專利名稱：用于癌癥治療的對接和鎖定(dnl)疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于癌癥(如多發(fā)性骨髓瘤)治療的基于樹突狀細胞的體內(nèi)靶向抗原的疫苗的設(shè)計和產(chǎn)生。在優(yōu)選的實施例中，通過對接和鎖定(DNL)方法產(chǎn)生這些疫苗，其中效應(yīng)子部分連接于源自AKAP蛋白的錨定域(AD)和源自蛋白激酶A (PKA)的二聚及對接域 (DDD)部分。DNL復(fù)合體在DDD部分自發(fā)地二聚并與AD部分結(jié)合時產(chǎn)生，所得到的復(fù)合體的DDD與連接AD的效應(yīng)子之間的化學(xué)計量比為2 1。在更優(yōu)選的實施例中，效應(yīng)子部分包含人化抗CD74抗體和腫瘤相關(guān)異種抗原(如CD20異種抗原)。在最優(yōu)選的實施例中，抗 CD74抗體為hLLl抗體。DNL構(gòu)建體可用于制備藥物組合物、用于產(chǎn)生針對癌癥(如多發(fā)性骨髓瘤(MM))的疫苗以及用于誘導(dǎo)針對表達腫瘤抗原的細胞(如患有多發(fā)性骨髓瘤和其它表達CD20的癌的患者中的CD20陽性癌細胞)的免疫反應(yīng)。
相關(guān)技術(shù) 多發(fā)性骨髓瘤(MM)是惡性血液腫瘤，其特征是骨髓中的贅生性漿細胞的克隆樣增生。盡管MM對許多化學(xué)治療劑有反應(yīng)，但其基本上仍難以治愈，并且大多數(shù)患者最終會復(fù)發(fā)，這是因為存在一小群MM癌干細胞，這些癌干細胞可在經(jīng)標準或高劑量化學(xué)治療下存活，并且對化學(xué)治療藥物具有抗性(Reece等，Leuk Lymphoma，2008，49 1470-85)。此少量的MM癌干細胞構(gòu)成微小的殘留病變并引起復(fù)發(fā)，最終導(dǎo)致所有治療的失敗。因此，根除MM 癌干細胞可長期控制或甚至治愈MM。
近來，從MM患者的MM細胞系和初級骨髓中鑒別出一小群克隆型B細胞，這些細胞不表達特性漿細胞表面抗原⑶138，但確實表達B細胞抗原⑶20 (Matsui等，Blood 2004， 103 :2332-6)。這一小群細胞對許多臨床抗骨髓瘤藥物有抗性，并且能夠進行離體克隆性生長(Matsui 等，Blood 2004，103 :2332-6 ；Matsui 等，Cancer Res. 2008,68 :190-7)以及在 3D培養(yǎng)模型中克隆性生長(Kirshner等，Blood 2008，112 :2935-45)，且能夠離體地分化成 MM細胞以及在植入N0D/SCID小鼠中(初次移植和再次移植期間)分化成MM細胞(Matsui 等，Cancer Res. 2008，68 190-7)。因此已提出這些CD138MgCD20+細胞代表假定的多發(fā)性骨髓癌干細胞(Huff 和 Matsui，J Clin Oncol. 2008，26 :2895-900)。
類似于其它癌干細胞，MM癌干細胞耐受許多化學(xué)治療藥物，并且是腫瘤再生長和復(fù)發(fā)的原因(Huff 和 Matsui，J Clin Oncol. 2008，26 J895-900 ;Yang 和 Chang，Cancer divest. 2008，沈741-55)。需要可選擇性地靶向并根除癌干細胞(如MM干細胞)的策略和方法。由于癌干細胞的多重抗藥性，免疫療法和疫苗接種可提供潛在的方式根除這些細胞，特別是在進行標準療法和/或干細胞移植之后，腫瘤負荷大幅減少之時。需要探索針對性治療多發(fā)性骨髓瘤的免疫療法和疫苗接種的有效組合物及方法，特別是能夠誘導(dǎo)針對MM 癌干細胞的免疫反應(yīng)、抑制或根除MM癌干細胞的組合物及方法。進一步需要探索針對性治療一般癌癥的免疫療法和疫苗接種的有效組合物及方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明公開了用于針對癌干細胞(如匪干細胞)的疫苗的方法和組合物，所述組合物是通過采用對接和鎖定(DNL)方法制備的(Chang等，2007，Clin Cancer Res 13: 5586s-91s)。DNL技術(shù)已用于產(chǎn)生適于體內(nèi)應(yīng)用的各種穩(wěn)定和確定的復(fù)合體。在優(yōu)選的實施例中，DNL復(fù)合體包含連接于二聚及對接域(DDD)或錨定域(AD)部分的抗⑶74抗體或其抗原結(jié)合片段(如hLLl抗體)。DDD部分自發(fā)地二聚且每個DDD 二聚體與AD部分結(jié)合。 在更優(yōu)選的實施例中，互補AD或DDD部分連接于CD20異種抗原(如下文進一步詳述)，結(jié)果形成包含抗CD74部分和CD20異種抗原部分的DNL復(fù)合體。然而，技術(shù)人員會意識到，根據(jù)癌癥的情況，可利用不同的異種抗原和/或抗體或抗體片段?？贵w組分將DNL復(fù)合體導(dǎo)向諸如樹突狀細胞(DC)的抗原呈遞細胞(APC)，而異種抗原組分的進程引起針對表達靶抗原的細胞的免疫反應(yīng)。
在請求保護的方法和組合物的范圍內(nèi)可以構(gòu)建和使用具有不同結(jié)構(gòu)和不同的靶抗原(如CD20)與抗體或抗體片段之比的各種類型的DNL復(fù)合體，如以下當中所公開的那些美國專利No. 7，550，143 (其第觀欄第30行至第44欄第觀行以引用的方式并入本文)； 美國專利No. 7，521，056 (其第58欄第1行至第84欄第45行以引用的方式并入本文)；美國專利No. 7，534，866 (其第31欄第1行至第36欄第38行以引用的方式并入本文)；美國專利No. 7，527，787 (其第61欄第51行至第94欄第65行以引用的方式并入本文)以及美國專利申請公開No. 2009/006082(其W035]段至W097]段以引用的方式并入本文)。由三聚體、四聚體、五聚體、六聚體及其它結(jié)構(gòu)組成的DNL復(fù)合體已經(jīng)報道在以上引用的公布專利中。
在最優(yōu)選的實施例中，該抗癌疫苗DNL構(gòu)建體包含人化或嵌合LLl抗CD74 抗體或其抗原結(jié)合片段，該抗體或其抗原結(jié)合片段包含輕鏈可變互補決定區(qū)(CDR) 序列 CDRl(RSSQSLVHRNGNTYLH ；SEQ ID NO 1) , CDR2(TVSNRFS ；SEQ ID NO 2)禾口 CDR3 (SQSSHVPPT ；SEQ ID NO 3)以及重鏈可變區(qū) CDR 序列 CDRl (NYGVN ;SEQ ID NO :4)、 CDR2 (WINPNTGEPTFDDDFKG ；SEQ ID NO 5)和 CDR3 (SRGKNEAWFAY ；SEQ ID NO 6)。適用于請求保護的DNL復(fù)合體的人化LLl (hLLl)抗⑶74抗體公開于美國專利No. 7，312，318中，該專利的第35欄第1行至第42第27行以及圖1至圖4以引用的方式并入本文。作為另外的選擇，可利用其它抗CD74抗體或針對其它APC或DC相關(guān)抗原的抗體。
適用于抗癌疫苗DNL復(fù)合體中的各種CD20異種抗原的序列是本領(lǐng)域中已知的， 如鼠⑶20序列(SEQ ID NO :7)。技術(shù)人員通過諸如NCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(見例如，NCBI Accession No. NP 031667 ；P19437 ；AAA37394 ；BAE47068 ；ABA29631 ；BAD77809)之類的公知公用數(shù)據(jù)庫可易于獲得其它可能使用的CD20氨基酸序列。盡管本文提及了鼠CD20序列， 但技術(shù)人員會意識到CD20氨基酸序列是已知的且可從多種物種中獲得，并且可結(jié)合到抗癌疫苗DNL復(fù)合體當中。然而，技術(shù)人員會意識到，其它腫瘤相關(guān)抗原(TAA)在本領(lǐng)域中是已知的，并且可用于DNL復(fù)合體中來誘導(dǎo)針對表達不同TAA的腫瘤的免疫反應(yīng)。
具有潛在用途的已知TAA包括但不限于碳酸酐酶IX、甲胎蛋白、α -輔肌動蛋白-4、A3、Α33 抗體特異性抗原、ART-4、Β7、Ba 733、BAGE、BrE3-抗原、CAl25、CAMEL、CAP-I、 CASP-8/m、CCCL19、CCCL21、CDl、CDla, CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CDl 1A、CD14、CD15、CD16、 CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD29、CD30、CD32b、CD33、CD37、CD38、CD40、 CD40L、CD45、CD46、CD52、CD54, CD55、CD59、CD64、CD66a_e、CD67、CD70、CD74、CD79a、CD80、 CD83、CD95、CD126、CD133、CD138、CD147、CD154、CDC27、CDK_4/m、CDKN2A、結(jié)腸特異性抗原-ρ (CSAp)、CEA(CEACAMQ、CEACAM6、DAM、EGFR、EGFRvIII、EGPl、EGP-2、ELF2-M、Ep-CAM、 Flt-U Flt-3、葉酸鹽受體、G250 抗原、GAGE、gplOO、GROB, HLA-DR、HMl. 24、人體絨毛膜促性腺激素(HCG)及其亞單元、HER2/neu、HMGB-l、缺氧誘導(dǎo)因子(HIF-I)、HSP70-2M、HST-2、 la、IGF-1R、IFN-y、IFN- α、IFN- β、IL-2、IL-4R、IL-6R、IL-13R、IL-15R、IL-17R、IL-18R、 IL-6、IL-8、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-25、胰島素樣生長因子-1 (IGF-1)、KC4_ 抗原、 KS-I-抗原、KS 1-4、Le-Y, LDR/FUT、巨噬細胞移動抑制因子(MIF)、MAGE、MAGE-3、MART-1、 MART-2、NY-ES0-1、TRAG-3、mCRP、MCP-U MIP-1A、MIP-1B、MIF、MUCl、MUC2、MUC3、MUC4、 MUM-1/2, MUM-3、NCA66、NCA95、NCA90、PAM-4抗體特異性抗原、胎盤生長因子、p53、前列腺酸性磷酸酶、PSA、PRAME, PSMA、PlGF、ILGF、ILGF-1R、IL-6、IL-25、RS5、RANTES, TlOl、 SAGE、S100、存活素、存活素-2B、TAC、TAG-72、腱生蛋白、TRAIL受體、TNF-α、Tn抗原、 TF(Thomson-Friedenreich)抗原、腫瘤壞死抗原、VEGFR、ED-B 纖連蛋白、WT-1U7-1A-抗原、補體因子〔3、033、0313、(^1、05、血管生成標記物、1^1-2、1^1-6、1(儀8、0]\^1\致癌基因標記物和致癌基因產(chǎn)物(見例如，Sensi 等，Clin Cancer Res 2006,12 :5023-32 ；Parmiani 等，J Immunol 2007，178 1975-79 ;Novellino 等，Cancer Immunol Immunother 2005,54 187-207)。諸如鼠蛋白氨基酸序列的異種抗原氨基酸序列可易于從諸如NCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫的公用數(shù)據(jù)庫獲得。
