前體細(xì)胞制備成熟紅細(xì)胞的效率。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，可以進(jìn)一步包括:培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基為添加100ng/ml的SCF、40ng/ml的IGF、5U/ml的EP0、2mM的L-谷氨酰胺、I μ M的地塞米松、40ng/ml的類脂和100 μ g/m的轉(zhuǎn)鐵蛋白的Stem span培養(yǎng)基，其中，該培養(yǎng)基與該適于使紅細(xì)胞前體細(xì)胞表達(dá)miR_125b的試劑設(shè)置在不同的容器中。由此，可以進(jìn)一步提高將紅細(xì)胞前體細(xì)胞轉(zhuǎn)化為成熟紅細(xì)胞的效率，進(jìn)而進(jìn)一步提聞制備成熟紅細(xì)胞的效率。下面參考具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說明，需要說明的是，這些實(shí)施例僅僅是說明性的，而不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制。若未特別指明，實(shí)施例中所采用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，例如可以參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第三版或者相關(guān)產(chǎn)品進(jìn)行，所采用的試劑和產(chǎn)品也均為可商業(yè)獲得的。未詳細(xì)描述的各種過程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法，所用試劑的來源、商品名以及有必要列出其組成成分者，均在首次出現(xiàn)時(shí)標(biāo)明，其后所用相同試劑如無特殊說明，均以首次標(biāo)明的內(nèi)容相同。實(shí)施例1:內(nèi)源性miR_125b的表達(dá)隨紅細(xì)胞成熟上調(diào)一、從新鮮的臍帶血(24小時(shí)內(nèi))中按照標(biāo)準(zhǔn)的操作的步驟分離MNC細(xì)胞(需要時(shí)用磁珠分離CD34+細(xì)胞)。分離步驟如下所示:1、混合，沉降新鮮抗凝的臍帶血標(biāo)本一份與PBS按照1:1等體積比例混合后，再加入總體積1/4的0.5%甲基纖維素。顛倒混勻后，室溫靜置30分鐘直，至沉降直界限分明。小心吸出上清至50ml離心管中，待接近界面時(shí)可用小吸管吸取，防止吸取紅細(xì)胞。之后1800rpm,離心5分鐘。`2、重懸，梯度離心棄上清，每管加入5ml PBS重懸細(xì)胞。取15ml離心管，每管加入預(yù)熱人淋巴細(xì)胞分離液5ml，輕柔將細(xì)胞懸液加到人淋巴細(xì)胞分離液液面之上。室溫離心，1800rpm,離心25分鐘，為保持不打破密度梯度，應(yīng)最慢速升降離心機(jī)的轉(zhuǎn)速。3、收集 MNC離心完畢，離心管內(nèi)上層為透明液體，下層為其他細(xì)胞，中間為白色薄膜層，即MNC層。將各管MNC曾細(xì)胞集中于I管，加入PBS重懸至15ml體積，1800rpm，離心5分鐘，棄去殘余的淋巴細(xì)胞分離液，再用PBS清洗細(xì)胞一次，將細(xì)胞重懸至IOml取10 μ I計(jì)數(shù)細(xì)胞。4、從MNC細(xì)胞中分離臍帶血造血干細(xì)胞(采用miniMACS分離系統(tǒng)，MiltenylBiotec)(I)、標(biāo)記抗體，孵育參照CD34+MicroBead Kit (貨號(hào) 140-000-672.05Miltenyl Boitec 公司)說明書，將單個(gè)核細(xì)胞按照每108cells重懸于300 μ I體積4°C 8°C預(yù)溫半小時(shí)的除氣PBS，加入FcR Blocking Reagent 及 CD 34MicroBeads 各 100 μ I 的比例與抗體混合，4°C旋轉(zhuǎn)孵育 30分鐘。(2 )、分離 CD 34+ 細(xì)胞向孵育體系內(nèi)加入PBS，重懸至L 5ml，充分混勻后，1800rpm,離心5分鐘，依照此方法，洗滌細(xì)胞2次。按照每lOScells重懸于500 μ I體積細(xì)胞分離緩沖液重懸細(xì)胞。將分離柱MS Column安裝于磁力架上，使用2ml細(xì)胞分離緩沖液濕潤(rùn)分離柱后，將單個(gè)核細(xì)胞懸液緩緩沿分離柱內(nèi)壁加入，避免產(chǎn)生氣泡。待其自然流出后，使用Iml除氣的PBS沖洗分離柱3次，以便將未結(jié)合的單個(gè)核細(xì)胞沖洗出分離柱。