專利名稱:一種用于結(jié)核病預(yù)防的新型疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域和新型結(jié)核疫苗領(lǐng)域,具體涉及一種重組的卡介苗。
背景技術(shù):
結(jié)核病(tuberculosis,TB)是由結(jié)核分枝桿菌引起的一種傳染病,近年來隨著流 動人口增加、人類免疫缺陷病毒(HIV)與結(jié)核桿菌伴發(fā)感染以及結(jié)核桿菌多重耐藥性菌株 的出現(xiàn),使全球結(jié)核病疫情增高,給全球結(jié)核病的防治提出了新的挑戰(zhàn)??ń槊?Bacille CalmetteGuerin,BCG)是目前唯一用于預(yù)防結(jié)核病的疫苗,但是其免疫保護效果極不穩(wěn)定, 不同地區(qū)的人群接種BCG后其免疫保護作用差異很大(保護率為0-80%不等),開發(fā)比BCG 更為有效的抗結(jié)核病疫苗已成為當今迫切需要解決的問題。但目前尚沒有任何一種新型疫 苗能完全替代BCG免疫,因此對卡介苗進行分子改造,研制更為安全有效的新型抗結(jié)核病 疫苗具有重要意義。BCG作為一種活疫苗,應(yīng)用于免疫力低下的人群(如HIV感染者或艾 滋病患者等)有較大的局限性,而將外源基因?qū)肟ń槊鐦?gòu)建重組卡介苗(rBCG)是TB疫 苗改造的重要方向之一,通過BCG的生長繁殖,在體內(nèi)表達保護性抗原,從而更有效地激發(fā) 機體免疫應(yīng)答,增強BCG的免疫效果。Horwitz在BCG菌株中引入編碼MTB 30kD主要分泌 型和細胞外蛋白(Ag85B)的質(zhì)粒來觀察rBCG的效力,發(fā)現(xiàn)rBCG均能穩(wěn)定表達這種蛋白分 子,與親本BCG免疫的豚鼠相比,rBCG免疫的豚鼠盡管體重變化不明顯,但動物存活率和組 織抑制細菌生長的能力均超過BCG,已計劃開始進行I期人體試驗。Bao構(gòu)建了兩株分別表 達Hsp60-ESAT6融合蛋白和ESAT6分泌蛋白的rBCG,前者比BCG誘導更高滴度的特異性抗 體和更強烈的細胞免疫應(yīng)答,而后者的免疫原性與親本BCG株相似,兩株rBCG的毒力未見 增強,都能明顯抵御MTB感染,但免疫保護效力方面尚低于BCG。培養(yǎng)濾液蛋白10 (culture filtrate proteinlO, CFP10)是從結(jié)核分枝桿菌短期 培養(yǎng)的濾液中分離的一種低分子質(zhì)量蛋白質(zhì),與ESAT6均由RD (Regions of deletion, RD) 1 區(qū)的RV3875和RV3874基因編碼,該區(qū)只存在于結(jié)核分枝桿菌復合群和少數(shù)致病性分枝桿 菌基因組中,所有BCG菌株基因組中均缺乏該區(qū)域,是BCG減毒傳代過程中最先缺失的一段 區(qū)域,與結(jié)核分枝桿菌毒力和抗原性相關(guān),能被宿主免疫系統(tǒng)高度識別。CFP10能有效刺激 機體產(chǎn)生特異性細胞免疫應(yīng)答,可以誘發(fā)PPD皮膚試驗陽性者的外周血單個核細胞出現(xiàn)增 殖反應(yīng)并產(chǎn)生IFN-y,繼而活化巨噬細胞,提高巨噬細胞對胞內(nèi)結(jié)核菌的生長抑制作用和 殺傷能力,可望成為新疫苗研制的主要候選分子。機體對結(jié)核病的免疫主要通過ra4+T、細胞等的細胞免疫來完成,BCG是一 種強的CD4+T細胞型免疫應(yīng)答誘導劑,但它誘導MHCI類限制性CD8+T細胞的作用較弱, 這可能是BCG的主要缺陷之一,而細胞可通過多種機制在宿主防御結(jié)核桿菌感染 和潛伏感染中發(fā)揮重要作用。粒-巨噬細胞集落刺激因子(Granulocyte macrophage colony-stimulating factorGM-CSF)是一種能夠刺激粒細胞、巨噬細胞形成集落的細胞因 子,可調(diào)控粒細胞、單核/巨噬細胞的分化、增殖和存活,激活單核_巨噬細胞、釋放炎性介 導因子,殺死某些微生物和腫瘤,在造血調(diào)控和免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。GM-CSF在體內(nèi)外都能影響巨噬細胞的活性,促進樹突狀細胞發(fā)育,作為免疫佐劑已廣泛應(yīng)用于免疫學領(lǐng) 域。例如用抗原-GM-CSF融合蛋白和轉(zhuǎn)染GM-CSF基因的腫瘤細胞進行免疫;利用GM-CSF 作為佐劑的動物模型試驗均表明,GM-CSF能增強感染的免疫原性。由于GM-CSF能誘導強 的CD8+T細胞反應(yīng),可以彌補卡介苗功能上的缺陷,選擇其作為佐劑與結(jié)核分枝桿菌免疫優(yōu) 勢抗原CFP10共同轉(zhuǎn)入卡介苗,構(gòu)建能表達人GM-CSF和結(jié)核分枝桿菌CFP10蛋白的重組卡 介苗可能具有更好的免疫原性和保護力,對今后結(jié)核新疫苗的開發(fā)、發(fā)病機制的研究及結(jié) 核病的防治有重大意義。