技術(shù)人員會進一步意識到，有可能將其它已知的抗體或其抗原結(jié)合片段結(jié)合到抗癌疫苗DNL構(gòu)建體當中。在優(yōu)選的實施例中，抗體與由APC、更優(yōu)選由樹突狀細胞表達的抗原結(jié)合。多種與樹突狀細胞相關(guān)的抗原是本領(lǐng)域中已知的，這些抗原包括但不限于 CD209 (DC-SIGN)、CD34、CD74、CD205、TLR 2 (鐸樣受體 2)、TLR 4、TLR 7、TLR 9、BDCA-2、 BDCA-3、BDCA-4和HLA-DR。在優(yōu)選的實施例中，靶抗原為⑶74。然而，已知其它類型的靶抗原與樹突狀細胞相關(guān)，且結(jié)合靶向任何這種備選抗原的抗體的抗癌疫苗DNL構(gòu)建體可用于請求保護的方法和組合物中。在一些實施例中，抗癌疫苗DNL構(gòu)建體可包含抗CD74抗體或其抗原結(jié)合片段以及另一抗樹突狀細胞抗體或片段?？捎糜诳拱┮呙鏒NL構(gòu)建體的示例性抗體包括但不限于hLLl (抗CD74，美國專利No. 7，312，318)和hL243 (抗HLA-DR，美國專利申請No. 11/368，四6)，這兩者的實例部分均以引用的方式并入本文。
優(yōu)選使用嵌合抗體，因為它們具有人抗體恒定區(qū)序列，因此不會引起如鼠抗體那樣強的人抗鼠抗體(HAMA)反應(yīng)。甚至更優(yōu)選使用人化抗體，以便進一步降低誘導(dǎo)HAMA反應(yīng)的可能性。如下文所討論，通過用相應(yīng)的人抗體框架和恒定區(qū)序列取代鼠框架和恒定區(qū)序列使鼠抗體人化的技術(shù)在本領(lǐng)域內(nèi)已熟知且已應(yīng)用于許多鼠抗癌抗體中?？贵w人化還可涉及用來自親本鼠框架區(qū)序列的相應(yīng)殘基來取代一個或多個人框架氨基酸殘基。也如下文所討論，用于產(chǎn)生人抗體的技術(shù)也已熟知，且這種抗體可結(jié)合到受試者抗癌疫苗構(gòu)建體當中。
在某些實施例中，可將抗癌疫苗DNL構(gòu)建體與至少一種治療劑聯(lián)合施用，該治療劑可在構(gòu)建體之前、與其同時或在其后施用。在優(yōu)選的實施例中，治療劑在抗癌疫苗之前施用。然而，在可供選擇的實施例中，治療劑可與DNL構(gòu)建體聯(lián)合施用或甚至與DNL構(gòu)建體綴合。如下文更為詳細的討論，本領(lǐng)域已知的任何治療劑均可與抗癌疫苗DNL構(gòu)建體聯(lián)合使用，這些治療劑包括但不限于放射性核素、免疫調(diào)節(jié)劑、抗血管生成劑、細胞因子、趨化因子、生長因子、激素、藥物、前體藥物、酶、寡核苷酸、SiRNA、促凋亡劑、光敏治療劑、細胞毒素劑、化學(xué)治療劑、毒素、其它抗體或其抗原結(jié)合片段。
在一個優(yōu)選的實施例中，治療劑為細胞毒素劑，如藥物或毒素。還優(yōu)選的是，該藥物選自氮芥、乙撐亞胺衍生物、烷基磺酸鹽、亞硝基脲、吉西他濱、三氮烯、葉酸類似物、蒽環(huán)霉素、紫杉烷、C0X-2抑制劑、嘧啶類似物、嘌呤類似物、抗生素、酶抑制劑、表鬼白毒素、鉬配位絡(luò)合物、長春花生物堿、取代脲、甲基胼衍生物、腎上腺皮質(zhì)抑制劑、激素拮抗劑、內(nèi)皮他丁、紫杉酚、喜樹堿、SN-38、阿霉素及其類食物、抗代謝物、烷化劑、抗有絲分裂物質(zhì)、抗血管生成劑、酪氨酸激酶抑制劑、mTOR抑制劑、熱休克蛋白(HSP90)抑制劑、蛋白酶體抑制劑、 HDAC抑制劑、促凋亡劑、甲氨蝶呤、CPT-Il以及它們的組合。
在另一優(yōu)選的實施例中，治療劑為選自以下的毒素篦麻毒素、相思豆毒素、α毒素、皂草素、核糖核酸酶(RNA酶)、DNA酶I、葡萄球菌腸毒素Α、商陸抗病毒蛋白、白樹毒素、白喉毒素、假單胞菌外毒素和假單胞菌內(nèi)毒素以及它們的組合?；蛘邽檫x自以下的免疫調(diào)節(jié)劑細胞因子、干細胞生長因子、淋巴毒素、成血因子、菌落刺激因子(CSF)、干擾素 (IFN)、干細胞生長因子、促紅細胞生成素、促血小板生成素以及它們的組合。
在其它優(yōu)選的實施例中，治療劑為選自mh、mLu、212Bi、213Bi、211At、62CU、67CU、9°Y、 125I、131I、32P、33P、47SC、mAg、67Ga、142Pr、153Sm、161Tb、166Dy、166H0、186Re、188Re、189Re、212Pb、223Ra、 ”5Ac、59!^、75k J7AsJ9SiN99McK1c15RtK1c19PcU 143ft~、149Pm、lfi9Er、194Ir、198AU、199AU 和 211Pb 及其組合的放射性核素。還優(yōu)選的是隨俄歇發(fā)射粒子而充分衰變的放射性核素。例如，Co-58、Ga-67、 Br-80m、Tc_99m、Rh_103m、Pt-109、In-Ill、Sb-119、1-125、Ho-161、0s_189m 和 Ir-192。 有用的發(fā)射β粒子的核素的衰變能優(yōu)選小于l，000keV，更優(yōu)選小于lOOkeV，最優(yōu)選小于 <70keV。還優(yōu)選的是隨α粒子產(chǎn)生而充分衰變的放射性核素。這種放射性核素包括(但不限于)Dy-152、At-211、Bi-212、Ra-223、Rn-219、Po-215、Bi-211、Ac-225、Fr-221、At-217、 Bi-213和Fm-255。有用的發(fā)射α粒子的放射性核素的衰變能優(yōu)選為2，000-10，OOOkeV， 更優(yōu)選為3，000-8, OOOkeV，最優(yōu)選為4，000-7, OOOkeV。可能應(yīng)用的其它放射性同位素包括 11Cj3Nj5Oj5Bni98AuJ24AGi26L133IJ7Bn113In^Riu 97Riu imRu、艦Riu1ci7Hg^3Hg, 1211e、 122mI^i25mThl65TnKl67TnKl68TnKi97Ptjc19Pcuic15RtKi42PiNi43PiNl6lTlKl66HcKi99Aiu57CcK58CcK51CiN 59Fe J5Se^1TL225AcJ6BiN16Ib等。在其它實施例中，治療劑為選自發(fā)色團和染料的光敏治療劑。
作為另外的選擇，治療劑為選自以下的酶蘋果酸脫氫酶、葡萄球菌核酸酶、δ-V 型類固醇異構(gòu)酶、酵母乙醇脫氫酶、α -磷酸甘油脫氫酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶、辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β -半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、過氧化氫酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、葡糖淀粉酶和乙酰膽堿酯酶。這種酶可與(例如)前體藥物聯(lián)合使用，這些前體藥物可以相對無毒的形式施用并在靶位點由酶轉(zhuǎn)化成細胞毒素劑。在其它可供選擇的方案中，藥物可通過受試者中的內(nèi)源酶轉(zhuǎn)化成低毒形式，但也可通過治療酶再轉(zhuǎn)化成細胞毒素形式。
雖然在優(yōu)選的實施例中，抗癌疫苗DNL復(fù)合體可用于治療多發(fā)性骨髓瘤，但技術(shù)人員會意識到CD20/抗CD74構(gòu)建體可潛在地用于其它類型的疾病，如其它形式的CD20+癌癥，如B細胞淋巴瘤、B細胞白血病、急性淋巴細胞性白血病、慢性淋巴細胞性白血病、濾泡性淋巴瘤、外套細胞淋巴瘤、小淋巴細胞性淋巴瘤、彌漫性B細胞淋巴瘤、邊緣區(qū)淋巴瘤、伯基特淋巴瘤(Burkitt lymphoma)、何杰金氏淋巴瘤(Hodgkin' s lymphoma)或非何杰金氏淋巴瘤(non-Hodgkin' s lymphoma) 0若使用不同于⑶20的腫瘤相關(guān)異種抗原，技術(shù)人員會意識到，使用請求保護的DNL復(fù)合體可靶向帶有相關(guān)TAA的任何類型的癌。
還有其它實施例涉及編碼融合蛋白(如抗體-DDD或異種抗原-DDD融合蛋白或者抗體-AD或異種抗原-AD融合蛋白)的DNA序列、包含所述DNA序列的載體和宿主細胞以及制備用于產(chǎn)生抗癌疫苗DNL構(gòu)建體的融合蛋白的方法。相關(guān)的實施例包括用于制備抗癌疫苗DNL構(gòu)建體的融合蛋白、抗體-DDD或異種抗原-DDD融合蛋白或者抗體-AD或異種抗原-AD融合蛋白。在可供選擇的實施例中，可通過例如抗體或抗體片段與DDD肽或CD20異種抗原與AD肽的化學(xué)交聯(lián)形成DNL復(fù)合體的亞單元組分。就特定的實施例而言，融合蛋白或化學(xué)交聯(lián)的綴合物可連接于諸如診斷劑的報告部分。多種診斷劑是本領(lǐng)域中已知的，如放射性核素、造影劑、熒光劑、化學(xué)發(fā)光劑、生物發(fā)光劑、順磁離子、酶和光敏診斷劑。