(3)、加壓洗脫將分離柱移出磁場(chǎng)，依次置于三個(gè)Ep管上，每管用Iml PBS加壓洗脫，之后1800rpm離心5分鐘，最后將細(xì)胞重懸至1ml，計(jì)數(shù)細(xì)胞。(4)、純度分析I)由于每次分出的細(xì)胞數(shù)不一定，如果細(xì)胞過少，可以考慮用CD34+細(xì)胞的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞1-2天，使細(xì)胞增殖后進(jìn)行流式的檢測(cè)。2)流式檢測(cè)時(shí)可將4 5X105細(xì)胞懸浮平分到2個(gè)1.5ml Ep管，每管中加90μ1PBS ；3)分別加入 5 μ I CD34-FITC 和 5 μ I CD38-PE，另一個(gè) Ep 管中加入 5 μ I PE 和5 μ I FITC標(biāo)記的小鼠IgG作為對(duì)照。充分混勻后，4°C避光標(biāo)記30分鐘；4)待標(biāo)記時(shí)間到后，用PBS重懸至1.5ml洗滌細(xì)胞，1800轉(zhuǎn)離心5分鐘；之后進(jìn)行2次重復(fù)洗滌。5)最后將細(xì)胞重懸于500 μ I PBS中，流式細(xì)胞儀檢測(cè)造血干細(xì)胞的比例。若不能當(dāng)天進(jìn)行流式檢測(cè)，可以用2%新鮮配制的多聚甲醛溶液重懸細(xì)胞，4°C避光保存，之后進(jìn)行流式檢測(cè)。之后將分離/磁珠分選獲得的MNC/CD34+細(xì)胞于紅系誘導(dǎo)分化的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)14天。再進(jìn)行流式檢測(cè)，檢測(cè)標(biāo)志為⑶71和⑶235，結(jié)果見圖1A。圖1A顯示了臍帶血來源的造血干細(xì)胞在14天的紅系誘導(dǎo)過程中紅細(xì)胞表面標(biāo)志⑶71/⑶235表達(dá)的檢測(cè)結(jié)果。從圖1A中可以看到，隨著紅系培養(yǎng)天數(shù)的增加，紅系相關(guān)標(biāo)志⑶71和⑶235的比例上調(diào)，在14天時(shí)雙陽性細(xì)胞的比例已經(jīng)超過70%，⑶71-⑶235-細(xì)胞的比例小于10%。這說明在該時(shí)間點(diǎn)，大部分的細(xì)胞都已經(jīng)是紅系的細(xì)胞，并且雙陽性細(xì)胞的比例較高，已經(jīng)將細(xì)胞誘導(dǎo)至前紅細(xì)胞階段。二、收集⑶34及紅系誘導(dǎo)14天后經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)分選的⑶71+/⑶235-細(xì)胞、⑶71+/⑶235+細(xì)胞、臍血中紅細(xì)胞，進(jìn)行RNA的提取、microRNA的反轉(zhuǎn)錄，之后實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)microRNA-125b的表達(dá)水平，結(jié)果見圖1B。如圖1B所示，以U6為內(nèi)參，可以看出同起始細(xì)胞(⑶34+細(xì)胞)相比較，紅細(xì)胞中micorRNA-125b的表達(dá)水平是非常高的。三、TF-1細(xì)胞在紅系的誘導(dǎo)分化體系下進(jìn)行紅系的誘導(dǎo)分化，其誘導(dǎo)分化體系為:誘導(dǎo)紅系分化階段:RPMI1640添加10%FBS及5U/ml EPO培養(yǎng)6天，細(xì)胞起始培養(yǎng)密度IXlOVml ;誘導(dǎo)脫核階段，將上一階段獲得的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至0P9基質(zhì)細(xì)胞層上，以RPMI1640添加10%FBS培養(yǎng)4天，細(xì)胞起始培養(yǎng)密度3 X 105/ml。對(duì)各階段獲得的細(xì)胞均進(jìn)行流式細(xì)胞檢測(cè)，結(jié)果見圖1C。圖1C顯示了 TF-1細(xì)胞及其經(jīng)紅系誘導(dǎo)分化體系誘導(dǎo)分化的第一階段的表面標(biāo)志CD71/CD235的表達(dá)檢測(cè)結(jié)果，以及第二階段的表面標(biāo)志 CD71陽性/核標(biāo)志LDS751陰性的表達(dá)檢測(cè)結(jié)果，其中，從下至上，第一張圖為TF-1細(xì)胞的表面標(biāo)志⑶71/⑶235的表達(dá)檢測(cè)結(jié)果，第二張圖為TF-1細(xì)胞經(jīng)紅系誘導(dǎo)分化體系誘導(dǎo)分化的第一階段的表面標(biāo)志CD71/CD235的表達(dá)檢測(cè)結(jié)果，第三張圖為TF-1細(xì)胞經(jīng)紅系誘導(dǎo)分化體系誘導(dǎo)分化的第二階段的表面標(biāo)志CD71陽性/核標(biāo)志LDS751陰性的表達(dá)檢測(cè)結(jié)果。