發(fā)明內(nèi)容
1、本發(fā)明的目的是提供一種重組卡介苗的制備方法。根據(jù)Genbank中報道的hGMCSF和CFP10基因CDS序列設(shè)計引物,分別擴增hGMCSF 和 CFP10 基因,用 S0E 法(重疊延伸,Gene splicing by overlap extension)進一步擴增 GMCSF-CFP10嵌合基因,將此嵌合基因與大腸桿菌-結(jié)核分支桿菌穿梭質(zhì)粒PMV361同時雙 酶切插入穿梭質(zhì)粒的多克隆位點處,構(gòu)建重組穿梭質(zhì)粒rpMV361GMCSF-CFP10,先用卡那霉 素篩選陽性重組子,再用PCR、酶切及基因序列分析進行鑒定。PCR、酶切及測序結(jié)果均顯示, 在穿梭質(zhì)粒PMV361中插入了一個735bp的特異性片段,與預(yù)期的GMCSF-CFP10嵌合基因大 小一致,重組穿梭表達載體構(gòu)建成功。將-70°C凍存的BCG菌株快速解凍后,迅速轉(zhuǎn)移至37°C預(yù)熱的Sauton培養(yǎng)基中, 放入37°C培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)4-5周,待菌膜長出,直至菌體恢復正常生長狀態(tài),菌體呈白色或 略帶黃色,有皺褶并覆蓋整個培養(yǎng)基液面,將其轉(zhuǎn)種并擴大培養(yǎng),待菌膜覆蓋滿液面后用于 電轉(zhuǎn)化。將測序正確的重組質(zhì)粒rpMV361GMCSF-CFP10用電轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入至感受態(tài)BCG 中,構(gòu)建rBCG:GMCSF-CFP10重組卡介苗。通過卡那霉素篩選陽性重組子,一方面提取重組 卡介苗的基因組行PCR鑒定,另一方面,通過熱誘導的方法,用小鼠抗hGM-CSF單克隆抗體 進行Western-blot分析,觀察其蛋白表達水平。以提取具有卡那霉素抗性的重組BCG菌 的基因組為模板,經(jīng)PCR擴增出735bp的目的片段,證明重組質(zhì)粒pMV GMCSF-CFP10已成功 轉(zhuǎn)化進BCG菌;重組BCG經(jīng)熱誘導后,菌體裂解液上清用小鼠抗CFP10單克隆抗體為一抗, HRP標記的羊抗鼠IgG為二抗,經(jīng)ECL顯色后顯示在27kDa左右出現(xiàn)一特異性的條帶,和目 的蛋白的預(yù)期分子量吻合,而PMV361空質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化組(rBCG:361)未出現(xiàn)陽性條帶,表明重 組BCG可以表達GMCSF-CFP10外源目的蛋白,重組卡介苗rBCG:GMCSF_CFP10構(gòu)建成功。2、本發(fā)明的另一個目的是提供一種效果優(yōu)于目前市售卡介苗的重組卡介苗。取6周齡的BALB/C小鼠32只(雌雄不限),每組8只,隨機分為PBST組、BCG組、 rBCG:361組和rBCG:GMCSF_CFP10組,各組適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,于背部皮下多點分別注射 PBST、BCG 及 rBCG(5X106CFU/ 只,用 PBST 稀釋成 0. lmL),共免疫 1 次。免疫后 6、8、10、12 周四個時間點各組隨機抽取小鼠2只,摘眼球取血,分離血清,檢測各組小鼠血清特異性抗 體滴度。同時無菌分離脾臟,收集脾淋巴細胞,經(jīng)臺盼藍染色后細胞計數(shù),活細胞數(shù)在90% 以上,調(diào)整細胞密度為2X106/L進行下述實驗(1)特異性脾淋巴細胞增殖試驗分離培養(yǎng)的脾細胞加入96孔圓底培養(yǎng)板,每組 小鼠脾細胞做6個復孔,并設(shè)陰性對照孔和調(diào)零孔,試驗孔加入25mg/L TB-PPD,對照孔不 加特異性蛋白,調(diào)零孔不加淋巴細胞。于37°C 5% C02培養(yǎng)68小時后加入XTT再培養(yǎng)4h,
4用酶標儀測定A450吸光值,結(jié)果用刺激指數(shù)表示,SI =刺激組/非刺激組。
