專利名稱：禽流感h5ha抗原的單克隆抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及禽流感H5HA抗原的單克隆抗體，具體涉及通過(guò) DNA免疫制備禽流感H5HA抗原的單克隆抗體以及生成該抗體的雜交瘤細(xì)胞系。
背景技術(shù)：
DNA免疫是近年發(fā)展起來(lái)的一種新型抗體制備法。DNA免疫克服了傳統(tǒng)蛋白質(zhì)免 疫方法的缺陷，能更為有效地激活機(jī)體的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答。尤其是在僅知DNA編碼而 不能獲得目的蛋白，或獲得的蛋白為低免疫性的情況下，蛋白免疫很難得到特異性的抗體， 但通過(guò)DNA免疫可制備高效價(jià)特異性的抗體，這為單抗制備提供了一種簡(jiǎn)單易行的方法。 同時(shí)DNA免疫制備單抗可以獲得線性表位和構(gòu)象表位，而往往具有中和抗體活性的是構(gòu)象 表位，DNA免疫制備單抗為疾病的診斷和治療提供新的思路。目前制備禽流感HA蛋白的單克隆抗體主要是通過(guò)免疫滅活病毒或免疫純化的HA 蛋白，但這兩種方法均有一定的缺陷。免疫滅活病毒一方面需要獲得活的病毒，限制了研究 范圍；同時(shí)變性滅活過(guò)程對(duì)抗原構(gòu)象會(huì)造成損害，免疫后獲得的功能性抗體減少。免疫純化 的HA蛋白需要繁瑣的蛋白純化過(guò)程，而且純化過(guò)程也造成蛋白變性失活，原核表達(dá)的HA蛋 白免疫后獲得的多為無(wú)功能的抗體。DNA免疫制備禽流感HA蛋白的單克隆抗體則很好的 避免了這些缺陷，DNA免疫因?yàn)榇嬖隗w內(nèi)抗原表達(dá)和遞呈的過(guò)程，所以它最接近活病毒感染 機(jī)體免疫反應(yīng)過(guò)程并且很完整保存了抗原構(gòu)象，能獲得多種特性的單克隆抗體。但是，由于 DNA免疫利用宿主的轉(zhuǎn)錄和翻譯體系，而自然界生物體存在密碼子的偏好性，從病原體來(lái)源 的基因克隆在異源宿主體內(nèi)可能難以有效表達(dá)，因此就不能有效的刺激宿主的免疫系統(tǒng)， 使之產(chǎn)生較好的免疫應(yīng)答。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷提供一種密碼子優(yōu)化的H5-VN HA基因 序列。本發(fā)明的另一目的是提供利用此基因通過(guò)DNA免疫制備的單克隆抗體。本發(fā)明的又一目的是提供分泌該單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系。本發(fā)明的目的通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)密碼子優(yōu)化的H5-VN HA基因，序列為SEQ ID NO. 1。一種分泌抗H5-VN HA單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系，保藏號(hào)為CGMCC No. 3648。其中，所述的雜交瘤細(xì)胞系是由序列為SEQ ID NO. 1的密碼子優(yōu)化的H5-VN HA基 因通過(guò)DNA免疫，經(jīng)常規(guī)的細(xì)胞融合、篩選及單克隆化得到的。所述的DNA免疫是將序列為SEQ ID NO. 1的基因裝入pJW4303載體中，構(gòu)建成密 碼子優(yōu)化的H5-VN HA基因的DNA疫苗，用該DNA疫苗免疫小鼠。一種禽流感H5-VN HA抗原的單克隆抗體，由所述的保藏號(hào)為CGMCC No. 3648的雜 交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生。
一種分泌抗H5-VN HA單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系，保藏號(hào)為CGMCC No. 3649。其中，所述的雜交瘤細(xì)胞系是由序列為SEQ ID NO. 1的密碼子優(yōu)化的H5-VN HA基 因通過(guò)DNA免疫，經(jīng)常規(guī)的細(xì)胞融合、篩選及單克隆化得到的，所述的DNA免疫是將序列為SEQ ID NO. 1的基因裝入pJW4303載體中，構(gòu)建成密 碼子優(yōu)化的H5-VN HA基因的DNA疫苗，用該DNA疫苗免疫小鼠。一種禽流感H5-VN HA抗原的單克隆抗體，由保藏號(hào)為CGMCC No. 3649的雜交瘤細(xì) 胞系產(chǎn)生。