優(yōu)選地，診斷劑為能量介于20KeV與4，OOOKeV的放射性核素或選自以下的放射性核素:110h、mIn、117LU、18F、5午θ、62^!、64^!、67^!、6^!、 ^、’、9’、8^、94"^、94!^、99"^、120!、 123l、124l、125l、131l、154-158Gd、32p、llc、13N、15o、186Re、188Re、5lMn、52mMn、55Co、72As、75Br、7fiBr、82mRb、
83Sr或其它Y-、或正電子發(fā)射體。
還優(yōu)選的是，診斷劑為順磁離子，如鉻(III)、錳(II)、鐵(III)、鐵(II)、鈷(II)、 鎳(II)、銅(II)、釹(III)、釤(III)、鐿(III)、釓(III)、釩(II)、鋱(III)、鏑(III)、鈥 (III)和鉺(III)；或不透射線的材料，如鋇、泛影酸鹽(diatrizoate)、乙碘油、檸檬酸鎵、 碘卡明酸、碘西他酸、碘達酸、膽影酸、碘沙酸、碘古酰胺(iogulamide)、碘海醇、碘帕醇、 碘番酸、碘普西酸、碘西法酸、碘絲酸、碘砜葡胺、iosemetic acid、碘酞硫、碘得酸、異泛影酸、碘托西酸、碘克沙酸、羥泛影酸、碘泊酸鹽(ipodate)、葡甲胺、甲泛葡胺、甲泛影酸鹽 (metrizoate)、丙碘酮和氯化亞鉈。
還在其它實施例中，診斷劑為選自異硫氰酸熒光素、羅丹明、藻紅蛋白、藻藍蛋白、 別藻藍蛋白、鄰苯二醛和熒光胺的熒光標記化合物、選自魯米諾、異魯米諾、芳族吖啶酯、 咪唑、吖啶鹽和草酸酯的化學(xué)發(fā)光標記化合物或選自瑩光素、熒光素酶和水母發(fā)光蛋白 (aequorin)的生物發(fā)光化合物。
具體實施例方式定義 如本文所用，術(shù)語“一”和“所述”可指單數(shù)或復(fù)數(shù)，除非上下文以其它方式明確其僅指單數(shù)。
如本文所用，術(shù)語“約”是指數(shù)值增加或減少百分之十(10% )。例如，“約100”是指介于90與110之間的任何數(shù)值。
抗體是指全長(即天然存在的或通過正常免疫球蛋白基因片段重組方法形成的) 免疫球蛋白分子(例如IgG抗體)或免疫球蛋白分子的免疫活性的抗原結(jié)合部分(如抗體片段)。
抗體片段是指抗體的一部分，如F(ab丨)2、F(ab)2、Fab'、Fab、Fv、scFv等。無論結(jié)構(gòu)如何，抗體片段均與由完整抗體識別的相同抗原結(jié)合。因此，該術(shù)語與“抗原結(jié)合抗體片段”的使用含義相同。術(shù)語“抗體片段”還包括由可變區(qū)組成的分離片段，如由重鏈和輕鏈的可變區(qū)組成的“Fv”片段，以及其中輕鏈與重鏈的可變區(qū)通過肽連接體連接的重組單鏈多肽分子(“scFv蛋白”)。如本文所用，術(shù)語“抗體片段”不包括無抗原結(jié)合活性的抗體部分，如Fc片段或單個氨基酸殘基。其它抗體片段(例如單域抗體片段)是本領(lǐng)域中已知的且可用于請求保護的構(gòu)建體中(見例如Muyldermans等，TIBS26 =230-235,2001 ；Yau等，J Immunol Methods 281161-75，2003 ；Maass 等，J Immunol Methods 324 13-25，2007)。
術(shù)語SM^m可指重組產(chǎn)生的抗原結(jié)合分子，其中具有相同或不同特異性的一個或多個相同或不同的單鏈抗體或抗體片段部分相連接。融合蛋白的價(valency)是指該融合蛋白所具有的與單抗原或表位結(jié)合的結(jié)合臂或位點的數(shù)目，即單價、二價、三價或多價。抗體融合蛋白的多價是指其可利用多種相互作用與抗原結(jié)合，從而提高與抗原結(jié)合的親合力。特異性是指抗體融合蛋白能夠結(jié)合的抗原或表位數(shù)，即單特異性、雙特異性、三特異性、多特異性。根據(jù)這些定義，天然抗體，例如IgG，由于其具有兩個結(jié)合臂而為單價，但由于其與一個表位結(jié)合而為單特異性。單特異性的多價融合蛋白具有不止一個表位的結(jié)合位點，但僅與一個表位結(jié)合。融合蛋白可包含單抗體組分、不同抗體組分的多價或多特異性的組合或相同抗體組分的多個拷貝。融合蛋白可另外包含抗體或抗體片段以及治療劑。適于這種融合蛋白的治療劑的例子包括免疫調(diào)節(jié)劑和毒素。一種優(yōu)選的毒素包含核糖核酸酶 (RNA酶)，優(yōu)選為重組RNA酶。然而，該術(shù)語不是限制性的，多種蛋白質(zhì)或肽效應(yīng)子可結(jié)合到融合蛋白當中。在另一非限制性實例中，融合蛋白可包含用于產(chǎn)生如下所述DNL構(gòu)建體的AD或DDD序列。
嵌合抗體是含有包括源自一個物種的抗體互補決定區(qū)(OTR)在內(nèi)的可變域的重組蛋白質(zhì)，該抗體優(yōu)選為嚙齒動物抗體，而抗體分子的恒定區(qū)源自人抗體的恒定區(qū)。就獸醫(yī)應(yīng)用而言，嵌合抗體的恒定區(qū)可源自其它物種，如貓或犬。
人化抗體為重組蛋白質(zhì)，其中將來自一個物種的抗體(如嚙齒動物抗體)的CDR 從嚙齒動物抗體的重可變鏈和輕可變鏈轉(zhuǎn)移至人重鏈和輕鏈可變域(例如框架區(qū)序列)當中?？贵w分子的恒定域源自人抗體的恒定域。在某些實施例中，有限數(shù)目的來自親本(嚙齒動物)抗體的框架區(qū)氨基酸殘基可取代到人抗體框架區(qū)序列當中。
人抗體是例如從轉(zhuǎn)基因小鼠中獲得的抗體，這種小鼠已“經(jīng)過改造”而可響應(yīng)抗原刺激產(chǎn)生特異性人抗體。在此技術(shù)中，將人重鏈和輕鏈基因座的元件引入到源自胚胎干細胞系的小鼠品系當中，所述胚胎干細胞系具有內(nèi)源鼠重鏈和輕鏈基因座的靶向斷裂。轉(zhuǎn)基因小鼠能夠合成對特定抗原具有特異性的人抗體，這些小鼠可用于產(chǎn)生分泌人抗體的雜交瘤。從轉(zhuǎn)基因小鼠中獲得人抗體的方法由下列學(xué)者進行了描述=Green等，Nature Genet. 7 13(1994) ；Lonberg 等，Nature368 :856(1994)；和 Taylor 等，Int. Immun. 6 :579 (1994)。也可以通過基因或染色體轉(zhuǎn)染方法以及噬菌體展示技術(shù)來構(gòu)建全人抗體，所有這些技術(shù)都是本領(lǐng)域中是已知的。見例如，McCafferty等，Nature348 :552-553 (1990)，其描述了從未免疫供體的免疫球蛋白可變域基因譜中離體產(chǎn)生人抗體及其片段。在此技術(shù)中，將抗體可變域基因按閱讀框架克隆到絲狀噬菌體的主要或次要的外殼蛋白基因當中，并在噬菌體顆粒表面上展示為功能性抗體片段。因為絲狀顆粒含有噬菌體基因組的單鏈DNA拷貝，所以基于抗體功能特性的選擇也導(dǎo)致對編碼顯示出那些特性的抗體的基因進行選擇。以此方式，噬菌體模擬了 B細胞的一些特性。噬菌體展示可以多種格式實施，作為回顧，見例如 Johnson禾口 Chiswell,Current Opiniion in Structural Biology 3 :5564-571 (1993)。也可通過離體活化B細胞來產(chǎn)生人抗體。見美國專利No. 5，567，610和No. 5，229，275，其實例部分以引用的方式并入本文。


圖1. hLLl在人血DC亞群、B細胞和單核細胞上的特異性結(jié)合。(A)不同APC亞群的門控策略。(B)⑶74在APC中的表達。(C)hLLl在細胞上的結(jié)合效率。數(shù)字代表平均熒光強度。
圖2.⑶74在源于人單核細胞的未成熟(對比成熟)的DC中的表達，以及hLLl 與源于人單核細胞的未成熟(對比成熟)的DC的結(jié)合效率。將源于人單核細胞的DC(在 hGM-CSF和hIL-4的存在下培養(yǎng)后第5天)用FITC標記的抗CD74抗體或AlexaFluor488 標記的hLLl染色，同時結(jié)合用抗HLA-DR和⑶83的熒光標記的mAb染色。對HLA-DR陽性細胞進行門控和分析。(A) CD74在未成熟和LPS成熟的DC中的表達。(B) hLLl與未成熟(對比LPS成熟)的DC的結(jié)合。(C)在未成熟和成熟的DC中⑶83、HLA-DR、⑶74的表達以及 hLLl結(jié)合的比較。
圖3. hLLl對B細胞惡性Daudi細胞和正常DC的細胞毒性效應(yīng)的并列比較。㈧ hLLl對Daudi和DC的影響的比較。(B)延長劑量時間后hLLl對DC的細胞活力的影響。 (C) hLLl對Daudi細胞的細胞毒性影響。(D)顯微圖像顯示hLLl對DC活力無影響。
圖4.通過hLLl對DC結(jié)構(gòu)成熟度的適度增強。從源于人單核細胞在hGM_CSF和 hIL-4的存在下第5天的DC中門控HLA-DR陽性細胞群。㈧通過流式細胞術(shù)測量抗原呈遞分子HLA-DR、共刺激分子⑶M和⑶86的表達。(B)抗原呈遞分子HLA-DR、共刺激分子 ⑶討和⑶86的表達水平。
圖5. hLLl對DC介導(dǎo)的T細胞增殖無顯著影響。將經(jīng)hLLl處理的DC與CFSE標記的異源PBMC共同培養(yǎng)8天㈧或11天(B)。將擴增T細胞用針對CD4的Percp綴合mAb 染色。分析了總T細胞、⑶4+和⑶4-T細胞的細胞增殖。
圖6.通過有利于朝Thl效應(yīng)細胞分化的hLLl處理的DC對原態(tài)⑶4+T細胞的極化。將采用磁珠分選柱(MACS)從人PBMC中分離的原態(tài)CD4+T細胞與hLLl處理的異源DC 共同培養(yǎng)。不同時間點(第11、13和18天)后收獲細胞，用PMA和離子霉素刺激，并通過用熒光標記的hIFN-γ和hIL-4抗體染色的細胞內(nèi)細胞因子進行分析。對Thl/Th2/Th0細胞群進行門控和分析。確定在由hLLl處理的DC或由GAH交聯(lián)的hLLl處理的DC刺激的T 細胞中的流動細胞因子產(chǎn)量。(C)示出在DC/T共培養(yǎng)后的不同天時，在沒有或存在通過GAH 交聯(lián)的情況下在兩個供體中的Thl響應(yīng)的數(shù)據(jù)。(D)通過hLLl來增加Thl群的劑量-效應(yīng)曲線。