由IC可知，第一階段誘導(dǎo)結(jié)束，能獲得較高比例⑶71/⑶235雙陽性細(xì)胞，提示TF-1細(xì)胞被成功誘導(dǎo)成紅系祖細(xì)胞；至第二階段誘導(dǎo)結(jié)束，有較高比例⑶71+/LDS751-細(xì)胞出現(xiàn)，即脫核的紅細(xì)胞。表明，紅白血病細(xì)胞TF-1與基質(zhì)細(xì)胞0P9共培養(yǎng)后紅系表面標(biāo)志⑶71/⑶235表達(dá)提高，同時(shí)出現(xiàn)核染料LDS751染色陰性的脫核紅細(xì)胞。然后，對(duì)誘導(dǎo)前后的細(xì)胞提取RNA檢測(cè)內(nèi)源性miR-125b的表達(dá)，結(jié)果見圖1D。圖1D顯示了 TF-1細(xì)胞及其經(jīng)紅系誘導(dǎo)分化體系誘導(dǎo)分化的兩個(gè)階段的細(xì)胞經(jīng)定量PCR檢測(cè)的miR-125b表達(dá)的結(jié)果。由圖1D可知，隨紅細(xì)胞成熟和脫核，miR_125b表達(dá)逐漸提高，提示miR-125b的表達(dá)可能調(diào)控紅細(xì)胞成熟和脫核。實(shí)施例2:外源過表達(dá)miR_125b促進(jìn)紅白血病細(xì)胞K562的紅系成熟和脫核一、細(xì)胞轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定株篩選:1.K562細(xì)胞以添加10%胎牛血清(FBS)的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，每3天1:5傳代。2.轉(zhuǎn)染時(shí)，取3X105K562細(xì)胞以1.5ml培養(yǎng)基重懸，置于6孔板中，4yg質(zhì)粒和10 μ I脂質(zhì)體lipofectamin2000分別與250 μ I optiMEM混合,室溫孵育5min后再混勻，靜置室溫20min，滴加到細(xì)胞懸液上。轉(zhuǎn)染次日換液，48小時(shí)后添加G418篩選轉(zhuǎn)染陽性細(xì)胞，篩選濃度為500μ g/ml。3周后獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染、表達(dá)外源基因的K562細(xì)胞株。二、對(duì)獲得的K562細(xì)胞進(jìn)行紅系誘導(dǎo)和脫核，誘導(dǎo)方案如下:1.第一階段:細(xì)胞以I X 105/ml的密度進(jìn)行紅系誘導(dǎo)，誘導(dǎo)培養(yǎng)基為RPMI1640，添力口 10% FBS、0.1 μ g/ml araC、40 μ M hemin,培養(yǎng) 6 天。

2.第二階段:取第一階段獲得的細(xì)胞，調(diào)整密度到3X105/ml，繼續(xù)誘導(dǎo)紅細(xì)胞脫核，誘導(dǎo)培養(yǎng)基為 RPMI1640，添力口 10% FBS、40yM hemin、I μ g/mlcytoB、210mM DMSO，培養(yǎng)4天。3.轉(zhuǎn)染獲得的穩(wěn)定細(xì)胞株經(jīng)實(shí)時(shí)定量PCR確定microRNA及功能基因的表達(dá)水平。K562細(xì)胞誘導(dǎo)結(jié)束后經(jīng)聯(lián)苯胺染色及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，確定紅系分化效率及紅細(xì)胞脫核效率，結(jié)果見圖2。圖2顯示了紅白血病細(xì)胞K562中過表達(dá)miR-125b對(duì)紅系分化和脫核影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其中A.穩(wěn)定過表達(dá)miR-125b的K562細(xì)胞經(jīng)紅系誘導(dǎo)分化后的聯(lián)苯胺染色結(jié)果，B.過表達(dá)miR-125b的細(xì)胞經(jīng)紅系誘導(dǎo)分化后的表面標(biāo)志⑶71/⑶235雙陽性細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果，C.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)LDS751陰性/CD71陽性的脫核細(xì)胞比例的結(jié)果，D.實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)基因修飾的K562細(xì)胞系中miR-125b的表達(dá)情況，E.