本發(fā)明以H5m亞型禽流感病毒A/Viet Naml203/04株HA (H5-VN HA)基因序列 為研究模板，對(duì)該序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化處理，設(shè)計(jì)得到H5-VN HA基因序列SEQ ID NO. 1，并 將該優(yōu)化后的序列裝入PJW4303載體中，構(gòu)建一密碼子優(yōu)化的H5-VN HA基因的DNA疫苗。 用該DNA疫苗通過(guò)電穿孔免疫小鼠，經(jīng)過(guò)常規(guī)細(xì)胞融合、篩選及單克隆化，建立穩(wěn)定分泌抗 H5-VN HA單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，經(jīng)ELISA、免疫印跡等方法的鑒定，雜交瘤細(xì)胞所分 泌的單克隆抗體能夠特異性識(shí)別H5-VN HA蛋白，且其中2株雜交瘤細(xì)胞株分泌的抗體具有 中和抗體活性。這對(duì)禽流感的診斷，治療及疫苗制備等具有重要意義。本發(fā)明的有益效果1、本發(fā)明所提供的密碼子優(yōu)化的H5-VN HA基因?qū)A基因中不常用的密碼子換為 哺乳動(dòng)物細(xì)胞偏愛(ài)的密碼子，可以提高HA基因的表達(dá)。此外，序列優(yōu)化也使得mRNA更穩(wěn)定， 基因更易于進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯。2、本發(fā)明利用人工合成的遺傳密碼子優(yōu)化后的HA基因構(gòu)建DNA疫苗，并將其免疫 動(dòng)物以獲得單克隆抗體，這一手段避免了直接接觸高致病性H5毒株，也無(wú)須制備大量用于 免疫動(dòng)物及研究免疫反應(yīng)的HA抗原，為H5亞型禽流感HA抗原免疫原性和交叉反應(yīng)的研究 提供一種有效的工具。3、本發(fā)明制備得到的H5HA抗原的單克隆抗體，為禽流感病毒的研究和臨床應(yīng)用 提供有利的工具(1)H5-VN HA單克隆抗體可以用來(lái)研究HA抗原表位；(2)利用該抗體分析表位，為禽流感表位疫苗的研究提供了物質(zhì)基礎(chǔ)；(3)可以研究該抗體對(duì)其它H5亞型交叉保護(hù)性，獲得具有廣譜中和活性的單克隆 抗體；(4)利用該抗體作為試劑盒可以診斷禽流感病毒的感染；(5)利用該抗體可進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究；(6)對(duì)該抗體進(jìn)行人源化改造可以用來(lái)治療人感染禽流感病毒。生物材料保藏信息1、雜交瘤細(xì)胞株SP2/0(3B2IIG8F6)，保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通 微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC No. 3648，保藏日為2010年3月09日。2、雜交瘤細(xì)胞株SP2/0(4B10IIH4G12)，保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普 通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC No. 3649，保藏日為2010年3月09日。


圖1野生型和密碼子優(yōu)化H5-VN HA基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的偏好的比較(指數(shù)> 1為哺乳動(dòng)物細(xì)胞所偏好)，縱坐標(biāo)表示偏好指數(shù)，橫坐標(biāo)表示核苷酸序列位置。圖 2HA-VN. tPA 的 Western blot 分析結(jié)果1. pjff4303轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞的上清，2. pJW4303轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞的細(xì)胞裂解液， 3. H5-VN. tPA轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞的上清，4. H5-VN. tPA轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞的細(xì)胞裂解液。