用于治療多發(fā)性骨髓瘤和其它癌癥的疫苗 ⑶20通常在B細胞譜系的細胞中表達。據(jù)最近報道，⑶20在從MM細胞系或臨床標本中分離的MM細胞的小群中表達，這些MM細胞不表達特性漿細胞表面抗原⑶138，但具有高度的產(chǎn)克隆潛能，并且對多種臨床抗骨髓瘤藥物具有抗性(Matsui等，Blood 2004，103 2332-6 ；Matsui 等，Cancer Res. 2008,68 :190-7)。這些 CD20+CD138-細胞能夠離體地克隆性生長和在3D培養(yǎng)模型中克隆性生長(Kirshner等，Blood 2008，112 :2935-45)，并且能夠離體地分化成MM細胞以及在植入N0D/SCID小鼠模型中(初次移植和再次移植期間)分化成MM細胞。因此已提出這些⑶138胃CD20+細胞代表假定的多發(fā)性骨髓瘤癌干細胞。
貞1 豐丁石皮X寸罾.貞^^去白々免.貞而寸f十牛白々力fe。 午目關(guān) Ag(TAA)代表非先天免疫原性的組織分化Ag。識別這些具有高親合力的TAA/自體Ag的T 細胞在胸腺中被克隆性刪除或者在外周被去能化(anergized)。然而，已證實用異種抗原進行免疫能夠克服針對同源自體Ag的免疫耐受性。在I期臨床試驗中，在用負載重組小鼠PAP的樹突狀細胞免疫的21名前列腺癌患者中，有11名患者對同源自體Ag產(chǎn)生了 I型 T細胞增殖反應(yīng)，有6名患者表現(xiàn)出先發(fā)前列腺癌的臨床穩(wěn)定(Rmg等，J Immunol. 2001, 167(12) :7150-6)。這些結(jié)果表明異種抗原免疫可打破人體中對自體Ag的耐受性，從而在臨床上取得顯著的抗腫瘤效果。
CD20作為針對MM的免疫治療和疫苗接種的靶標。如上所沭,CD20為匪癌干細胞的標志。由于免疫耐受性的原因，作為大多數(shù)分化階段上在正常B細胞上表達的自體抗原在理論上難以通過疫苗策略被靶向。然而，已在B細胞淋巴瘤的腫瘤攻擊模型中通過針對 CD20的異種DNA疫苗成功地實現(xiàn)了疫苗接種。盡管通過靶向CD20的疫苗可誘導(dǎo)針對B細胞的自身免疫，但其不應(yīng)引起較大的問題，因為B細胞池并非重要和關(guān)鍵的組織，可由其系祖細胞補充?；谶@些考慮，靶向CD20的治療疫苗會有效地選擇性根除MM癌干細胞。
單克隆抗⑶20抗體作為用于根除匪干細胞的潛在形式。⑶20+MM祖細胞的發(fā)現(xiàn)推動了若干小臨床試驗的開展，用以測試利妥昔(rituximab，一種抗CD20單克隆抗體) 在MM患者中的功效。如Kapoor等(Br J Haematol. 2008，141 :135-48)所綜述，采用利妥昔的抗CD20療法在大約10%的患有多發(fā)性骨髓瘤的CD20+患者中誘導(dǎo)出局部反應(yīng)。此外，初步證據(jù)顯示50-57%的⑶20+患者的病情穩(wěn)定性持續(xù)10-27個月(Kapoor等，(Br J Haematol. 2008，141 :135-48)。此外，Bergua 等的病例報告(Leukemia. 2008,22 :1082-3) 中將利妥昔與化學(xué)療法聯(lián)合使用，治療后未在免疫表型、骨髓穿刺或活組織檢查中發(fā)現(xiàn)微小的殘存病灶，并且CD20+漿細胞消失。這些結(jié)果證明有必要進行大規(guī)模的臨床試驗來確定此策略在治療骨髓瘤中的作用。由于疫苗方法可誘導(dǎo)CTL反應(yīng)，因此預(yù)期可用于補充針對CD20MM干細胞的單克隆抗體治療。
將抗原體內(nèi)靶向至樹突狀細胞及其它抗原呈遞細胞作為用于疫苗接種和打破免疫耐警件的有效策略。作為專門的抗原旱遞細胞，樹突狀細胞(DO在協(xié)調(diào)先天性免疫與適應(yīng)性免疫中起關(guān)鍵作用，并已用于產(chǎn)生有效疫苗(Vulink等，Adv Cancer Res. 2008,99 363-407 ；0' Neill 等，Mol Biotechnol. 2007，36 131-41)。將抗原體內(nèi)靴向至 DC 代表了一種基于DC的疫苗接種的有前途的方法，因為該方法可避免繁雜且昂貴的體外抗原負載和培養(yǎng)，并有利于基于DC的免疫療法的大規(guī)模應(yīng)用(Tacken等，Nat Rev Immunol. 2007, 7 790-80 。更顯著地，體內(nèi)DC靶向疫苗接種在誘導(dǎo)抗腫瘤免疫反應(yīng)方面更有效，并且可更有效地控制動物模型中的腫瘤生長(Kretz-Rommel等，J Immunother 2007,30 :715-726) 除 DC 外，B 細胞為能夠激發(fā) Thl/Th2 細胞(Morris 等，J Immunol. 1994，152 :3777-3785 ； Constant, J Immunol. 1999，162 :5695-5703)和通過交叉呈遞激活 CD8 T 細胞(Heit 等，JImmunol. 2004,172 :1501-1507 ；Yan 等，Int Immunol. 2005,17 :869-773)的另一種類型的有效抗原呈遞細胞。據(jù)最近報道，將抗原體內(nèi)靶向至B細胞打破MUCl的免疫耐受性(Ding 等，Blood 2008，112 :2817-25)。
CD74作為用于靶向疫苗接種的潛在警體。一㈣在DC上表汰的警體已用作體內(nèi)抗原靶向的靶標，這些受體如甘露糖受體(He等，J. Immunol 2007,178,6259-6267 ； Ramakrishna 等，J. Immunol. 2004，172,2845-2852)、CD205 (Bonifaz 等，J Exp Med. 2004， 199 :815-24)、DC-SIGN(Tacken 等，Blood 2005，106 1278-85)和 LOXl (Deineste 等， Immunity 2002，17，353-362)等。CD74 是對正確折疊 MHC II 和將MHC II-CD74 復(fù)合體靶向至核內(nèi)體所必需的II型整合膜蛋白(Stein等，Clin Cancer Res. 2007，13 :5556s_5563s ； Matza等，Trends Immunol. 2003,24(5) :264-8)。CD74表達不限于DC，而是可見于幾乎所有的抗原呈遞細胞(Freudenthal 等，Proc Natl Acad Sci USA. 1990,87 :7698-702 ；Clark 等，J Immunol. 1992,148(11) :3327-35)。CD74在APC中的廣泛表達與在骨髓DC中的單一表達相比可具有一些優(yōu)點，因為已報道將抗原靶向至其它APC (如B細胞)會打破免疫耐受性(Ding等，Blood 2008，112 :2817-25)，且靶向至類漿細胞DC會將抗原交叉呈遞至原態(tài) CD8 T細胞。更重要的是，CD74也在濾泡DC中表達(Clark等，J Immunol. 1992，148 (11) 3327-3 ，這些濾泡DC是對將抗原呈遞至B細胞至關(guān)重要的DC亞群(Tew等，Immunol Rev. 1997，156 :39-52)。這種表達型使⑶74成為用于體內(nèi)靶向疫苗接種的極佳候選物。
人化抗CD74單克隆抗體hLLl作為具有對接和鎖定技術(shù)平臺的新型靶向工具。下文更詳細討論的DNL技術(shù)提供將幾乎任何選定的效應(yīng)子部分連接到共價或非共價復(fù)合體當中的方法(Goldenberg 等，J Nucl Med. 2008，49 158-63 ;Rossi 等，Proc Natl Acad Sci USA. 2006,103(18) :6841-6)。DNL方法已產(chǎn)生了若干含與癌胚抗原(CEA)反應(yīng)的Fab片段的三價雙特異性結(jié)合蛋白，并且已通過預(yù)靶向策略成功地用于改善癌成像和放射免疫性治療(Goldenberg 等，J Nucl Med. 2008，49 :158-63)。
hLLl 為針對人 CD74 的人化單克隆抗體(Leung 等，Mol Immunol. 1995，32 1416-1427 ；Losman 等，Cancer 1997,80 :2660-2666 ；Stein 等，Blood 2004,104 3705-11)。此MAb在通過第二抗體交聯(lián)時表現(xiàn)出針對B細胞惡性腫瘤的細胞毒性。裸hLLl 還能控制匪小鼠模型中的腫瘤生長。然而，我們近來的數(shù)據(jù)表明，在存在或不存在交聯(lián)作用時，hLLl都沒有針對人單核細胞源性DC的細胞毒性。但我們的初步數(shù)據(jù)顯示，hLLl能有效地結(jié)合血液DC和B細胞的不同亞群。其還可適度地誘導(dǎo)DC成熟并朝Thl效應(yīng)子細胞極化原態(tài)T細胞分化，這表明其具有一些輔助活性，可以用作靶向工具的良好候選物。這使得通過DNL攜帶的hLLl抗體來構(gòu)建靶向APC的基于DNL的腫瘤疫苗成為可能且可行。
用于選擇性消除癌干細胞的免疫療法。癌干細胞能自我更新，具有不受限制的增殖能力，并且對多種治療方法具有抗性。一個緊迫且值得關(guān)注的問題是，癌干細胞是否對免疫療法敏感。就白血病而言，據(jù)報道CD8(+)次要組織相容性抗原特異性細胞毒性T淋巴細胞克隆可消除人急性骨髓性白血病干細胞(Bonnet等，Proc Natl Acad Sci U.S.A. 1999， 96:8639-8644)。最近，Rosinski 等(Blood 2008, 111 :4817-26)報道 DDX36 編碼的 H-Y 表位通過白血病干細胞表達，并且可通過DDX36特異性CTL識別，這可防止在N0D/SCID小鼠中植入人急性白血病(Rosinski等，Blood 2008，111 :4817-26)。另一份報道指出，通過mHA 特異性CTL克隆的離體預(yù)培養(yǎng)完全抑制mHA骨髓性白血病干細胞在N0D/SCID y cnu11小鼠中的植入(Kawase等，Blood 2007,110 :1055-63)。這些結(jié)果突出了免疫療法可以成為選擇性消除癌干細胞(包括MM干細胞)的潛在有效方法的前景，該方法應(yīng)可實現(xiàn)對這種惡性腫瘤的長期控制或甚至治愈這種惡性腫瘤。