實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)過表達(dá)miR-125b的K562細(xì)胞中經(jīng)紅系誘導(dǎo)分化后α和γ血紅蛋白的表達(dá)情況。如圖2所示，A顯示了小分子hemin及ara_C、細(xì)胞松弛素B、DMSO誘導(dǎo)穩(wěn)定過表達(dá)miR_125b的K562細(xì)胞分化脫核，誘導(dǎo)10天后，過表達(dá)組細(xì)胞直徑縮小，棕色的聯(lián)苯胺(血紅蛋白指示齊U)染色陽性細(xì)胞比例明顯提高顯示了表面標(biāo)志流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果，過表達(dá)miR-125b的細(xì)胞CD71/CD235雙陽性細(xì)胞比例增加，提示紅系分化效率提高；C顯示了流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)LDS751陰性/⑶71陽性的脫核細(xì)胞比例，miR-125b的過表達(dá)明顯提高了紅細(xì)胞脫核效率山顯示了實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)基因修飾的K562細(xì)胞系中miR-125b的表達(dá)情況；E顯示了實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)結(jié)果，miR-125b的過表達(dá)提高了 K562細(xì)胞中α和γ血紅蛋白的表達(dá)。因此，由圖2可知，miR-125b的過表達(dá)(圖2D)顯著提高了 K562細(xì)胞的血紅蛋白表達(dá)水平(圖2A、E)，⑶71/⑶235雙陽性細(xì)胞比例顯著提高(圖2B)，在第二階段誘導(dǎo)結(jié)束后也出現(xiàn)更高的紅細(xì)胞脫核效率(圖2C)。三、聯(lián)苯胺染色:1.2X IO4細(xì)胞經(jīng)1200rpm離心2min甩片到載玻片上。2.細(xì)胞團(tuán)滴加甲醇固定10 15s。3.聯(lián)苯胺染液染色5min (聯(lián)苯胺染液配方:融解0.1g聯(lián)苯胺至IOml甲醇中，SP得聯(lián)苯胺染液)。4.氧化處理2.5min (氧化液配方:將I體積30% H2O2與11體積70%乙醇混勻，即得氧化液)。5.蒸懼水洗漆2.5min。6.細(xì)胞甩片經(jīng)瑞氏一基姆薩染液(公司)染色，鏡下觀察，拍照。7.紅細(xì)胞表達(dá)血紅蛋白，聯(lián)苯胺染色呈現(xiàn)棕色。四、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè):1.以 PBS 重懸細(xì)胞至 I X 107/ml。2.在100 μ I的細(xì)胞懸液中根據(jù)說明書加入標(biāo)記有熒光染料的抗體，冰上孵育30mino3.當(dāng)需要 檢測(cè)細(xì)胞的脫核狀態(tài)時(shí)，在加入抗體的同時(shí)在100 μ I的細(xì)胞懸液中加入0.5 μ I 0.2mg/ml核染料LDS751,同樣冰上孵育30min。4.加入PBS洗滌2次，離心棄上清。5.以500μ1 PBS重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面抗原的表達(dá)情況和細(xì)胞脫核情況。五、實(shí)時(shí)定量PCR涉及的RNA提取、反轉(zhuǎn)錄及PCR流程和反應(yīng)體系如下:IRNA 提取:1.1收集約1X106細(xì)胞，轉(zhuǎn)移到1.5ml EP管中，離心成團(tuán)塊，加入ImlTrizol，吹打裂解細(xì)胞。1.2 加入氯仿 0.2ml/ml Trizol,用力振搖 15s, 15 — 30°C 下孵育 2_3min,離心(4°C, 12000g, 15min)。1.3離心后液體分為三層，小心吸取上層無色液體移入一新的EP管中。1.4加入等體積異丙醇，混勻，4°C下孵育30min，離心(4°C，12000g，10min)。1.5去上清，沉淀加入75%乙醇1ml，輕微振蕩15s，離心(4°C，7500g，5min)。1.6小心去上清，管內(nèi)沉淀在超凈臺(tái)中鼓風(fēng)靜置干燥3_5min。1.7加入30 μ I DEPC水溶解，_80°C冰箱保存。2反轉(zhuǎn)錄:2.1利用miScript II RT Kit (Qiagen公司)進(jìn)行microRNA的反轉(zhuǎn)錄,操作方法參見產(chǎn)品說明書。2.2 利用 Reverse Transcriptase MMLV (Takara 公司)進(jìn)行 RNA 反轉(zhuǎn)錄,操作方法參見產(chǎn)品說明書。3PCR:按以下體系(見表I和表2)配置反應(yīng)液，反應(yīng)條件見表3，實(shí)驗(yàn)涉及的引物及退火溫度見表4。表ImicroRNA表達(dá)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)反應(yīng)體系