圖3單克隆抗體與H5-VN HA蛋白結(jié)合情況的Western Blot免疫印跡檢測(cè)結(jié)果a 為單抗3B2G8F6 Western Blot免疫印跡檢測(cè)結(jié)果，b為單抗2C10D2E6 Western Blot免疫 印跡檢測(cè)結(jié)果，c為單抗4B10H4G12 Western Blot免疫印跡檢測(cè)結(jié)果。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1. H5-VN HADNA疫苗的構(gòu)建用MacVector 7. 2 軟件分析 Influenza A virus (A/Viet Nam/1203/2004 (H5N1) (按已發(fā)表基因庫(kù)資料)，發(fā)現(xiàn)源自A/VietNaml203/04的HA基因喜愛(ài)使用的密碼子與哺乳 動(dòng)物 細(xì)胞自身基因所喜愛(ài)使用的密碼子有很大不同，因而設(shè)計(jì)了密碼子優(yōu)化后的H5-VN HA 基因，序列為SEQ ID NO. 1。密碼子優(yōu)化后H5-VN HA基因中哺乳動(dòng)物細(xì)胞偏愛(ài)的密碼子頻 率高于野生型H5-VN HA基因(圖1)。該DNA序列較之野生型有所變化，但HA蛋白質(zhì)氨基 酸序列不變。將設(shè)計(jì)好的序列交德國(guó)geneart公司合成，裝入質(zhì)粒pUC18，構(gòu)建成重組質(zhì)粒 PUC18/H5-VN。經(jīng)測(cè)序證實(shí)合成的序列正確。根據(jù)以往的研究結(jié)果，與HA蛋白自身的信號(hào)肽相比，人組織纖維蛋白溶酶原激活 劑(human tissue plasminogen activator，tPA)信號(hào)肽更易于提高蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)， 因此本發(fā)明以tPA信號(hào)肽取代H5-VN HA蛋白信號(hào)肽，tPA信號(hào)肽基因已包含在pJW4303質(zhì) 粒中，人工合成的但不包括原始信號(hào)肽的HA基因片段經(jīng)PCR擴(kuò)增后被連接在tPA信號(hào)肽基 因下。設(shè)計(jì)引物，在引物兩端分別引入Nhe I和BamH I酶切位點(diǎn)，以pUC18/H5_VN為模板 PCR擴(kuò)增純化出經(jīng)密碼子優(yōu)化的H5-VN HA后，經(jīng)Nhe I和BamH I雙酶切消化的H5-VN HA 基因和pJW4303質(zhì)粒連接構(gòu)建成重組表達(dá)質(zhì)粒pJW4303/H5-VN HA，將此替換信號(hào)肽后的重 組質(zhì)粒命名為HA-VN. tPA，即用于本實(shí)驗(yàn)的HA基因DNA疫苗。PCR引物分別為上游引物SEQ ID NO. 3及下游引物SEQ ID NO. 4，以重組質(zhì)粒 PUC18/H5-VN 為模板，PCR 擴(kuò)增。反應(yīng)條件是-M°C 4min，94°C lmin、56°C lmin、72°C 1. 5min 共25個(gè)循環(huán)，72°C 7min。反應(yīng)體系如下 PCR 后連入質(zhì)粒 PJW4303 的 H5-VN HA 基因序列為SEQ ID NO. 2。重組質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定正確。質(zhì)粒的大量提取和純化均嚴(yán)格按照QIAGEN Plasmid MegaKit使用說(shuō)明書(shū)操作。實(shí)施例2.細(xì)胞轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞用含10%胎牛血清的含雙抗DMEM高糖培養(yǎng)基37°C ,5%C02飽和濕度培 養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，用2. 5g/L胰酶消化后，以1. OX 106個(gè)細(xì)胞(6mL)接種于60mm培 養(yǎng)皿中，待生長(zhǎng)至80%融合時(shí)開(kāi)始轉(zhuǎn)染。依據(jù)PEI轉(zhuǎn)染方法進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，取PEI 50 uL, 加入到930 u L含雙抗DMEM高糖培養(yǎng)基中，另取8. 