(2)細胞因子的誘生上述分離培養(yǎng)的脾細胞加入24孔圓底培養(yǎng)板(0. 5mL/孔), 每組小鼠脾細胞做3個復孔,25mg/L TB-PPD刺激72h后,收集培養(yǎng)液上清,按ELISA檢測試 劑盒說明書測定IFN- y和IL-4水平。(3)流式細胞術(shù)檢測T淋巴細胞⑶4+及⑶8+細胞亞群脾淋巴細胞轉(zhuǎn)入6孔板, 每組做3個復孔(lmL/孔),同時加入25mg/L TB-PPD刺激,培養(yǎng)72h后,加入PE熒光素標 記的抗小鼠CD4+和FITC標記的⑶/抗小鼠一抗,流式細胞儀檢測T淋巴細胞表面⑶/及 ⑶/細胞亞群所占比例。結(jié)果顯示,免疫后6、8、10、12周rBCG: 361組和卡介苗組各時間點血清總抗體滴度 相差不明顯,而rBCG:GMCSF-CFP10組免疫小鼠的抗體滴度明顯高于rBCG:361組和卡介苗 組,在第8周達到高峰,然后逐漸降低,但仍然高于卡介苗組和rBCG:361組;各免疫組脾淋 巴細胞增殖活性均較PBST組明顯升高,在第10周時達到最高,rBCG:361組和卡介苗組比 較,刺激指數(shù)差異不顯著,而rBCG:GMCSF-CFP10組脾淋巴細胞增殖活性顯著高于卡介苗組 和rBCG:361組;各免疫小鼠脾淋巴細胞上清IFN- y水平均較PBST明顯升高,10周達到高 峰,rBCG:GMCSF-CFP10組IFN- y含量顯著高于卡介苗組和rBCG:361組;各組IL-4濃度均 維持在較低水平,各組間無顯著性差異;卡介苗組、rBCG:361組和重組BCG:GMCSF_CFP10組 小鼠脾淋巴細胞CD4+T細胞較PBST組相比均有增高的趨勢,在免疫后10周達到最高,其中, 卡介苗組和rBCG:361組CD4+T細胞的比例相當,而重組卡介苗rBCG:GMCSF-CFP10組CD4+T 細胞比例在各個時間點明顯高于其它各組,重組BCG:GMCSF-CFP10組小鼠脾淋巴細胞
細胞比例自免疫8周就明顯增加,至12周達到最高,在各個時間點CD8+T細胞比例均顯著高 于其它組。體液免疫反應(yīng)和細胞免疫反應(yīng)均提示重組BCG:GMCSF-CFP10免疫原性強于BCG。本發(fā)明的疫苗具有以下優(yōu)勢1、重組表達了人GM-CSF和結(jié)核分枝桿菌免疫優(yōu)勢抗原CFP10。2、將人GM-CSF基因與CFP10通過基因工程技術(shù)融合在一起。3、能穩(wěn)定的在卡介苗中表達外源蛋白GMCSF-CFP10。4、重組疫苗的免疫原性優(yōu)于傳統(tǒng)卡介苗。
圖1為hGMCSF基因、CFP10基因和GMCSF-CFP10嵌合基因的PCR圖。1,DNA分子 量標準;2,hGMCSF 條帶;3,CFP10 條帶;4,GMCSF-CFP10 條帶。圖2為rpMV361 GMCSF-CFP10的PCR及酶切鑒定圖。1,DNA分子量標準;2,PCR鑒 定;3,pMV361 空質(zhì)粒雙酶切;4,rpMV GMCSF-CFP10 單酶切;5,rpMV361 GMCSF-CFP10 雙酶 切。圖 3 為 rBCG:GMCSF-CFP10 基因組 PCR 鑒定圖。1,DNA 分子量標準;2,GMCSF-CFP10條帶。圖4為pMV361的質(zhì)粒圖譜。圖 5 為 Western-blot 檢測 rBCG:GMCSF_CFP10 細胞裂解液中 GMCSF-CFP10 蛋 白表達圖。1,rBCG:361菌體蛋白Western-blot檢測。2,rBCG:GMCSF_CFP10菌體蛋白 Western-blot 檢測。
圖6為血清特異性抗體滴度IgG。圖7 為血清 IgG2a/IgGl。圖8為免疫小鼠脾淋巴細胞增殖反應(yīng)。圖9為脾淋巴細胞培養(yǎng)上清中IFN- Y水平。圖10為免疫小鼠脾淋巴細胞⑶4細胞百分比。圖11為免疫小鼠脾淋巴細胞⑶8細胞百分比。圖12為免疫小鼠脾淋巴細胞亞群分析。1,PBST組;2,BCG組;3,rBCG:361組;4, rBCG:GMCSF-CFP10 組。
具體實施例方式1、以pORF-hGMCSF質(zhì)粒和結(jié)核分枝桿菌H37Rv基因組序列為模板,根據(jù)發(fā)表的人 粒_巨噬細胞集落刺激因子CDS序列和結(jié)核分枝桿菌H37Rv株CFP10基因序列分別設(shè)計人 GM-CSF和CFP10基因的引物,克隆人GM-CSF和結(jié)核分枝桿菌CFP10基因。2、通過基因工程手段,將克隆的人GMCSF和CFP10基因末端加上連接肽段,獲得 GMCSF-CFP10嵌合基因。3、將嵌合基因轉(zhuǎn)入pMV361穿梭質(zhì)粒,構(gòu)建rpMV361 GMCSF-CFP10重組質(zhì)粒。4、提取重組質(zhì)粒,分別進行PCR、酶切及測序鑒定。5、運用電轉(zhuǎn)化的方法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入卡介苗,構(gòu)建重組卡介苗GMCSF-CFP10。6、用卡那霉素進行初步篩選。7、提取重組卡介苗的基因組并進行PCR鑒定。