專利名稱：一種細菌ⅰ型、ⅱ型、ⅲ型整合子基因的pcr檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種細菌I型、II型、III型整合子基因的PCR檢測方法，屬于醫(yī)學(xué)分 子生物學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
近年來由于抗生素的廣泛應(yīng)用，尤其是不合理的使用，細菌的耐藥問題越來越嚴 重，加上新抗生素的開發(fā)需要一個較長的周期，使得未來細菌感染的治療陷入了一個兩難 的境地。整合子這一概念是1989年由Stokes H W等首次提出。整合子是一種基因單位， 包括位點特異性重組功能的基因決定簇，在整合酶的作用下能捕獲外來耐藥基因。在整合 子中可形成多種耐藥基因的組合、排列。整合于整合子上的基因盒可借助整合子的強啟動 子而得以表達，是近年來發(fā)現(xiàn)的細菌耐藥性傳播的機制之一。整合子是一種運動性的DNA分子，它的獨特結(jié)構(gòu)可捕獲和整合外源性基因，并使 之轉(zhuǎn)變?yōu)楣δ苄曰虻谋磉_單位，是通過轉(zhuǎn)座子或接合性質(zhì)粒將多種耐藥基因在細菌中水 平傳播的一種遺傳單位，定位于染色體和具有廣泛宿主的質(zhì)粒或轉(zhuǎn)座子上。整合子存在于 許多細菌中，在抗生素發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用前即已存在，是細菌的固有結(jié)構(gòu)，并通過捕獲外源性基因 來增強細菌生存的適應(yīng)性。在抗生素廣泛應(yīng)用條件下，整合子可捕獲耐藥基因，具有使耐藥 性在細菌之間傳播的功能，是細菌競爭生存、適應(yīng)環(huán)境的機制之一。整合子根據(jù)其整合酶基因int序列的不同而分類的。整合酶屬于酪氨酸整合酶家 族，目前發(fā)現(xiàn)的整合酶至少有6類，I類 III類整合子的整合酶被命名為IntI III，但 Int 4后的命名有些混亂。I類整合子在多藥耐藥的細菌中是最為常見的，它與Tn21轉(zhuǎn)座子家族相關(guān)，其 整合酶基因編碼含有337個氨基酸的整合酶。其結(jié)構(gòu)類似于缺陷型的轉(zhuǎn)座子或轉(zhuǎn)座子 殘基，5' CS有編碼整合酶的基因intl及啟動子Pant，部分還有啟動子P2，3' CS包 括3個開放閱讀框(ORF)，即磺胺耐藥基因(sull)，季銨鹽化合物及溴乙錠的耐受基因 (qacEAl)，功能不明的0RF5。對于大多數(shù)I類整合子而言，5 ‘ CS均相似，而3' CS存在 不同差異?，F(xiàn)已在許多革蘭氏陰性菌中分離出I類整合子，包括大腸埃希菌、沙門菌、銅綠 假單胞菌、肺炎克雷伯菌、不動桿菌等[Fluit A C, Schmitz F J. Resistance integrons andsuperintegrons[J], Clin Microbiol Infect,2004,10(4) :272_288·]。II類整合子以Tn7及其家族為代表，其整合酶基因int II被一個終止密碼子中 斷，是缺陷的int基因，它的產(chǎn)物(整合酶)約有318個氨基酸，與int I的產(chǎn)物有46%的 同源性，且3'保守末端包括5個tns基因，協(xié)助轉(zhuǎn)座子移動。目前僅見幾種基因，如核苷轉(zhuǎn) 移酶基因aadAla、甲氧芐啶耐藥基因dhfr及鏈絲霉素耐藥基因sat整合于該類整合子上。III類整合子是近來由Arakawa在耐亞胺培南的黏質(zhì)沙雷菌的耐藥質(zhì)粒上發(fā)現(xiàn) 的，其整合酶int3有320個氨基酸，與int I有61%同源性。另外，還在肺炎克雷伯菌、假 單胞菌、產(chǎn)堿桿菌等革蘭陰性菌中分離出III類整合子。