0 y g H5-VN HA重組質(zhì)粒HA-VN. tPA加 入到上述培養(yǎng)液中，輕輕混勻，室溫，孵育15min，然后將1ml PEI/DNA復(fù)合物加到培養(yǎng)瓶中 并輕輕搖動(dòng)使混合均勻，同時(shí)以PJW4303空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞作為陰性對(duì)照，10h后可更換不含 血清含雙抗的DMEM培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)72h后進(jìn)行Western blot分析。蛋白質(zhì)印跡法分析 結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染HA-VN. tPA的293T細(xì)胞的細(xì)胞裂解液中可檢出相對(duì)分子質(zhì)量85000、60000、 25000左右的目的條帶，分別為HA蛋白前體(HA0)、蛋白酶降解后的HA1和HA2亞單位(圖 2)轉(zhuǎn)染細(xì)胞收獲吸取細(xì)胞上清液，2500rpm，室溫，離心lOmin，吸取上清_20°C凍 存。用PBS (濃度10mM，pH7. 2)將細(xì)胞從培養(yǎng)皿中洗脫，收集細(xì)胞懸液，2500rpm，室溫，離 心 lOmin，棄上清，加入裂解液(50mM Tris-HCl Ph7. 6,150mM NaCl，1 % Triton，用前加入 2% lOOmM PMSF(苯甲基磺酰氟))，冰上孵育20min, 12000rpm，4°C，離心60min,收集上清 液，-20°C凍存。實(shí)施例3.雜交瘤細(xì)胞系的建立步驟1 動(dòng)物免疫用實(shí)施例1制備的HA-VN. tPA疫苗免疫7只Balb/c小鼠。肌肉注射結(jié)合活體基 因?qū)敕绞矫庖?，保證針頭插入深度2mm，注入疫苗，觀察注射局部隆起，注射后立即于注射 部位用WJ-2002活體基因?qū)雰x進(jìn)行體內(nèi)電轉(zhuǎn)染(技術(shù)參數(shù)電壓50V，脈沖次數(shù)正反各3 次，波寬60ms，頻率30Hz)，以小鼠腿部肌肉發(fā)生抖動(dòng)視為電轉(zhuǎn)染有效。于第0、2、4、8周進(jìn) 行4次DNA免疫，第4次DNA免疫后采用腹腔注射H5-VN. tPA轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，每只小鼠注 射 5xl06-lxl07cells。步驟2:細(xì)胞融合細(xì)胞加強(qiáng)免疫4天后，摘除免疫小鼠眼睛放血，留取血清作為ELISA的陽(yáng)性對(duì)照。 拉頸處死小鼠，75 %酒精浸泡5min。在小鼠腹部剪一小口，撕開(kāi)皮膚，剪開(kāi)腹膜，鑷取小鼠脾臟，剪下小鼠脾臟，除去脂肪和結(jié)締組織，用RPMI 1640不完全培養(yǎng)基洗滌小鼠脾臟。將小 鼠脾臟剪成4塊，在不銹鋼篩網(wǎng)(100目/cm2)上，用玻璃注射器針芯充分研磨小鼠脾臟，輕 輕擠壓出脾細(xì)胞。將研磨液經(jīng)過(guò)不銹鋼篩網(wǎng)(200目/cm2)過(guò)濾后，轉(zhuǎn)移至離心管，lOOOrpm 離心5min，棄上清。RPMI 1640不完全培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞一次，再用RPMI 1640不完全培養(yǎng)基 充分重懸細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，置于孵育箱(37°C、5%C02)中待用。充分混勻免疫脾細(xì)胞 108個(gè)(25ml無(wú)血清培養(yǎng)基)和小鼠骨髓瘤SP2/0細(xì)胞(購(gòu)自上海細(xì)胞所)2xl07個(gè)(25ml 無(wú)血清培養(yǎng)基)懸液，200-400g離心5-lOmin，用吸管盡可能吸取上清，以免稀釋PEG.。手 指輕彈離心管使細(xì)胞沉淀較為松動(dòng)，將離心管置于37°C水浴中，融合過(guò)程中離心管一直置 于水浴中，1分鐘內(nèi)使用吸管將1ml 37°C水浴中預(yù)熱的50% PEG1500加入到細(xì)胞沉淀中， 邊加邊適度攪拌，加完后繼續(xù)攪拌l-2min. 1分鐘內(nèi)加lml37°C水浴中預(yù)熱的培養(yǎng)基到融合 混合物中，如上述攪拌。