8、通過熱誘導的方法誘導重組卡介苗表達蛋白并用Western-blot的方法鑒定。9、分別用重組卡介苗、傳統(tǒng)卡介苗和PBS免疫小鼠,觀察并分析各組小鼠的體液 免疫和細胞免疫反應(yīng)。實施例實施例1 hGMCSF-CFPIO嵌合基因重組卡介苗的構(gòu)建、表達與鑒定1 材料1. 1菌株及質(zhì)粒BCG上海株由成都生物制品研究所提供,質(zhì)粒PMV361由本室保存,pORF_hGMCSF質(zhì) 粒購自Invitrogen公司。1. 2主要試劑prime STAR HS DNA 聚合酶、dNTP、DNA 連接試劑盒是 Takara 公司產(chǎn)品;EcoR I、 HindHI及蛋白分子量標準購自晶美公司;Omega質(zhì)粒提取試劑盒、PCR產(chǎn)物回收試劑盒及 膠回收試劑盒、細菌基因組提取試劑盒購自寶信生物;CFP10單克隆抗體為Abeam公司產(chǎn) 品;HRP酶標羊抗鼠IgG和ECL顯色試劑盒購自北京中杉公司。1. 3主要儀器PCR儀、電轉(zhuǎn)儀購自百樂公司,低溫冰箱購自三洋公司。2 方法2. 1人GM-CSF和結(jié)核分枝桿菌CFP10基因的PCR擴增根據(jù)Genbank中報道的hGMCSF和CFP10基因⑶S序列設(shè)計2對引物,引物序列為
6hGMCSF 上游5,-CG GAATTC ACATGTGGCTGCAGAGCCTG-3,,hGMCSF 下游5,-GTCTTCATCTCTGCC ATCTCCTGGACTGGCTCCC-3’,上游黑體字是EcoR I的酶切位點,下游刪除終止密碼子TGA,下 劃線部分是含有17個堿基的linker序列。CFP10上游5’-GGGAGCCAGTCCAGGAGATGGCAGAGA TGAAGAC-3,,CFP10 下游5,_GC AAGCTT TCAGAAGCCCATTTGCG-3,,上游下劃線部分是含有 17 個堿基互補的linker序列,下游黑體字是Hind III的酶切位點。以pORF_hGMCSF質(zhì)粒和結(jié) 核分枝桿菌H37Rv株基因組DNA為模板,分別PCR擴增hGMCSF基因和CFP10基因。hGMCSF 基因 PCR 擴增體系總體積為 50ii L,5Xprime STAR Buffer 10 u L, dNTP 4u L(dATP, dGTP, dCTP, dTTP 各 lOmmoL/L),pORF-hGMCSF 質(zhì)粒 DNA 1 u L, hGMCSF 基因上下游引物各 1 u L, prime STAR HS DNA Polymerase 1U,去離子水 32. 5 ii L。PCR 反應(yīng)條件如下95°C 預(yù)變性5分鐘,94°C變性30秒,60°C復性45秒,72°C延伸1分鐘,30個循環(huán),72°C延伸10 分鐘。CFP10 PCR 擴增體系總體積為 50ii L,5Xprime STAR Buffer 10 u L, dNTP 4u L, H37Rv 株基因組DNA 1 ii L,CFP10 基因上下游引物各 1 ii L,prime STAR HS DNAPolymerase 1U,去離子水32. 5ii L,PCR反應(yīng)條件同上,擴增得到下游帶linker的hGMCSF基因和上游帶 linker 的 CFP10 基因。2. 2GMCSF-CFP10嵌合基因的擴增與純化取設(shè)計的hGMCSF基因上游引物1 P L,CFP10基因的下游引物1 P L,以上述擴增的 hGMCSF 和 CFP10 的 PCR 產(chǎn)物各 1 u L 為模板,dNTP 4 u L, 5 X prime STAR Buffer 10 u L, prime STAR HS DNA Polymerase 1U,去離子水 31. 5 ii L,總體積 50 ii L,用 S0E 法擴增 GMCSF-CFP10嵌合基因。PCR反應(yīng)條件95°C預(yù)變性5分鐘,94°C變性45秒,68°C復性1分 鐘,72°C延伸1分30秒,30個循環(huán),72°C延伸10分鐘。將GMCSF-CFP10嵌合基因PCR產(chǎn)物 用柱式膠回收試劑盒純化,具體實驗步驟參照說明書。2. 3 重組質(zhì)粒 rpMV361GMCSF-CFP10 的構(gòu)建用質(zhì)粒提取試劑盒提取PMV361空質(zhì)粒,和上述GMCSF-CFP10嵌合基因純化產(chǎn)物分 別用EcoR I和Hind III進行雙酶切,反應(yīng)體系為:pMV361空質(zhì)粒5 y L,5 X Tango buffer 4u L, EcoRI 0. 5u L, Hind III0. 5u L,總體積 20 u L ;GMCSF-CFP10 嵌合基因 PCR 純化產(chǎn)物 5u L,5XTangobuffer 4u L, EcoR I 0. 