對接和鎖定(DNL)方法 DNL方法利用發(fā)生在cAMP依賴性蛋白激酶(PKA)的調(diào)節(jié)(R)亞單元與A激酶錨定蛋白(AKAP)的錨定域(AD)之間的特異性蛋白質(zhì)/蛋白質(zhì)相互作用(Baillie等，F(xiàn)EBS Letters. 2005 ；579 :3264 ；Wong 和 Scott,Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2004 ；5 :959)。1968 年首次從兔骨骼肌中分離出PKA，其在由第二信使cAMP與R亞單元的結(jié)合所引導(dǎo)的研究最充分的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑之一中起核心作用(Walsh等，J. Biol. Chem. 1968 ；243 :3763)。全酶結(jié)構(gòu)由被R亞單元保持于非活性形式的兩個催化亞單元組成(Taylor，J. Biol. Chem. 1989 ；264 8443)。發(fā)現(xiàn)PKA的同工酶具有兩種類型的R亞單元(RI和RII)，每種類型均具有α和β 異形體(Scott, Pharmacol. Ther. 1991 ；50 :123)。R亞單元僅被分離為穩(wěn)定的二聚體，并且已證實二聚域由前44個氨基末端殘基組成(Newlon等，Nat. Struct. Biol. 1999 ；6 :222)。 cAMP與R亞單元的結(jié)合導(dǎo)致活性催化亞單元的釋放，從而得到廣譜的絲氨酸/蘇氨酸激酶活性，這些活性催化亞單元通過PKA經(jīng)由其與AKAP的對接實現(xiàn)的區(qū)室化朝選定的底物定位 (Scott 等，J. Biol. Chem. 1990 ；265 ；21561)。
自從1984年表征首個AKAP，即微管相關(guān)蛋白_2以來(Lohmann等，Proc. Natl. Acad. Sci USA. 1984 ；81 :6723)，已經(jīng)在從酵母到人類的多個物種中鑒別出具有不同樣結(jié)構(gòu)的50多種AKAP，它們定位于各種亞細胞位點，包括質(zhì)膜、肌動蛋自細胞骨架、細胞核、線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(Wong 和 kott，Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2004 ；5 :959)。AKAP 對 PKA 的 AD 為 14-18個殘基的兩親性螺旋(Carr等，J. Biol. Chem. 1991 ；266 :14188)。AD的氨基酸序列在各AKAP之間差別很大，據(jù)報道對RII 二聚體的結(jié)合親和力為2至90nM(Alto等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003 ； 100 :4445)。有意思的是，AKAP只與二聚R亞單元結(jié)合。對于人 RII α，AD與由23個氨基末端殘基形成的疏水表面結(jié)合(Colledge和kott，Trends Cell Biol. 1999 ；6 216)。因此，人RIIa的二聚域和AKAP結(jié)合域均位于在本文中稱為DDD的相同的 N-末端 44 氨基酸序列內(nèi)(Newlon 等，Nat. Mruct. Biol. 1999 ；6 :222 ；Newlon 等，EMBO J. 2001 ；20 1651)。
作為連接體模塊的人RII α的DDD和AKAP的AD 我們已經(jīng)開發(fā)出利用人RII α的DDD和AKAP的AD作為極佳的連接體模塊對用于將任何兩個實體(在下文中稱為A和B)對接成非共價復(fù)合體的平臺技術(shù)，可通過將半胱氨酸殘基引入DDD和AD的重要位置以促進二硫鍵的形成而將該非共價復(fù)合體進一步鎖定成穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)(stably tethered structure) 0 “對接和鎖定”技術(shù)的一般方法如下。通過使DDD序列與A的前體連接來構(gòu)建實體A，得到以下稱為a的第一組分。由于DDD序列會影響二聚體的自發(fā)形成，因此A將由 組成。通過使AD序列與B的前體連接來構(gòu)建實體B， 得到以下稱為b的第二組分。包含在％中的DDD的二聚模體將產(chǎn)生用于與包含在b中的 AD序列結(jié)合的對接位點，從而促進 與b迅速締合以形成由a2b構(gòu)成的二元三聚復(fù)合體。 通過隨后經(jīng)由二硫橋共價固定兩個實體的反應(yīng)使這一結(jié)合事件不可逆，該反應(yīng)基于有效的局部濃度原理而非常有效地發(fā)生，因為初始的結(jié)合相互作用會使置于DDD和AD 二者上的活性硫醇基靠近(Chmura等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001 ；98 :8480)，從而進行位點特異性連接。
在優(yōu)選的實施例中，抗癌疫苗DNL構(gòu)建體基于ii2b結(jié)構(gòu)的變化，其中抗CD74抗體或F (ab ‘ ) 2或F (ab) 2抗體片段(如hLLl抗體或片段)的每個重鏈在其C-末端連接于AD 部分的一個拷貝。由于每個抗體或片段具有兩個重鏈，因此每個抗體或片段具有兩個AD部分。⑶20異種抗原連接于互補的DDD部分。DDD部分二聚化后，每個DOD 二聚體與連接于 IgG抗體的AD部分或連接于F(ab' )2或？(ab) 2片段的AD部分之一結(jié)合，從而得到每個IgG 或F(ab' )2或？(油)2單元中有四個CD20異種抗原的化學(xué)計量。然而，技術(shù)人員會意識到可使用替換的復(fù)合體，如將⑶20連接于AD序列，并將抗⑶74MAb或片段連接于DDD部分， 從而得到不同化學(xué)計量的效應(yīng)子部分。例如，通過將DDD序列連接于IgG抗體或F(ab' )2 片段的每個重鏈的C-末端，并將AD序列連接于⑶20異種抗原，可構(gòu)建包含一個⑶20分子和一個抗⑶74抗體或片段的DNL復(fù)合體。
通過在遠離兩個前體的官能團處連接DDD和AD，可預(yù)期這種位點特異性連接可保持兩個前體的原始活性。此方法具有模塊化的性質(zhì)，并能潛在地用于位點特異性地和共價地連接多種物質(zhì)。
如下文實例所示，在優(yōu)選的實施例中，效應(yīng)部分為蛋白質(zhì)或肽，該效應(yīng)部分可連接于DDD或AD單元以形成融合蛋白或肽。已知有多種方法可形成融合蛋白，包括核酸合成、 雜交和/或擴增，以產(chǎn)生編碼目標融合蛋白的合成雙鏈核酸?？蓪⑦@種雙鏈核酸插入表達載體中，用于通過標準的分子生物學(xué)技術(shù)產(chǎn)生融合蛋白(見例如Sambrook等，Molecular CloninR, A laboratory manual 第二版，Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989)。在這種優(yōu)選的實施例中，AD和/或DDD部分可連接于效應(yīng)蛋白或肽的N-末端或 C-末端。然而，技術(shù)人員會意識到，AD或DDD部分與效應(yīng)部分的連接位點可根據(jù)效應(yīng)部分的化學(xué)性質(zhì)和效應(yīng)部分涉及其生理活性的部分而變化。例如，盡管AD或DDD部分可在保持抗原結(jié)合活性的同時連接于抗體或抗體片段的N-末端或C-末端，但與C-末端的連接使AD 或DDD部分的位置遠離抗原結(jié)合位點，且似乎可能導(dǎo)致較強的結(jié)合相互作用(例如Chang 等，Clin Cancer Res 2007，13 :5586s_91s)。也可采用本領(lǐng)中已知的技術(shù)進行多種效應(yīng)部分的位點特異性連接，例如采用二價交聯(lián)試劑和/或其它化學(xué)綴合技術(shù)。
抗體和抗體片段 在各實施例中，抗體或抗體的抗原結(jié)合片段可結(jié)合到抗癌疫苗DNL復(fù)合體當中。 抗原結(jié)合抗體片段是本領(lǐng)域中已知的，如F(ab' )2、F(ab)2、Fab'、Fab、Fv、scFv等，并且任何這種已知的片段均可使用。如本文所用，抗原結(jié)合抗體片段是指與由完整抗體或親本抗體識別的相同抗原結(jié)合的抗體的任何片段。用于制備幾乎任何的目標抗體或片段的AD 和/或DDD綴合物的技術(shù)是已知的(例如美國專利No. 7，527，787)。
可使用未與治療劑綴合的抗體或其片段，其被稱為“裸”抗體或其片段。在可供選擇的實施例中，抗體或片段可與一種或多種治療劑和/或診斷劑綴合。許多這種治療劑和診斷劑是本領(lǐng)中已知的(如下文更為詳細地討論)，并且任何這種已知的治療劑或診斷劑均可使用。
用于制備針對幾乎任何靶抗原的單克隆抗體(例如CD74)的技術(shù)是本領(lǐng)域中已知的。見例如 Kohler 和 Milstein，Nature 256 :495(1975)；和 Coligan 等(編輯)CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY 第 1 卷第 2. 5. 1 至 2. 6. 7 頁(John ffiley&Sons 1991)。簡單而言，單克隆抗體可以通過下列步驟來獲得向小鼠注射含有抗原的組合物，摘除脾臟以獲得 B-淋巴細胞，將B-淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合以產(chǎn)生雜交瘤，克隆雜交瘤，選出對抗原產(chǎn)生抗體的陽性克隆，培養(yǎng)對抗原產(chǎn)生抗體的克隆，以及從雜交瘤培養(yǎng)物中分離抗體。
可以用多種完善的技術(shù)從雜交瘤培養(yǎng)物中分離和純化出MAb。這種分離技術(shù)包括使用蛋白A瓊脂糖凝膠的親和色譜、尺寸排阻色譜和離子交換色譜。見例如，Coligan 在 2. 7. 1-2. 7. 12 頁和 2. 9. 1-2. 9. 3 頁所述。也可見 Baines 等，“Purification of Immunoglobulin G(IgG) “，METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY 第 10 卷第 79 至 104 頁(The Humana Press,Inc.1992)。