3分鐘內(nèi)加3ml預(yù)熱的培養(yǎng)基，持續(xù)攪拌，然后緩慢的加入10ml預(yù) 熱的培養(yǎng)基，離心沉淀細(xì)胞，棄上清，用選擇性培養(yǎng)基(RPMI 1640,10%FBS,lx Glutamine/ Pen/Strep, lxHAT medium)重懸細(xì)胞沉淀，按100 yl/孔加入到96孔培養(yǎng)板，置于細(xì)胞孵育 箱(37°C、5%C02)中培養(yǎng)。在融合后第5和第7天更換新鮮培養(yǎng)基，在第7天或第10天檢 測(cè)抗體分泌情況。步驟3 間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)篩選陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞1)用HA-VN. tPA轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞的上清(1 10稀釋)作為抗原包被ELISA板(使 用PBSpH7. 2-7. 4作為包被液)，每孔100 ill，4°C，過(guò)夜。2)棄包被液，用 1XPBST 洗板 5 次(PBST 構(gòu)成為 lOmMPBS 和 0. 05% Tween-20)。3)5% 脫脂奶粉(PBS ,0. 05% Tween-20，5 % 脫脂奶粉)37 °C，封閉 lh，每孔 200 yl。4)棄封閉液，用1XPBST洗板5次。5) 一抗為待檢測(cè)融合細(xì)胞上清，每孔加入100iil，37°C，孵育lh。6)棄一抗，用1XPBST洗板5次。7)生物素標(biāo)記的羊抗鼠IgG(濃度為lmg/ml，l 1000)，每孔加入100 yl，37°C， 孵育lh。( 二抗稀釋液乳清蛋白，0. 5% Tween-20, PBS)。8)棄二抗，用1XPBST洗板5次。9)HRP標(biāo)記鏈親和素(濃度為lmg/ml，l 2000)，每孔加入100 yl，37°C，孵育lh。 (稀釋液乳清蛋白，0. 5% Tween-20, PBS) 10)棄HRP標(biāo)記鏈親和素，用1XPBST洗板5次。11)TMB 顯色(100ul/well)，室溫，3. 5min，50ul/well 1M 的 H2S04 終止顯色。12)酶標(biāo)儀測(cè)定并記錄各孔A450值。步驟4 陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞的克隆化_采用有限稀釋法將細(xì)胞懸液移至刻度離心管中連續(xù)倍數(shù)稀釋。例如，先制備5xl03細(xì)胞懸液，將此 細(xì)胞懸液經(jīng)100倍稀釋，即為50細(xì)胞/ml ；再將50細(xì)胞/ml的細(xì)胞懸液經(jīng)5倍稀釋，即為 10細(xì)胞/ml，最后將10細(xì)胞/ml的細(xì)胞懸液經(jīng)2倍稀釋，即為5細(xì)胞/ml。將3種稀釋好的 細(xì)胞懸液分別接種于96孔板中，每孔加lOOul，。50細(xì)胞/ml加到A，B, C三排，細(xì)胞數(shù)為 10個(gè)/ml加D、E、F三排。細(xì)胞數(shù)5個(gè)/ml，加G、H兩排。約10天后檢測(cè)抗體，篩選出抗體 陽(yáng)性最強(qiáng)的單克隆細(xì)胞。然后，再進(jìn)行亞克隆培養(yǎng)，改用RPMI 1640完全培養(yǎng)基，直到所有 含單個(gè)克隆的微孔均為抗體陽(yáng)性為止，即獲得單抗分泌株，大量擴(kuò)增并凍存，長(zhǎng)期傳代培養(yǎng)
7后，以相同的方法再次克隆化鑒定，從何獲得了 3株穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株， 分別為 3B2G8F6、4B10H4G12 和 2C10D2E6，保藏待用。實(shí)施例4體外培養(yǎng)法制備單抗將實(shí)施例3建立的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞3B2G8F6、4B10H4G12和2C10D2E6在24孔板中 擴(kuò)大培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)至80%融合時(shí)，停止換液，持續(xù)培養(yǎng)直至細(xì)胞全部死亡。收集培養(yǎng)上清 1500rpm，離心lOmin，上清含有高濃度的單克隆抗體，_70°C保存?zhèn)溆谩?shí)施例5單抗特性鑒定步驟1 克隆抗體IgG亞型鑒定取3株雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清，按照小鼠單克隆抗體同型檢測(cè)試劑盒操作說(shuō)明(HBT 公司)進(jìn)行操作。