5 u L, Hind III0. 5 ii L,總體積 20 ii L。反應(yīng)條件 37°C水浴5小時。純化空質(zhì)粒和PCR產(chǎn)物的雙酶切產(chǎn)物,按照PCR 空質(zhì)粒濃度比1 10 的比例混合,再加入等體積的連接試劑,輕輕混勻后,16°C連接3小時。取5 y L連接液加入 至50 ii L DH5a感受態(tài)菌液中,輕輕混勻,冰浴30分鐘,42 °C水浴靜置90秒,取出迅速轉(zhuǎn)入 至冰浴中2分鐘,加入不含抗生素的LB液體培養(yǎng)基250P L,37°C緩慢振搖60分鐘,取轉(zhuǎn)化 后的菌液100 u L鋪于含卡那霉素50 u g/mL的LB平板上,37°C過夜培養(yǎng)。2. 4 重組質(zhì)粒 rpMV361GMCSF-CFP10 的鑒定隨機挑取3個生長菌落分別接種于5mL LB液體培養(yǎng)基中(含卡那霉素50 u g/ mL),37°C振搖過夜,提取質(zhì)粒后電泳初步觀察質(zhì)粒DNA大小。取較空質(zhì)粒略大者進行PCR 鑒定,其中陰性對照以PMV361為模板,待檢樣本則以含有插入片段的重組質(zhì)粒DNA為模板 進行PCR擴增,引物為hGMCSF上游和CFP10下游,PCR反應(yīng)體系及循環(huán)參數(shù)同前述,另一方 面用EcoR I和Hindlll雙酶切消化,電泳檢測有無插入片段及其大小。初步鑒定重組質(zhì)粒 插入片段大小與預(yù)期相符后,將重組質(zhì)粒送至Invitrogen公司進行DNA序列分析,測序引 物分別為hGMCSF上游和CFP10下游。
2. 5 重組卡介苗 rBCG:GMCSF-CFP10 的構(gòu)建將-70°C凍存的BCG菌株快速解凍后,迅速轉(zhuǎn)移至37°C預(yù)熱的Sauton培養(yǎng)基中, 放入37°C培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)4-5周,待菌膜長出,直至菌體恢復正常生長狀態(tài),菌體呈白色或 略帶黃色,有皺褶并覆蓋整個培養(yǎng)基液面,將其轉(zhuǎn)種并擴大培養(yǎng),待菌膜覆蓋滿液面后用于 電轉(zhuǎn)化。37°C靜置培養(yǎng)于Sauton培養(yǎng)液約20天的卡介苗于轉(zhuǎn)化前加入甘氨酸至終濃度為 4%,繼續(xù)培養(yǎng)24小時。用無菌玻璃珠振搖3小時以打碎菌膜。冰浴1小時后,4000rpm 4°C 離心10分鐘集菌,菌團用預(yù)冷的10%甘油洗滌4次后重懸于10%甘油中。取200 y L菌液 加入10 ii L重組質(zhì)粒,冰浴30分鐘,轉(zhuǎn)入預(yù)冷2mm電穿孔杯中,在2. 5KV/cm, 25 u F,720 Q 條件下電轉(zhuǎn)化。放電完畢后立即冰浴10分鐘,輕柔加至10mL Sauton培養(yǎng)液中,37°C靜置 培養(yǎng)。待長出菌膜后轉(zhuǎn)入含20 u g/mL卡那霉素的Sauton培養(yǎng)液中,于37°C繼續(xù)靜置培養(yǎng) 3 4周。2. 6 重組卡介苗 rBCG:GMCSF-CFP10 的鑒定待菌膜長滿液面后,離心集菌,依據(jù)基因組提取試劑盒提取重組卡介苗總DNA,以 其為模板按前述擴增條件,分別以hGMCSF上游和CFP10下游為引物,進行PCR擴增。含外源 基因的重組卡介苗在Sauton培養(yǎng)液(含20 y g/mL卡那霉素)中靜置培養(yǎng)兩周,迅速加入 等體積53°C的Sauton培養(yǎng)液,置45°C水浴熱誘導30分鐘。5000rpm離心15分鐘集菌。菌 體用冰預(yù)冷的PBS(pH7.2)洗滌2次,振蕩混勻,超聲波裂解菌體40分鐘,-20°C備用。根據(jù) Laemmli等介紹的方法,依次灌制12%的分離膠5mL和5%的濃縮膠2mL,待膠完全凝固后, 將上述制備的蛋白樣品及蛋白質(zhì)分子量標準各取10 y L上樣于梳齒孔中進行電泳,先80V 穩(wěn)壓電泳至分離膠,再120V電泳至結(jié)束。電泳完畢后,剝下凝膠塊,先剪與凝膠塊相同大小 的2張濾紙和1張硝酸纖維素膜。連同凝膠塊一起浸入轉(zhuǎn)移電泳緩沖液(25mmoL/L Tris, 0. 2moL/L氨基乙酸,20%甲醇)中浸泡30分鐘,然后在BR10592型半干轉(zhuǎn)移裝置的陽極 板上依次平鋪濾紙、硝酸纖維素膜、凝膠、濾紙,蓋上陰極板,接通電源,于10V穩(wěn)壓電泳45 分鐘;取出硝酸纖維素膜,將膜置5%脫脂奶粉中封閉1小時后用TTBS(10mM/L Tris-HCl, 150mmoL/L NaCl,0. 05% Tween20, pH7. 