20 世紀 90 年代末，Mazel D 等[Mazel D, Dychinco B, Webb V A, et al. Adistinctive classof integron in the Vibrio cholerae genome[J]. Science,1998, 280 :605-608.]在霍亂弧菌基因組中首次發(fā)現(xiàn)超級整合子(super integron，Si)。超級整 合子結(jié)構(gòu)遠大于傳統(tǒng)的整合子，能攜帶數(shù)百個基因盒，其整合酶亦有位點特異性重組活性。
并有類似59be的結(jié)構(gòu)-霍亂弧菌重復(fù)結(jié)構(gòu)(vibrio cholera repetitive sequences,
VCRs)，與59be不同的是VCRs具有高度序列保守性。I類整合酶能介導(dǎo)超整合子的基因盒在 整合子中插入或切除，提示超級整合子可能是多重耐藥整合子及其基因盒的祖先，并能長 期指導(dǎo)宿主基因的進化，除霍亂弧菌外，在梅氏弧菌、費氏弧菌、擬態(tài)弧菌等[Rowe-Magnus D A,Guerout AM,Mazel D. Superintegrons[J]. Res Microbiol，1999，150 :641_651·]細菌 的染色體基因組中也發(fā)現(xiàn)了超級整合子。整合子屬于可移動基因元件，位于細菌的質(zhì)?；蛉旧w上，能整合不同的耐藥基 因盒，且1個整合子可捕獲多個基因盒，因此可表達出對抗菌藥的耐藥甚至多重耐藥性，臨 床中出現(xiàn)多重耐藥的腸桿菌科細菌、假單胞菌屬細菌，與整合子對耐藥基因的積累是分不 開的。迄今為止已發(fā)現(xiàn)的基因盒大多為抗菌藥耐藥基因，包括最初發(fā)現(xiàn)的編碼氨基糖苷類 及氯霉素鈍化酶的基因，編碼磺胺類、β -內(nèi)酰胺類耐藥性的基因，以及新近發(fā)現(xiàn)的編碼超 廣譜β-內(nèi)酰胺酶及碳青霉烯水解酶的基因盒。這些整合子多見于革蘭氏陰性桿菌，以大 腸埃希菌、銅綠假單胞菌為多見。此外，還在金黃色葡萄球菌、腸球菌、谷氨酰棒狀桿菌等革 蘭氏陽性菌上也發(fā)現(xiàn)了該系統(tǒng)，主要編碼對消毒防腐藥的抗性，其表達水平似強于革蘭氏 陰性桿菌。在臨床抗生素耐藥分離株中，整合子的出現(xiàn)率為59 75%。且以I型整合子為 主。不少細菌攜帶多個整合子，與不含整合子的菌株相比，攜帶整合子的細菌趨向于對多種 抗生素耐藥。Martinez等分析了 163株不同的革蘭氏陰性桿菌，發(fā)現(xiàn)有43% (70/163)的 細菌含有I型整合子，與無整合子細菌相比，這些細菌易表現(xiàn)出對氨基糖苷類、喹諾酮類及 第三代頭孢菌素類藥物的耐藥性，也易介導(dǎo)多重耐藥性。Tosini等分析37株病原性鼠傷 寒沙門菌，發(fā)現(xiàn)帶有3種不同的I型整合子，其中有2種整合子位于同一結(jié)合型質(zhì)粒IncFl 上，這3種整合子分別攜帶了不同的耐藥基因盒，包括aad B、catB3、oxal, aadAla, aacA4, aacl和aadAla，從而介導(dǎo)了對部分氨基糖苷類、青霉素、氯霉素、四環(huán)素及萘啶酸不同水平 的多重耐藥性，且同一血清型細菌中可同時存在多個整合子。Poly M C等[Poly M C,Denis F, Courvalin P, et al. Molecular Characterization of Integrons inAcinetobacter baumannii !Description of a Hybrid Class 2 Integron[J].Antimicrob Agents Chemother. 2000，44 (10) =2684-2688.]