具體方法如下(1)加500ul緩沖液至檢測(cè)管中；(2)加500ul雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清至檢測(cè)管中；(3)完全浸潤(rùn)試紙條，并輕輕搖動(dòng)；(4)加入lml大鼠抗小鼠K鏈底物至檢測(cè)管中，試紙條打印面朝下，與液體充分接 觸，輕輕搖動(dòng)直至試紙條上出現(xiàn)兩條帶；結(jié)果表明3B2G8F6、2C10D2E6為 IgGl，k 輕鏈免疫球蛋白；4B10H4G12 為 IgG2b， K輕鏈免疫球蛋白。步驟2 單克隆抗體的純化利用GE Hi Trap protein A抗體純化柱(5ml柱)進(jìn)行單抗純化，具體操作如下(1)將注射器中充滿結(jié)合緩沖液，除去堵頭并將注射器一滴一滴的連接在柱子上 (使用提供的連接接頭)，以避免出現(xiàn)氣泡；(2)除去柱子底部出口的堵頭；(3)使用至少5倍柱體積的結(jié)合緩沖液平衡柱子；(4)使用注射器將樣品上到柱子上去，為了獲得良好的結(jié)果，推薦的流速為0. 5 5ml/min ；(5)以7倍柱體積的緩沖液沖洗柱子，或直到?jīng)]有物質(zhì)從柱子中流出。在沖洗時(shí)保 持流速為10ml/min。(6)以10ml洗脫緩沖液洗脫蛋白，在洗脫時(shí)，保持流速為5ml/min。(7)洗脫完畢后，用5倍的結(jié)合緩沖液沖洗柱子，這樣柱子可以用于新的一輪純化 過(guò)程。步驟3 單克隆抗體穩(wěn)定性的測(cè)定復(fù)蘇雜交瘤細(xì)胞，收集不同傳代次數(shù)的細(xì)胞上清，并用ELISA方法檢測(cè)其效價(jià)。結(jié) 果表明獲得3株雜交瘤細(xì)胞株能夠穩(wěn)定的產(chǎn)生單克隆抗體。步驟4 單克隆抗體的反應(yīng)性5. 1間接ELISA方法(同實(shí)施例3步驟3)檢測(cè)所獲得單克隆抗體與H5-VN HA抗 原反應(yīng)的情況ELISA結(jié)果表明，3株雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生的單抗均能與HA抗原發(fā)生強(qiáng)烈的結(jié)合反應(yīng)。5. 2ffestern Blot免疫印跡檢測(cè)3株單克隆抗體與H5-VN HA蛋白的結(jié)合情況
(1)H5-VN HA DNA疫苗轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞的裂解液及上清，pJW4303轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞的 裂解及上20ul，加入5x上樣緩沖液5 iil，100°C，煮沸l(wèi)Omin ；(2)首先制備15%的分離膠(7.5ml 30 %丙烯酰胺溶液，3. 7ml lMTris/Cl pH8. 8,150 u 110% SDS,150u 1 10%過(guò)硫酸氨，6iU TEMED)，灌膠，液面頂端加入水，室溫 下聚合30min ；(3)倒棄水，再制備5%的積層膠(960 u 1 30%丙烯酞胺溶液，740 yl lMTris/Cl PH6. 8,60 u 110% SDS,60u 1 10%過(guò)硫酸氨，5 yl TEMED)，在積層膠上插入梳齒，待膠完全 凝聚后，拔下梳齒；(4)將上述處理好的樣品加入15%膠中進(jìn)行電泳，20mA，lh，40mA，2h ；(5)膠上的蛋白轉(zhuǎn)到PVDF膜上，lOOv，lh ；(6)轉(zhuǎn)好的膜用5%脫脂奶粉封閉，37°C，lh ；(7)用 lxPBST 洗膜兩次；(8)將膜浸在1 500稀釋的血清中，4°C，過(guò)夜；(9)棄掉血清，用lxPBST洗膜6次，每次lOmin ；(10)棄掉洗液，加入1 10000稀釋HPR標(biāo)記的羊抗小鼠IgG，37°C，lh ；(11)棄掉二抗，用lxPBST洗膜6次，每次lOmin ；(12)發(fā)光劑加到膜上，暗室顯影。Western Blot結(jié)果表明，其中雜交瘤細(xì)胞株3B2G8F6和2C10D2E6分泌的單抗能識(shí) 別變性的HA蛋白，4B10H4G12分泌的單抗不能識(shí)別變性的HA蛋白(結(jié)果見(jiàn)圖3)。實(shí)施例6單克隆抗體與不同來(lái)源HA抗原交叉反應(yīng)步驟1:ELISA 檢測(cè)參照實(shí)施例3步驟3，選擇111，113，117，119，115(包括即，服，六111111土，Ind)HA抗原，看 3株單抗與它們的交叉反應(yīng)。