5)室溫輕搖洗滌3X5分鐘,然后浸入含小鼠抗 CFP10單克隆抗體(1 1000)的一抗中于室溫孵育2小時,TTBS洗膜3X5分鐘,浸入含辣 根過氧化物酶標記的羊抗小鼠IgG(l 5000)的二抗稀釋液中,室溫孵育1小時;TTBS洗 膜3X5分鐘,ECL顯色,觀察嵌合蛋白在卡介苗中的表達。3 結(jié)果3. 1人GM-CSF基因、結(jié)核分枝桿菌CFP10基因和GMCSF-CFP10嵌合基因的擴增以設(shè)計的GM-CSF基因上下游為引物,通過PCR方法從p0RF_hGMCSF質(zhì)粒獲得 449bp的人GM-CSF基因片段(不含終止密碼子),以CFP10基因上下游為引物,從結(jié)核分枝 桿菌標準株H37Rv基因組DNA中獲得320bp的結(jié)核分枝桿菌CFP10基因,以GM-CSF基因上 游、CFP10基因下游為引物,GM-CSF和CFP10基因為模板,擴增得到735bp的特異性片段,與 預(yù)期的GMCSF-CFP10嵌合基因大小一致(見圖1)。3. 2 重組質(zhì)粒 rpMV361GMCSF-CFP10 的鑒定以抗生素篩選陽性重組子提取的質(zhì)粒為模板,以GM-CSF基因上游、CFP10基因下 游為引物進行PCR擴增,同時用EcoR I.Hindi 11雙酶切該重組質(zhì)粒,均證實有大小為735bp 的目的片段插入PMV361質(zhì)粒(見圖2),測序結(jié)果和GenBank中人GM-CSF基因、結(jié)核分枝桿
8菌CFP10基因序列比對,均100%匹配,表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。3. 3重組BCG的PCR鑒定以提取具有卡那霉素抗性的重組BCG菌的基因組為模板,經(jīng)PCR擴增出735bp的 目的片段,證明重組質(zhì)粒pMV GMCSF-CFP10已成功轉(zhuǎn)化進BCG菌(圖3)。3. 4重組BCG表達產(chǎn)物的Westrn-blot分析重組BCG經(jīng)熱誘導后,菌體裂解液上清用CFP10單克隆抗體為一抗,HRP標記的 羊抗鼠IgG為二抗,經(jīng)ECL顯色后顯示在27kDa左右出現(xiàn)一特異性的條帶,和目的蛋白的 預(yù)期分子量吻合,而空質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化組(rBCG:361)未出現(xiàn)陽性條帶,表明重組BCG可以表達 GMCSF-CFP10外源目的蛋白(見圖5),重組卡介苗rBCG:GMCSF_CFP10構(gòu)建成功。4 結(jié)論運用分子生物學技術(shù)成功構(gòu)建能表達hGMCSF-CFPIO外源蛋白的重組卡介苗 BCG:GMCSF-CFP10。實施例2重組卡介苗rBCG:GMCSF_CFP10免疫原性研究1 材料1. 1實驗動物BALB/C小鼠購自四)I丨大學華西校區(qū)實驗動物中心。1. 2主要試劑IFN- y、IL-4ELISA檢測試劑盒購自R&D公司,PE標記的CD4和FITC標記的CD8抗 小鼠一抗購自eBioscience公司,RPMI1640培養(yǎng)基和胎牛血清購自Gibco公司。1. 3主要儀器FACSCalibur 流式細胞儀(BD Biosciences),酶標儀(Bio-Rad)。2 方法2. 1動物免疫取6周齡的BALB/C小鼠32只(雌雄不限),每組8只,隨機分為PBST組、BCG組、 rBCG:361組和rBCG:GMCSF_CFP10組,各組適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,于背部皮下多點分別注射 PBST (含 0. 05 % Tween80)、BCG 及 rBCG (5 X 106CFU/ 只,用 PBST 稀釋成 0. lmL),共免疫 1 次。 免疫后觀察動物注射部位有無紅腫、潰瘍、化膿等,同時觀察動物皮毛、精神狀態(tài)、飲食及大 小便。2. 2血清特異性抗體水平檢測免疫后6、8、10、12周四個時間點各組隨機抽取小鼠2只,摘眼球取血,待血液固體 成分凝結(jié)固縮,離心吸取血清,分裝后-70°C凍存?zhèn)溆谩S肨B-PPD標準品(lOOyL/孔)包 被酶標板,4°C避光過夜。PBST洗滌,5%脫脂奶粉封閉90分鐘,再次洗滌后依次加入2倍 系列稀釋的待檢血清,37°C溫育90分鐘,洗板后分別加入1 1000稀釋的HRP酶標記羊抗 鼠IgG、IgGl和IgG2a,再次37°C溫育90分鐘,洗板,加入底物液(含0. 4mg/mL鄰苯二胺的 0. 05M磷酸鹽-檸檬酸緩沖液,pH5. 0,臨用前加5uL 30% H202/10mL) 100 u L/孔,室溫避 光15-30分鐘。加入50 u L/孔H2S04(2M)終止反應(yīng),于波長490nm測定吸光度。實驗中以 PBST組為空白對照、以rBCG-361及BCG組血清為陰性對照,以結(jié)核病人血清作為陽性對照 (1 100稀釋),檢測各組小鼠血清特異性抗體滴度。結(jié)果以雙復孔A值均值表示,當A值 > 0. 05,A實驗組/A對照組> 2. 0時,判為陽性,以出現(xiàn)陽性反應(yīng)的最高稀釋度作為該樣本