分析20株鮑氏不動桿菌，16株帶I型整合子，這些 菌株介導(dǎo)了對氨基糖苷類抗生素、氯霉素、利福平、磺胺類藥物及部分內(nèi)酰胺類抗生素 (包括頭孢他啶)的多重耐藥性，其中1株同時帶I型和II型整合子，1株帶有I型和II型 的雜交整合子(整合酶為IntI 2,3' CS同I型整合子)，說明整合子新的進化方向。Segal H 等[SegalH, Thomas R, Gay Elisha B. Characteraeterization of class I integron resistance gene cassettes and theidentification of a novel IS-Iike element in Acinetobacter baumannii [J] · Plasmid，2003，49 (2) :169_178·]分析了 32 株多藥耐藥的 鮑氏不動桿菌，其中21株攜有I型整合子。這些都說明，基因盒對細菌耐藥性的水平傳播 有重要意義，且在抗菌藥選擇壓力下，整合子不斷進化，產(chǎn)生新生的耐藥形式。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種細菌I型、II型、III型整合子基因的PCR 檢測方法，通過該方法可快速準確的檢測出細菌中是否包含I型、II型或III型整合子，并 且指示出包含I型、II型和III型整合子中的哪一種或哪幾種。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下一種細菌I型、II型、III型整合子基因的PCR檢測方法，該方法包括如下步驟(I)PCR模板的制備(Ia)普通肉湯培養(yǎng)基搖瓶培養(yǎng)增菌；(2a)取5mL步驟(Ia)得到的菌液，經(jīng)普通肉湯培養(yǎng)基搖瓶培養(yǎng)3 6h后，置于無 菌1. 5mL離心管中，8000rpm離心3min，棄上清，再加入ImL無菌超純水洗滌1 2次，重復(fù) 離心一次，棄上清，加入500 μ L無菌超純水重懸，沸水煮5min，5000rpm離心，取上清備用；(2) PCR 擴增細菌I型、II型、III型整合子基因的上下游引物序列如下整合酶基因(intI)F :CCTCCCGCACGATGATCR:TCCACGCATCGTCAGGC整合酶基因(intll)F:TCATTAATGCGCAAACCTGCACCAR:ACGCACGGATATGCGACAAAAAGGT整合酶基因(intlll)F:CGGATGTCTGTGCCTGCTTGCRCCACCGGCAGGCGCTCAAC25 μ L 體系2XPCR Master Mix 12. 5 μ L ;ddH20 4· 5 μ L ；細菌 I 型、II 型、III 型 整合子基因的上下游引物各ι μ L ；模板2 μ L ；PCR 反應(yīng)條件94°C 3min ；然后 94°C 30s，57°C 45s, 72°C lmin，30 個循環(huán)；最后 72°C延伸 IOmin ；4°C保存；(3)瓊脂糖凝膠電泳將0.3g瓊脂糖和20mL 50 X TAE置于錐形瓶中，完全溶解后加入核酸染料 GoldVieW6. 0 μ L，并倒入已放梳子的槽中，待其凝固后將PCR擴增產(chǎn)物取8 μ L點于已凝固 的瓊脂糖凝膠孔中，以5V/cm電壓于TAE中電泳Ih ；(4)判斷結(jié)果紫外投射儀中觀察結(jié)果，280bp、384bp和651bp的條帶，分別指示I型、II型、III
型整合子基因。有益效果由于本發(fā)明采用的引物來自細菌整合子基因中高度保守的整合酶區(qū) 域，采用該引物對能準確、快速、方便的判別細菌是否含有整合子，并能區(qū)分是I型、II型、 III型整合子，建立了一種多重PCR檢測I型、II型、III型整合子的方法。通過實驗證明 該方法具有敏感性高、特異性好的特點，是一種快速準確檢測I型、II型、III型整合子的方 法。為篩選整合子類型及細菌耐藥基因盒的分析，大規(guī)模的進行細菌耐藥性的分子流行病 學(xué)調(diào)查研究提供一種簡便、快捷的方法。