結(jié)果如下 注“ + ”表示反應(yīng)為陽(yáng)性，“_”表示反應(yīng)為陰性。結(jié)果表明，3株單抗均與H1，H3，H7，H9反應(yīng)為陰性，而其中單抗4B10IIH4G12和單 抗2C10IID2E6與H5反應(yīng)均為陽(yáng)性，單抗3B2IIG8F6僅與自身抗原還有H5-HK HA反應(yīng)為陽(yáng) 性，說(shuō)明這3株單抗具有亞型特異性，這可用來(lái)制備禽流感H5亞型診斷試劑盒，為禽流感病 毒感染的快速診斷提供可能。步驟2 假病毒技術(shù)檢測(cè)交叉反應(yīng)利用假病毒技術(shù)檢測(cè)3株單抗與其它H5亞型病毒之間的中和抗體活性，具體步驟 參照實(shí)施例6，結(jié)果如下 結(jié)果表明4B10H4G12分泌的單抗具有廣譜中和抗體活性，這對(duì)疫苗的制備還有HA 抗原中和表位的研究具有重要意義。實(shí)施例7單克隆抗體中和抗體活性檢測(cè)步驟1 制備H5-VN假病毒顆粒(1) 293T細(xì)胞接種到T-75細(xì)胞培養(yǎng)皿中，5xl06細(xì)胞/6ml完全培養(yǎng)基；(2)第二天，293T細(xì)胞應(yīng)達(dá)到75%單層，生長(zhǎng)狀態(tài)良好；(3)應(yīng)用三種質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，其中pNL 4-3. Luc. R-E-(13. 43ug)、 pHA(l. 2ug)、pNA(300ng)，PEI 是 75ul。參照實(shí)施例 2 操作；(4)轉(zhuǎn)染后48小時(shí)收獲培養(yǎng)液，0.45um濾器過(guò)濾，在濾液中加入FBS至20%濃度， 分裝后-80攝氏度凍存；(5)應(yīng)用熒光酶法檢測(cè)TCID5。。步驟2 檢測(cè)單克隆抗體的中和抗體活性(1)取空白96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，梯度稀釋培養(yǎng)上清(起始稀釋度為1 2)。Negative control指細(xì)胞培養(yǎng)基對(duì)照，還設(shè)有空細(xì)胞對(duì)照(293A細(xì)胞對(duì)照)、陽(yáng)性對(duì)照和無(wú)關(guān)血清血 清對(duì)照，每孔中加入IOOul假型病毒(200TCID5Q)，將96孔板放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中，37°C 1個(gè) 小時(shí)，使病毒與培養(yǎng)上清充分反應(yīng)；(2)取IOOul病毒與培養(yǎng)上清混合物加入到對(duì)應(yīng)復(fù)孔中；(3)將293A細(xì)胞胰酶消化，DMEM完全培養(yǎng)基洗滌，細(xì)胞計(jì)數(shù)，用DMEM完全培養(yǎng)基 將細(xì)胞稀釋至lxl05/ml，每孔加入IxlO4個(gè)細(xì)胞/IOOul ；(4)將96孔板放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中，37°C，5% CO2孵箱中培養(yǎng)；
(5)48hr后從細(xì)胞培養(yǎng)箱中取出96孔板，每孔吸棄IOOul培養(yǎng)液，然后每孔加入 100 μ IBright-GLo熒光素酶檢測(cè)試劑(Promega)，反應(yīng)至少2min ；(6)從每孔中吸出150μ1液體，加于對(duì)應(yīng)96孔白板中，于微孔板光度計(jì)讀取發(fā)光值。(7)計(jì)算抑制率=[1_(樣品組的發(fā)光強(qiáng)度值-空白對(duì)照值)/(陰性組的發(fā)光強(qiáng)度 值-空白對(duì)照值)]X 100% ；(8)根據(jù) Reed-Muench 兩氏法計(jì)算 IC5O。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下 注“_”表示反應(yīng)為陰性。結(jié)果表明其中雜交瘤細(xì)胞株3B2G8F6和4B10H4G12分泌的單抗具有中和抗體活 性，2C10D2E6分泌的單抗不具有中和抗體活性。實(shí)施例5步驟2中純化的抗體也進(jìn)行中和 抗體活性檢測(cè)，結(jié)果表明純化過(guò)程并未破壞抗體的活性，純化后仍具有中和抗體活性。