9的抗體滴度。2. 3脾淋巴細胞分離免疫后6、8、10、12周各組隨機抽取2只小鼠,無菌分離脾臟,同組脾臟混合后,用 玻璃勻漿器研磨,經(jīng)200目篩網(wǎng)過濾,PBS洗滌1-2次,加入0. 83%NH4C1溶液(0. 15M NH4C1, 10mMNaHC03, ImM EDTA_Na2)混勻后靜置5分鐘以裂解紅細胞,1500rpm離心5分鐘,收集細 胞,加入含10% FBS和雙抗的RPMI1640,經(jīng)臺盼藍染色后細胞計數(shù),活細胞數(shù)在90%以上, 調(diào)整細胞密度為2X106/L進行后續(xù)實驗。2. 4特異性脾淋巴細胞增殖試驗(XTT)將上述分離培養(yǎng)的脾細胞加入96孔圓底培養(yǎng)板(0. lmL/孔),每組小鼠脾細胞做 6個復孔,并設(shè)陰性對照孔和調(diào)零孔,試驗孔加入25mg/L TB-PPD,對照孔不加特異性蛋白, 調(diào)零孔不加淋巴細胞。于37°C 5 % C02培養(yǎng)68小時后加入XTT (含lmg/mL XTT和0. 125mmoL/ L PMS)再培養(yǎng)4h,用酶標儀測定A450吸光值,結(jié)果用刺激指數(shù)表示,SI =刺激組/非刺激組。2. 5細胞因子的誘生將上述分離培養(yǎng)的脾細胞加入24孔培養(yǎng)板(0. 5mL/孔),每組小鼠脾細胞做3個 復孔,25mg/L TB-PPD刺激72h后,3000rpm離心5分鐘收集培養(yǎng)液上清,_70°C凍存?zhèn)溆?,?ELISA檢測試劑盒說明書測定IFN-Y和IL-4水平。根據(jù)標準品各孔的0D值及其所對應(yīng)的 標準品含量繪制標準曲線,然后根據(jù)待測樣品孔0D值從標準曲線上求出樣本中IFN-Y和 IL-4的含量。采用方差分析對各組的測得值進行差異顯著性分析,P < 0. 05為具有統(tǒng)計學
眉、o2. 6流式細胞術(shù)檢測T淋巴細胞⑶/及細胞亞群將上述分離培養(yǎng)的小鼠脾淋巴細胞轉(zhuǎn)入6孔板,每組做3個復孔(lmL/孔),同時 加入25mg/L TB-PPD刺激,培養(yǎng)72h后,3000rpm離心5分鐘收集細胞,用PBS洗滌2次,細胞 懸液加入PE熒光素標記的抗小鼠CD4+和FITC標記的CD8+抗小鼠一抗(eBioscience),4°C 避光 30min,再用 PBS_BSA_NaN3 (含 2% BSA 和 0. 5% NaN3 的 PBS)洗滌 2 次,再加入 400 u L PBS-BSA-NaN3,流式細胞儀檢測T淋巴細胞表面⑶/及細胞亞群所占比例。3 結(jié)果3. 1血清特異性抗體滴度測定rBCG:361組和卡介苗組在各時間點血清抗體滴度相差不明顯(P > 0. 05),而重組 BCG:GMCSF-CFP10組免疫小鼠的抗體滴度明顯高于rBCG:361組和卡介苗組,在8周時達到 高峰,然后逐漸回落,但仍顯著高于卡介苗組和rBCG: 361組(P < 0. 05)(見圖6)。BCG組和 rBCG:361組血清特異性IgG2a/IgGl比值在各個時間點變化趨勢基本一致,6周時IgG2a/ IgGl在1.5左右,然后逐漸降低,8-10周降至最低,12周比值稍有增高,rBCG:361組高于 BCG 組;rBCG:GC 組血清 IgG2a/IgGl 在 6 周時較低,8、10、12 周 IgG2a/IgGl 均高于 rBCG: 361 組和BCG組,12w升至增高(見圖7)。3. 2特異性淋巴細胞增殖實驗各組經(jīng)皮下免疫小鼠后,脾淋巴細胞增殖活性均較PBST組明顯升高,且有增高的 趨勢,并在第10周時達到最高,隨后逐漸降低;其中,rBCG:361組和卡介苗組比較,刺激指 數(shù)差異不顯著(P > 0. 05),而重組BCG:GMCSF-CFP10組脾淋巴細胞增殖活性顯著高于卡介
10苗組和 rBCG:361 組(P < 0. 05)(見圖 8)。3. 3細胞因子的誘生各免疫小鼠脾淋巴細胞IFN-Y水平均較PBST明顯升高,且有增高的趨勢,在免疫 后10周達到高峰,隨后逐漸降低;其中,rBCG:361組和卡介苗組比較,IFN-Y產(chǎn)生差別不 大(P> 0.05),而重組BCG:GMCSF-CFP10組脾淋巴細胞IFN-y產(chǎn)生顯著高于卡介苗組和 rBCG:361組(P < 0.05)(見圖9)。而各組細胞因子IL-4在各時間點產(chǎn)生均不明顯,未達 到試劑盒檢測的最低濃度,0D值維持在0. 015左右。3. 4免疫小鼠脾淋巴細胞亞群的變化卡介苗組、rBCG:361組和重組BCG:GMCSF_CFP10組小鼠脾淋巴細胞CD4+T細胞與 PBST組相比均有增高的趨勢,在免疫后10周達到最高,其中,卡介苗組和rBCG: 361組