在起始形成免疫原的抗體之后，抗體可以進行測序并隨后用重組技術(shù)來制備。鼠抗體和抗體片段的人化和嵌合是本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的。使用源自人化、嵌合或人抗體的抗體組分避免了與鼠恒定區(qū)的免疫原性相關(guān)的潛在問題。
嵌合抗體 嵌合抗體是重組蛋白質(zhì)，其中人抗體的可變區(qū)被例如包括小鼠抗體的互補決定區(qū) (CDR)在內(nèi)的小鼠抗體的可變區(qū)所取代。當施用給受試者時，嵌合抗體表現(xiàn)出免疫原性降低而穩(wěn)定性增加?？寺∈竺庖咔虻鞍卓勺儏^(qū)的一般技術(shù)公開于例如Orlandi等的Proc. Nat' 1 Acad. Sci. USA 86 :3833(1989)中。構(gòu)建嵌合抗體的技術(shù)是本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的。舉例而言，Leung等，Hybridoma 13 :469(1994)描述了通過將編碼鼠LL2 (抗CD22單克隆抗體)的Vk和Vh域的DNA序列與相應(yīng)的人κ和IgGJi定區(qū)域結(jié)合來產(chǎn)生LL2嵌合體。
人化抗體 產(chǎn)生人化MAb的技術(shù)是本領(lǐng)域中所熟知的(見例如Jones等，Nature 321 522 (1986) ；Riechmann 等，Nature 332 323 (1988) ；Verhoeyen 等，Science 239 1534(1988) ；Carter 等，Proc. Nat ‘ 1 Acad. Sci. USA89 :4285(1992) ；Sandhu, Crit. Rev. Biotech. 12 :437(1992)以及 Singer 等，J. Immun. 150 :2844 (1993)) 可通過將小鼠 CDR 從重可變鏈和輕可變鏈轉(zhuǎn)移到人抗體的相應(yīng)可變域來人化嵌合或鼠單克隆抗體。嵌合單克隆抗體中的小鼠框架區(qū)(FR)也用人FR序列取代。因為簡單地將小鼠⑶R轉(zhuǎn)移至人FR中常常導(dǎo)致抗體親和性的降低或者甚至是喪失，所以可能需要附加的修飾以恢復(fù)鼠抗體的原始親和性。這可通過將FR區(qū)中的一個或多個人殘基用其鼠對應(yīng)物取代來完成，從而獲得對其表位具有良好結(jié)合親和性的抗體。見例如Tempest等，Biotechnology 9:266(1991)；和 Verhoeyen等，Science 239:1534(1988)。一般來講，不同于其鼠對應(yīng)物且位置接近一個或多個CDR氨基酸殘基或與其接觸的人FR氨基酸殘基為取代的候選物。
人化LLl (hLLl)抗⑶74抗體公開于美國專利No. 7，312，318中，該專利的第35欄第1行至第42第27行以及圖1至圖4以引用的方式并入本文。
人抗體 采用組合方法或用人免疫球蛋白基因座轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因動物來產(chǎn)生全人抗體的方法是本領(lǐng)域中已知的(例如 Mancini 等，2004，NewMicrobiol. 27 :315-28 ；Conrad 和 Scheller,2005, Comb. Chem. High Throughput Screen. 8 :117-26 ；Brekke 禾口 Loset,2003, Curr. Opin. Phamaco 1. 3 :544-50)。全人抗體也可以通過基因或染色體轉(zhuǎn)染方法以及噬菌體展示技術(shù)來構(gòu)建，所有這些技術(shù)在本領(lǐng)域中是已知的。見例如McCafferty等，Nature 348 552-553(1990)。預(yù)期這種全人抗體表現(xiàn)出比嵌合或人化抗體更少的副作用，并且在體內(nèi)基本上起到內(nèi)源性人抗體的作用。在某些實施例中，請求保護的方法和程序可利用通過這種技術(shù)產(chǎn)生的人抗體。
在一個可供選擇的方案中，噬菌體展示技術(shù)可用于產(chǎn)生人抗體(例如， Dantas-Barbosa等，2005, Genet. Mol. Res. 4 :126-40)。人抗體可產(chǎn)生自正常人或產(chǎn)生自顯示特定疾病狀態(tài)(例如癌)的人(Dantas-Barbosa等，200幻。由患病個體構(gòu)建人抗體的優(yōu)勢在于，循環(huán)抗體譜可偏向(biased towards)針對疾病相關(guān)抗原的抗體。
在此方法論的一個非限制性實例中，Dantas-Barbosa等^00 構(gòu)建了來自骨肉瘤患者的人Fab抗體片段的噬菌體展示庫。通常，總RNA得自循環(huán)血淋巴細胞(Id.)。重組Fab克隆自μ、γ和κ鏈抗體譜并插入噬菌體展示庫(Id.)。使用針對重鏈和輕鏈免疫球蛋白序列的特異性引物將RNA轉(zhuǎn)化為cDNA，并用于制造Fab cDNA庫(Marks等，1991，J Mol. Biol. 222 :581-97)。按照 Andris-Widhopf 等(2000，In =Phage Display Laboratory Manual,Barbas ^ ()第 1 IK,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor，NY第9. 1至9. 22頁)進行庫構(gòu)建。最終的Fab片段用限制性內(nèi)切酶消化并插入到噬菌體基因組以制造噬菌體展示庫?？赏ㄟ^本領(lǐng)域中已知的標準噬菌體展示方法篩選這種庫(見例如 Pasqualini 禾口 Ruoslahti，1996，Nature 380 :364-366 ；Pasqualini, 1999，The Quart. J. Nuc 1. Med. 43 :159162)。
可以多種形式進行噬菌體展示，其綜述見例如，Johnson和Chiswell，Current Opinion in Structural Biology 3 :5564-571 (1993)。人抗體也可由離體活化的 B 細胞來產(chǎn)生。見美國專利No. 5，567，610和No. 5，229，275，其全文以引用的方式并入本文。技術(shù)人員會意識到，這些技術(shù)僅為示例性的，可以利用制造與篩選人抗體或抗體片段的任何已知方法。
在另一個可供選擇的方案中，采用標準的免疫方案，可以使用經(jīng)基因工程改造產(chǎn)生人抗體的轉(zhuǎn)基因動物來產(chǎn)生針對基本上任何免疫原性靶標的抗體。用于從轉(zhuǎn)基因小鼠中獲得人抗體的方法由下列學(xué)者進行了描述=Green等，Nature Genet. 7 :13(1994)，Lonberg 等，Nature368 :856(1994)；和 Taylor 等，Int. Immun. 6 :579 (1994)。這種系統(tǒng)的非限制性例子有得自 Abgenix (Fremont, CA)的 XenoMouse (例如 Green 等，1999, J. Immunol. Methods 231 :11-23)。在XenoMouse 和類似動物中，小鼠抗體基因已經(jīng)被滅活并被功能性人抗體基因取代，而小鼠免疫系統(tǒng)的其余部分保持不變。
用種系配置的(germline-configured)YAC(酵母人工染色體)轉(zhuǎn)化XenoMouse , 所述YAC含有人IgH和Igkappa基因座的若干部分，包括大多數(shù)可變區(qū)序列，以及附加基因和調(diào)節(jié)序列。人可變區(qū)庫可用來生成產(chǎn)生抗體的B細胞，其可以通過已知的技術(shù)被處理成雜交瘤。用靶抗原免疫的XenoMouse 通過正常的免疫反應(yīng)產(chǎn)生人抗體，可以通過上面討論的標準技術(shù)進行收獲和/或生產(chǎn)?？傻玫蕉喾N品系的XenoMouse ,每種品系均能產(chǎn)生不同類的抗體。轉(zhuǎn)基因方法產(chǎn)生的人抗體經(jīng)證明具有治療潛力，同時保留正常人抗體的藥代動力學(xué)性質(zhì)(Green等，1999)。技術(shù)人員會意識到請求保護的組合物和方法不限于使用 XenoMouse⑩系統(tǒng)，而是可以利用已通過基因改造產(chǎn)生人抗體的任何轉(zhuǎn)基因動物。
抗體片段 可以通過已知的技術(shù)來產(chǎn)生識別特異表位的抗體片段?？贵w片段為抗體的抗原結(jié)合部分，如F(ab' )2、Fab'、F(ab)2、Fab、Fv、sFv等。F(ab' )2片段可通過胃蛋白酶消化抗體分子產(chǎn)生，而Fab'片段可通過還原F(ab' )2片段的二硫橋產(chǎn)生。作為另外的選擇， 可構(gòu)建Fab'表達庫(Huse等，1989，Science, 246 :1274-1281)，以使得能快速和容易地鑒定具有所需特異性的單克隆Fab'片段。F(ab)2片段可通過木瓜蛋白酶消化由二硫還原得到的抗體和Fab片段來產(chǎn)生。
單鏈Fv分子(scFv)包含VL域和VH域。VL域和VH域聯(lián)合形成靶結(jié)合位點。 這兩個域進一步通過肽連接體(L)共價連接。用于制造scFv分子和設(shè)計合適的肽連接體的方法在下列文獻中進行了描述美國專利No. 4，704，692 ；美國專利No. 4，946，778 ； R. Raag 和 M. Whitlow，〃 Single Chain Fvs. “ FASEB Vol 9:73-80(1995)；以及 R. Ε. Bird 和 B. W. Walker, “ Single Chain Antibody Variable Regions “，TIBTECH, Vol9 132-137(1991)。