權(quán)利要求
1.一種構(gòu)建體，其特征在于，包括編碼miR-125b的核酸分子，所述miR-125b 具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建體，其特征在于，所述編碼miR-125b的核酸分子具有選自SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3的至少一種所示的核苷酸序列。
3.一種制備成熟紅細(xì)胞的方法，其特征在于，包括:使紅細(xì)胞前體細(xì)胞表達(dá)miR-125b，所述miR-125b具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；以及培養(yǎng)表達(dá)miR_125b的紅細(xì)胞前體細(xì)胞，以便獲得成熟紅細(xì)胞， 其中， 所述紅細(xì)胞前體細(xì)胞為選自原成紅細(xì)胞、嗜堿性成紅細(xì)胞、多染性成紅細(xì)胞、正染性成紅細(xì)胞和網(wǎng)織紅細(xì)胞的至少一種。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，使紅細(xì)胞前體細(xì)胞表達(dá)miR-125b進(jìn)一步包括: 利用權(quán)利要求1或2所述的構(gòu)建體，將編碼miR-125b的核酸分子引入到所述紅細(xì)胞前體細(xì)胞中。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述紅細(xì)胞前體細(xì)胞為成紅細(xì)胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法,其特征在于,利用添加100ng/ml的SCF、40ng/ml的IGF、5U/ml的EP0、2mM的L-谷氨酰胺、I μ M的地塞米松、40ng/ml的類脂和100 μ g/m的轉(zhuǎn)鐵蛋白的Stem span培養(yǎng)基，培養(yǎng)所述表達(dá)miR_125b的紅細(xì)胞前體細(xì)胞。
7.權(quán)利要求1或2所述的構(gòu)建體、或者miR-125b在制備成熟紅細(xì)胞中的用途。
8.一種用于制備成熟紅細(xì)胞的試劑盒，其特征在于，包括: 適于使紅細(xì)胞前體細(xì)胞表達(dá)miR-125b的試劑。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的試劑盒，其特征在于，所述適于使紅細(xì)胞前體細(xì)胞表達(dá)miR-125b的試劑為權(quán)利要求1或2所述的構(gòu)建體。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的試劑盒，其特征在于，進(jìn)一步包括: 培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基為添加100ng/ml的SCF、40ng/ml的IGF、5U/ml的EP0、2mM的L-谷氨酰胺、1 U M的地塞米松、40ng/ml的類脂和100 μ g/m的轉(zhuǎn)鐵蛋白的Stem span培養(yǎng)基， 其中，所述培養(yǎng)基與所述適于使紅細(xì)胞前體細(xì)胞表達(dá)miR-125b的試劑設(shè)置在不同的容器中。
全文摘要
本發(fā)明涉及miR-125b在紅細(xì)胞成熟化中的用途。其中，制備成熟紅細(xì)胞的方法包括使紅細(xì)胞前體細(xì)胞表達(dá)miR-125b，所述miR-125b具有SEQ IDNO1所示的核苷酸序列；以及培養(yǎng)所述表達(dá)miR-125b的紅細(xì)胞前體細(xì)胞，以便獲得成熟紅細(xì)胞，其中，所述紅細(xì)胞前體細(xì)胞為選自原成紅細(xì)胞、嗜堿性成紅細(xì)胞、多染性成紅細(xì)胞、正染性成紅細(xì)胞和網(wǎng)織紅細(xì)胞的至少一種。利用該方法能夠有效地制備成熟紅細(xì)胞。
文檔編號(hào)C12N15/63GK103074354SQ201210479480
公開日2013年5月1日 申請(qǐng)日期2012年11月22日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月22日
發(fā)明者裴雪濤, 岳 文, 謝小燕, 李艷華, 姚海雷, 習(xí)佳飛, 周軍年, 曾泉, 房芳 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院野戰(zhàn)輸血研究所