圖1為細菌整合子基因多重PCR檢測技術(shù)陽性對照圖。其中，1為I型整合子陽性；2為II型整合子陽性；3為III型整合子陽性；4為I、III型整合子陽性；5為II、III 型整合子陽性；6為I、II、III型整合子陽性；M為DL2000。
具體實施例方式根據(jù)下述實施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實 施例所僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會限制權(quán)利要求書中所詳細描述的本發(fā)明。實施例1 1、引物的涉及所述三種細菌整合子基因即I型、II型、III型基因上下游引物序列見表1 表 權(quán)利要求
一種細菌I型、II型、III型整合子基因的PCR檢測方法，其特征在于該方法包括如下步驟(1)PCR模板的制備(1a)普通肉湯培養(yǎng)基搖瓶培養(yǎng)增菌；(2a)取5mL步驟(1a)得到的菌液，經(jīng)普通肉湯培養(yǎng)基搖瓶培養(yǎng)3～6h后，置于無菌1.5mL離心管中，8000rpm離心3min，棄上清，再加入1mL無菌超純水洗滌1～2次，重復(fù)離心一次，棄上清，加入500μL無菌超純水重懸，沸水煮5min，5000rpm離心，取上清備用；(2)PCR擴增細菌I型、II型、III型整合子基因的上下游引物序列如下整合酶基因(int I)FCCTCCCGCACGATGATCRTCCACGCATCGTCAGGC整合酶基因(intII)FTCATTAATGCGCAAACCTGCACCARACGCACGGATATGCGACAAAAAGGT整合酶基因(intIII)FCGGATGTCTGTGCCTGCTTGCRCCACCGGCAGGCGCTCAAC25μL體系2×PCRMasterMix 12.5μL；ddH2O 4.5μL；細菌I型、II型、III型整合子基因的上下游引物各1μL；模板2μL；PCR反應(yīng)條件94℃3min；然后94℃30s，57℃45s，72℃1min，30個循環(huán)；最后72℃延伸10min；4℃保存；(3)瓊脂糖凝膠電泳將0.3g瓊脂糖和20mL 50×TAE置于錐形瓶中，完全溶解后加入核酸染料GoldView6.0μL，并倒入已放梳子的槽中，待其凝固后將PCR擴增產(chǎn)物取8μL點于已凝固的瓊脂糖凝膠孔中，以5V/cm電壓于TAE中電泳1h；(4)判斷結(jié)果紫外投射儀中觀察結(jié)果，大小約280bp、380bp和650bp的條帶，分別指示I型、II型、III型整合子基因。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種細菌I型、II型、III型整合子基因的PCR檢測方法。由于本發(fā)明采用的引物來自細菌整合子基因中高度保守的整合酶區(qū)域，采用該引物對能準確、快速、方便的判別細菌是否含有整合子，并能區(qū)分是I型、II型、III型整合子，建立了一種多重PCR檢測I型、II型、III型整合子的方法。通過實驗證明該方法具有敏感性高、特異性好的特點，是一種快速準確檢測I型、II型、III型整合子的方法。為篩選整合子類型及細菌耐藥基因盒的分析，大規(guī)模的進行細菌耐藥性的分子流行病學(xué)調(diào)查研究提供一種簡便、快捷的方法。
文檔編號C12Q1/68GK101948909SQ201010140309
公開日2011年1月19日 申請日期2010年4月6日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月6日
發(fā)明者丁超艷, 張志成, 張淼, 方光遠, 朱佳倚, 蔣加進 申請人:金陵科技學(xué)院