用于產(chǎn)生單域抗體的技術(shù)是本領(lǐng)中已知的，例如由Cossins等Q006， Express Purif 51 :253-259)所公開。單域抗體(VHH)可通過標準免疫技術(shù)從駱駝、羊馬它或大羊輪中獲得(見例如 Muyldermans 等，TIBS 26 :230-235,2001 ；Yau 等，J Immunol Methods 281 161-75，2003 ；Maass 等，J Immunol Methods 324 13-25，2007)。VHH 可具有有效的抗原結(jié)合能力并可與常規(guī)VH-VL對接觸不到的新表位相互作用(Muyldermans等， 2001)。羊駝血清IgG含約50%的只有駱駝科重鏈的IgG抗體(HCAb) (Maass等，2007)。羊駝可用已知的抗原免疫(如TNF- α )，并且可將結(jié)合并中和靶抗原的VHH分離(Maass等， 2007)。已鑒定出擴增幾乎所有羊駝VHH編碼序列的PCR引物，并且這些引物可用于構(gòu)建羊駝VHH噬菌體展示庫，其可用于通過本領(lǐng)域中熟知的標準生物淘選技術(shù)來進行抗體片段分離(Maass 等，2007)。
可通過全長抗體的蛋白水解或通過在大腸桿菌(E. coli)或其它宿主中表達編碼該片段的DNA來制備抗體片段?？梢园闯Ｒ?guī)方法通過全長抗體的胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化來獲得抗體片段。這些方法由例如Goldenberg，美國專利No. 4，036, 945和No. 4，331，647 以及其中所包含的文獻所描述。此外，見Nisonoff等，Arch Biochem. Biophys. 89 230(1960) ；Porter, Biochem. J. 73 :119(1959) ；EdeIman 等，METHODS IN ENZYM0L0GY 第 1 卷第 422 頁(Academic Pressl967)；和 Coligan, 2. 8. 1-2. 8. 10 頁和 2. 10. -2. 10. 4 頁。
已知的抗體 在某些實施例中，除CD74外，可以把針對其它抗原靶標的抗體結(jié)合到抗癌疫苗 DNL復(fù)合體當中。針對腫瘤相關(guān)抗原的多種抗體是已知的，并且可通過商業(yè)渠道獲得。例如，許多分泌抗體的雜交瘤細胞系得自美國模式培養(yǎng)物保藏所(ATCC，Manassas, VA)。見例如美國專利號7‘，312，318 ；7，282，567 ；7，151，164；7，074，403 ；:7，060，802 ；1‘’ 056，5097;,049,,060 -J,,,045,,132 ；7,,041;,803 ；7,,041，802 ；7，041,,293 ；7,,038，018 ；7，037，4987,,012，133 ；7,,001，598 ；6，998，468 ；6，994，976 ；6，994，852 ；6，989，241 ；6，974，8636，965，018 ；6，964，854 ；6，962，981 ；6，962:,813 ；6，956，107 ；6，951，924 ；6，949，2446，946，129 ；6，943，020 ；6，939，547 ；6，921;,645 ；6，921，645 ；6，921，533 ；6，919，4336，919，078 ；6，916，475 ；6，905，681 ；6，899;,879 ；6，893，625 ；6，887，468 ；6，887，4666，884，594 ；6，881，405 ；6，878，812 ；6，875，580 ；6，872，568 ；6，867，006 ；6，864，0626，861，511 ；6，861，227 ；6，861，226 ；6，838，282 ；6，835，549 ；6，835，370 ；6，824，7806824778；6812，206 ；6793924 ；6，783，758 ；6，770，450 ；6，767，7116，764，6886，764681；6764679 ；6，743，898 ；6，733，981 ；6，730，307 ；6，720，156，716，9666，709653；6,693，176 ；6，692，908 ；6，689，607 ；6，689，362 ；6，689，3556，682，7376，682，736；6,682，734 ；6，673，344 ；6，653，104 ；6，652，852 ；6，635，4826，630，1446，610，833；6,610，294 ；6，605，441 ；6，605，279 ；6，596，852 ；6，605，2796，596，8526，592，868；6,576，745 ；6，572，856 ；6，566，076 ；6，562，618 ；6，545，1306，544，7496，534058；6528，625 ；6，528269 ；6，521，227 ；6，518，404 ；6，511，6656，491，9156，488，930；6,482，598 ；6，482，408 ；6，479，247 ；6，468，531 ；6，468，529 ；6465，1736，461823；6,458，356 ；6，455，044 ；6，455，040 ；6，451，310 ；6，444，2066，441，1436，432，404；6,432，402 ；6，419，928 ；6，413，726 ；6，406，694 ；6，403，7706，403，0916，395，276；6,395，274 ；6，387，350 ；6，383，759 ；6，383，484 ；6，376，6546，372，2156，359，126；6355，481 ；6355444 ；6,355，245 ；6，355，244 ；6，346，2466，344，1986，340571；6340，459 ；6，331175 ；6,306，393 ；6，254，868 ；6，187，2876，183，7446，129914；6,120，767 ；6，096，289 ；6，077，499 ；5，922，302 ；5，874，5405，814，4405，798，229；5,789，554 ；5，776，456 ；5，736，119 ；5，716，595 ；5，677，1365，587，4595，443，953 ；5，525, 338。
這些抗體僅為示例性的，許多其它抗體及其雜交賴I是本領(lǐng)域中已知的。技術(shù)人員
會意識到，可通過在ATCC、NCBI和/或USPTO數(shù)據(jù)庫中簡單檢索針對選定的疾病相關(guān)目標靶的抗體來獲得針對幾乎任何腫瘤相關(guān)抗原的抗體序列或分泌抗體的雜交瘤。可采用本領(lǐng)域中熟知的標準技術(shù)，將克隆抗體的抗原結(jié)合域擴增、切下、連接到表達載體、轉(zhuǎn)染到已適應(yīng)的宿主細胞中以及用于蛋白生產(chǎn)。
氨基酸取代 在某些實施例中，本發(fā)明所公開的方法和組合物可涉及生產(chǎn)和使用具有一個或多個取代氨基酸殘基的蛋白質(zhì)或肽。例如，如以下工作實例所討論，可以改變AD和/或DDD 部分的序列以改善DNL復(fù)合體的形成和/或其體內(nèi)穩(wěn)定性。在其它實施例中，可通過取代一個或多個氨基酸殘基來優(yōu)化天然、嵌合、人化或人抗體的結(jié)構(gòu)特性、物理特性和/或治療特性。例如，本領(lǐng)域中熟知的是，可通過用親本鼠抗體的相應(yīng)FR氨基酸取代有限數(shù)目的人框架區(qū)(FR)氨基酸來改善人化抗體的功能特性。當框架區(qū)氨基酸殘基近接CDR殘基時尤其如此。
在其它情況下，可通過有限數(shù)目的氨基酸取代來優(yōu)化抗體的治療特性，如對靶抗原的結(jié)合親和性、抗體從其靶抗原中的解離或脫離的速率或甚至抗體誘導(dǎo)CDC(補體依賴性細胞毒性)或ADCC (抗體依賴性細胞的細胞毒性)的有效性。
技術(shù)人員會意識到，一般而言，氨基酸取代通常涉及將氨基酸用另一種具有相對類似性質(zhì)的氨基酸取代(保守氨基酸取代)。各種氨基酸的特性和氨基酸取代對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的影響已成為本領(lǐng)域中廣泛研究和已知的課題。
例如，可考慮氨基酸的疏水性指數(shù)(hydropathicindex) (Kyte&Doolittle，1982， J. Mol. Biol. ,157 :105-132)。氨基酸的相對疏水特性有助于所得蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)，后者又限定蛋白質(zhì)與其它分子的相互作用。對每種氨基酸根據(jù)其疏水性和電荷性質(zhì)指定了一個疏水性指數(shù)(Kyte&D00little，1982)，即異亮氨酸(+4.5)；纈氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3. 8)；苯丙氨酸(+2. 8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2. 5)；蛋氨酸(+1. 9)；丙氨酸(+1. 8)；甘氨酸("0. 4)；蘇氨酸(0. 7)；絲氨酸(-0. 8)；色氨酸(-0. 9)；酪氨酸(-1. 3)；脯氨酸(-1. 6)； 組氨酸("3. 2)；谷氨酸鹽(-3. 5)；谷氨酰胺(-3. 5)；天冬氨酸鹽(-3. 5)；天冬酰胺(-3. 5)； 賴氨酸(-3.9)；和精氨酸(_4.幻。在進行保守取代時，優(yōu)選使用疏水性指數(shù)在士2范圍內(nèi)的氨基酸，更優(yōu)選使用疏水性指數(shù)在士 1范圍內(nèi)的氨基酸，甚至更優(yōu)選疏水性指數(shù)在士 0. 5 范圍內(nèi)的氨基酸。
氨基酸取代還要考慮氨基酸殘基的親水性(例如U. S. Pat. No. 4，554，101)。已對氨基酸殘基指定了親水性值精氨酸(+3.0)；賴氨酸(+3.0)；天冬氨酸鹽(+3.0)；谷氨酸鹽(+3.0)；絲氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；蘇氨酸("0. 4)；脯氨酸(-0. 5. +-· 1)；丙氨酸(-0. 5)；組氨酸(-0. 5)；半胱氨酸(-1. 0)；蛋氨酸(-1.3)；纈氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；異亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸 (-2. 5)；色氨酸(-3.4)。用其它具有類似親水性的物質(zhì)進行氨基酸的取代是優(yōu)選的。