細胞的比例相當(P > 0. 05),而重組卡介苗rBCG:GMCSF-CFP10組細胞比例明顯高于 PBST組、卡介苗組rBCG: 361組(P < 0. 05)(見圖10) ;BCG:GMCSF_CFP10組小鼠脾淋巴細胞 細胞比例在各時間點也顯著高于其它組,至12周細胞比例達到最高(P < 0. 05) (見圖 11,12)。4 結(jié)論共表達人GMCSF和結(jié)核分枝桿菌CFP10外源蛋白的重組卡介苗rBCG GMCSF-CFP10 免疫原性優(yōu)于傳統(tǒng)卡介苗,為研制具有特異性抗結(jié)核桿菌免疫保護和佐劑增強雙重效應(yīng)的 新型重組BCG疫苗奠定了基礎(chǔ)。
權(quán)利要求
一種重組卡介苗rBCGGMCSF-CFP10,其特征在于,能夠穩(wěn)定的表達GMCSF-CFP10嵌合蛋白。
2.如權(quán)利要求1所述的重組卡介苗,其特征在于,免疫原性強于傳統(tǒng)卡介苗。
3.如權(quán)利要求1所述的重組卡介苗的制備方法,其特征在于,該方法包括以下幾個步驟(1)hGM-CSF基因的擴增、結(jié)核分枝桿菌CFPlO基因的擴增;(2)GMCSF-CFP10嵌合基因的擴增;(3)將GMCSF-CFP10嵌合基因插入至大腸桿菌-結(jié)核分枝桿菌穿梭質(zhì)粒pMV361中,構(gòu) 建rpMV361GMCSF-CFP10 ;(4)將(3)中的重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化入卡介苗。
4.如權(quán)利要求1所述的重組卡介苗,其特征在于,通過抗生素篩選、提取基因組、PCR及 誘導表達后進行Western-blot鑒定,得到rBCG :GMCSF_CFP10。
5.一種重組質(zhì)粒,其特征在于,用基因工程技術(shù)將人粒_巨噬細胞集落刺激因子 (hGM-CSF)序列和結(jié)核分枝桿菌CFPlO基因序列嵌合后插入大腸桿菌-結(jié)核分枝桿菌穿梭 質(zhì)粒序列中。
6.如權(quán)利要求5所述的重組質(zhì)粒,其特征在于,大腸桿菌_結(jié)核分枝桿菌穿梭質(zhì)粒為 PMV361。
7.如權(quán)利要求5所述的重組質(zhì)粒,其特征在于,將人GM-CSF基因序列和結(jié)核分枝桿菌 CFPlO基因序列連接后插入大腸桿菌_結(jié)核分枝桿菌穿梭質(zhì)粒的多克隆位點處。
8.如權(quán)利要求5所述的重組質(zhì)粒,其特征在于,用PCR、酶切和測序鑒定,得到重組質(zhì)粒 rpMV361GMCSF-CFP10。
9.如權(quán)利要求1所述的重組卡介苗,其特征在于,將如權(quán)利要求5所述的重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn) 化入卡介苗,得到rBCG :GMCSF-CFP 10。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種人GM-CSF基因與結(jié)核分枝桿菌CFP10基因嵌合表達GMCSF-CFP10蛋白重組卡介苗的構(gòu)建及其免疫原性研究,即利用基因工程技術(shù)將人GM-CSF基因和結(jié)核分枝桿菌CFP10基因序列插入到同一大腸桿菌-結(jié)核分枝桿菌穿梭質(zhì)粒pMV361的序列中,構(gòu)建重組穿梭質(zhì)粒rpMV361GMCSF-CFP10。然后采用電穿孔的方法將上述載體導入卡介苗,構(gòu)建重組卡介苗rBCGGMCSF-CFP10。本發(fā)明構(gòu)建的重組卡介苗可以穩(wěn)定的表達人GM-CSF與結(jié)核分枝桿菌CFP10嵌合蛋白GMCSF-CFP10,其免疫原性優(yōu)于傳統(tǒng)卡介苗。本發(fā)明提供了一種重組卡介苗的制備過程,并研究了其免疫性,屬于基因工程領(lǐng)域和結(jié)核疫苗領(lǐng)域。本發(fā)明將更有效的預(yù)防結(jié)核病的發(fā)生及傳播。
文檔編號C12N15/63GK101850111SQ201010140350
公開日2010年10月6日 申請日期2010年4月7日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月7日
發(fā)明者楊曉玲, 鄧儀昊, 鮑朗 申請人:四川大學