具有 中和抗體活性，這對(duì)人用禽流感疫苗的開(kāi)發(fā)具有重要的意義，同時(shí)可將這幾種單抗進(jìn)行人 源化改造，這為人感染禽流感病毒的治療提供很好的契機(jī)。將分泌單抗3B2G8F6、4B10H4G12 的細(xì)胞株送交位于北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)的中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普 通微生物中心保藏，雜交瘤細(xì)胞株3B2G8F6保藏號(hào)為CGMCC No. 3648，保藏日期2010年3月 9日，雜交瘤細(xì)胞株4B10H4G12保藏號(hào)為CGMCC No. 3649。
權(quán)利要求
密碼子優(yōu)化的H5 VN HA基因，序列為SEQ ID NO.1。
2.分泌抗H5-VNHA單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系，保藏號(hào)為CGMCC No. 3648。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的雜交瘤細(xì)胞系，其特征在于該雜交瘤細(xì)胞系是由權(quán)利要求1 所述的密碼子優(yōu)化的H5-VN HA基因通過(guò)DNA免疫，經(jīng)常規(guī)的細(xì)胞融合、篩選及單克隆化得 到的。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的雜交瘤細(xì)胞系，其特征在于所述的DNA免疫是將權(quán)利要求1 所述的基因裝入PJW4303載體中，構(gòu)建成密碼子優(yōu)化的H5-VN HA基因的DNA疫苗，用該DNA 疫苗免疫小鼠。
5.一種禽流感H5-VN HA抗原的單克隆抗體，其特征在于由權(quán)利要求2所述的保藏號(hào)為 CGMCC No. 3648的雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生。
6.分泌抗H5-VNHA單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系，保藏號(hào)為CGMCC No. 3649。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的雜交瘤細(xì)胞系，其特征在于該雜交瘤細(xì)胞系是由權(quán)利要求1 所述的密碼子優(yōu)化的H5-VN HA基因通過(guò)DNA免疫，經(jīng)常規(guī)的細(xì)胞融合、篩選及單克隆化得 到的。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的雜交瘤細(xì)胞系，其特征在于所述的DNA免疫是將權(quán)利要求1 所述的基因裝入PJW4303載體中，構(gòu)建成密碼子優(yōu)化的H5-VN HA基因的DNA疫苗，用該DNA 疫苗免疫小鼠。
9.一種禽流感H5-VN HA抗原的單克隆抗體，其特征在于由權(quán)利要求6所述的保藏號(hào)為 CGMCC No. 3649的雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，公開(kāi)了禽流感H5HA抗原的單克隆抗體。本發(fā)明提供了序列為SEQ ID NO.1的密碼子優(yōu)化的H5-VN HA基因，并利用該序列通過(guò)DNA免疫制備了禽流感H5-VN HA抗原的單克隆抗體3B2IIG8F6和4B10IIH4G12，以及分泌這兩種單抗的雜交瘤細(xì)胞CGMCC No.3648和CGMCC No.3649。本發(fā)明所提供的密碼子優(yōu)化的H5-VN HA基因?qū)⒖梢蕴岣逪A基因的表達(dá)。此外，序列優(yōu)化也使得mRNA更穩(wěn)定，基因更易于進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯。本發(fā)明制備得到的H5HA抗原的單克隆抗體，為禽流感病毒的研究和臨床應(yīng)用提供有利的工具。
文檔編號(hào)C12N5/20GK101892248SQ20101015888
公開(kāi)日2010年11月24日 申請(qǐng)日期2010年4月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月29日
發(fā)明者盧山, 張春華, 張璐, 王世霞, 黃祖瑚 申請(qǐng)人:王世霞;張春華;張璐;黃祖瑚;盧山