其它考慮因素包括氨基酸側(cè)鏈的大小。例如，用具有較大側(cè)鏈的氨基酸(如色氨酸或酪氨酸)取代具有緊湊側(cè)鏈的氨基酸(如甘氨酸或絲氨酸)通常不是優(yōu)選的。還考慮各種氨基酸殘基對蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的影響。通過實證研究，不同氨基酸殘基對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域采取α -螺旋、β -折疊或翻轉(zhuǎn)二級結(jié)構(gòu)的傾向性的影響已經(jīng)確定，并且是本領(lǐng)域中已知的(見例如 Chou&Fasman，1974，Biochemistry, 13 :222-245 ； 1978，Ann. Rev. Biochem. ,47 251-276 ； 1979，Biophys. J. ,26 :367-384)。
基于這種考慮因素和大量的實證研究已建立了保守氨基酸取代表，這些表在本領(lǐng)域中是已知的。例如，精氨酸和賴氨酸；谷氨酸鹽和天冬氨酸鹽；絲氨酸和蘇氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸。作為另外的選擇，可為Ala(A)Ieu, ile, val ；Arg(R) gin，asn，Iys ；Asn(N) his, asp，lys，arg，gin ；Asp (D)asn, glu ；Cys(C)ala, ser ；GIn (Q)glu, asn ；GIu(E) gin，asp ；GIy(G)ala ；His(H)asn, gin，lys, arg ；He (I)val, met，ala, phe，leu ；Leu (L) val, met，ala, phe，ile ；Lys (K) gin，asn, arg ；Met (M)phe，ile, leu ；Phe (F) leu, val, ile, ala, tyr ；Pro (P) ala ；Ser (S)，thr ；Thr (T) ser ；Trp (W)phe, tyr ； Tyr (Y) top，phe, thr, ser ；Val (V) ile, leu, met，phe, ala。
氨基酸取代的其它考慮因素包括殘基是否位于蛋白內(nèi)部或暴露在溶劑中。就內(nèi)部殘基而言，保守取代包括Asp和Asn ；Ser和Thr ；Ser和Ala ；Thr和Ala ；Ala和GIy ；He 禾口 Val ；Val 禾口 Leu ；Leu 禾口 Ile ；Leu 禾口 Met ；Phe 禾口 Tyr ；Tyr 禾口 Trp (見例如，PROWL 網(wǎng)立占 rockefeller, edu)。就溶劑暴露的殘基而言，保守取代包括Asp和Asn ；Asp和Glu ；Glu和 GIn ；Glu 禾口 Ala ；GIy 禾口 Asn ；Ala 禾口 Pro ；Ala 禾口 GIy ；Ala 禾口 Ser ；Ala 禾口 Lys ；Ser 禾口 Thr ；Lys 和 Arg ；Val 和 Leu ；Leu 和 Ile ；Ile 和 Val ；Phe 和 Tyr (見例如 PROffL 網(wǎng)站:rockefeller. edu)。已構(gòu)建各種矩陣來輔助氨基酸取代的選擇，如PAM250計分矩陣、Dayhoff矩陣、 Grantham 矩陣、McLachlan 矩陣、Doolittle 矩陣、Henikoff 矩陣、Miyata 矩陣、Fitch 矩陣、 Jones 矩陣、Rao 矩陣、Levin 矩陣和 Risler 矩陣(見例如 PROWL 網(wǎng)站rockefeller. edu)。
在確定氨基酸取代時，還要考慮分子間鍵或分子內(nèi)鍵的存在，例如帶正電的殘基 (例如HiS、Arg、LyS)與帶負電的殘基(例如Asp、Glu)之間形成的離子鍵(鹽橋)或附近的半胱氨酸殘基之間形成的二硫鍵。
對技術(shù)人員而言，在編碼的蛋白質(zhì)序列中將氨基酸取代為任何其它氨基酸的方法是熟知的，僅需要進行常規(guī)的實驗，例如通過定點誘變技術(shù)或通過合成和組裝編碼氨基酸取代物的寡核苷酸并將其拼接到表達載體構(gòu)建體當中(例如Sambrook等，Molecular CloninR, A laboratory manual 第二版，Cold Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989)。
治療劑 在某些實施例中，治療劑(如細胞毒素劑、抗血管生成劑、促凋亡劑、抗生素、激素、激素拮抗劑、趨化因子、藥物、前體藥物、毒素、酶或其它試劑)可以用作本文所述抗癌疫苗DNL復(fù)合體的輔助治療。有用的藥物可以具有選自以下的藥物特性抗有絲分裂、抗激酶、烷基化、抗代謝、抗生、生物堿、抗血管生成、促凋亡劑及其組合。
有用的示例藥物可包括5-氟尿嘧啶、阿普立啶(aplidin)、阿扎立平、阿納托唑、蒽環(huán)霉素、苯達莫司汀、博萊霉素、硼替佐米、苔蘚抑素-1、白消安、刺孢霉素、 喜樹堿、卡鉬、10-羥基喜樹堿、卡莫司汀、西樂葆、瘤可寧、順鉬(CDDP)、Cox-2抑制劑、依立替康(CPT-Il)、SN-38、卡鉬、克拉屈濱、喜樹堿(camptothecans)、環(huán)磷酰胺、阿糖胞苷、氮烯唑胺、多西他奇、更生霉素、柔紅霉素、阿霉素、2-吡咯啉并阿霉素(2-pyrrolinodoxorubicine) (2P-D0X)、氰基嗎啉代阿霉素(cyano-morpholino doxorubicin)、葡糖苷酸阿霉素(doxorubicin glucuronide)、葡糖苷酸表柔比星 (epirubicin glucuronide)、雌氮芥、表葉毒素(印idophyllotoxin)、雌激素受體結(jié)合劑、 依托泊苷(VP16)、葡糖苷酸依托泊苷(etoposide glucuronide)、磷酸依托泊苷(etoposide phosphate)、氟尿苷(FUdR)、3'，5' _0_ 二油酰基-FudR(FUdR-dO)、氟達拉濱、氟他米特、法尼基蛋白轉(zhuǎn)移酶抑制劑、吉西他濱、羥基脲、去甲氧正定霉素、異環(huán)磷酰胺、L-天冬酰胺酶、來那度胺(Ienolidamide)、亞葉酸、環(huán)己亞硝脲、二氯甲基二乙胺、美法侖、巰嘌呤、 6-巰基嘌呤、甲氨蝶呤、米托蒽醌、米拉霉素、絲裂霉素、米托坦、諾維本、亞硝基脲、普卡霉素、丙卡巴胼、紫杉醇、噴司他丁、PSI-341、雷洛昔芬、司莫司汀、鏈佐星、它莫西芬、紫杉酚、 替莫唑胺(temazolomide) (DTIC的含水形式)、反鉬、薩立多胺、硫鳥嘌呤、噻替派、替尼泊苷、托泊替康、尿嘧啶氮芥、長春瑞濱、長春花堿、長春新堿和長春花生物堿。
有用的毒素可以包括篦麻毒素、相思豆毒素、α毒素、皂草素、核糖核酸酶(RNA 酶)如豹蛙酶、DNA酶I、葡萄球菌腸毒素Α、美洲商陸抗病毒蛋白、白樹毒素、白喉毒素、假單胞菌外毒素和假單胞菌內(nèi)毒素。
在某些實施例中，治療劑可以是免疫調(diào)節(jié)劑。免疫調(diào)節(jié)劑是存在時會改變、抑制或刺激身體免疫系統(tǒng)的試劑。有用的免疫調(diào)節(jié)劑可以包括細胞因子、干細胞生長因子、淋巴毒素、成血因子、集落刺激因子(CSF)、干擾素(IFN)、促紅細胞生成素、促血小板生成素及其組合。特別有用的是諸如腫瘤壞死因子(TNF)的淋巴毒素、諸如白介素(IL)的成血因子、 諸如粒細胞集落刺激因子(G-CSF)或粒-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)的集落刺激因子、諸如干擾素-α、干擾素-β或干擾素-Y的干擾素以及諸如稱為“Si因子”的干細胞生長因子。
在各實施例中，治療劑可以包括一種或多種細胞因子，如淋巴因子、單核因子、生長因子和傳統(tǒng)多肽激素。包括在細胞因子中的有生長激素，如人生長激素、N-蛋氨酰人生長激素和牛生長激素；甲狀旁腺激素；甲狀腺素；胰島素；胰島素原；松弛素；松弛素原； 糖蛋白激素，如促卵泡激素(FSH)、促甲狀腺激素(TSH)和黃體化激素(LH)；胎盤生長因子(PlGF)；肝細胞生長因子；前列腺素；成纖維細胞生長因子；催乳素；胎盤泌乳素；OB蛋白；腫瘤壞死因子_α和腫瘤壞死因子；繆勒氏管抑制物質(zhì)；小鼠促性腺激素相關(guān)肽； 抑制素；激活素；血管內(nèi)皮生長因子；整聯(lián)蛋白；促血小板生成素(TPO)；神經(jīng)生長因子， 如NGF-β ；血小板生長因子；轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)，如TGF-α和TGF-β ；胰島素樣生長因子-I和胰島素樣生長因子-II ；促紅細胞生成素(EPO)；骨生成誘導(dǎo)因子；干擾素，如干擾素-α、干擾素-β和干擾素-Y ；集落刺激因子(CSF)，如巨噬細胞-CSF (M-CSF)；白介素 (IL，例如 IL-U IL-I a、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-IU IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-21、IL-25 ；LIF ；kit-配基或 FLT-3 ； 厄洛替尼；血小板反應(yīng)蛋白；內(nèi)皮他丁 ；腫瘤壞死因子(TNFJn TNF-a )和LT。有用的趨化因子可以包括 RANTES、MCAF、MIPl-a、MIPl-β 和 IP-IO0 抗血管生成劑包括厄洛替尼、baculostatin、血管能抑制素、乳腺絲抑蛋白、抗 VEGF抗體、抗PlGF肽和抗體、抗血管生長因子抗體、抗Flk-I抗體、抗Flt-I抗體和肽、抗 Kras抗體、抗cMET抗體、抗MIF(巨噬細胞移動抑制因子)抗體、層粘連蛋白肽、纖連蛋白肽、纖溶酶原激活物抑制劑、組織金屬蛋白酶抑制劑、干擾素、白介素-12、IP-10、Gro-β、 血小板反應(yīng)蛋白、2-甲氧基雌甾二醇、多育曲菌素相關(guān)蛋白、羧胺三唑、CM101、馬馬司他、戊糖多硫酸鹽、血管生成素-2、干擾素-α、除莠霉素A、PNU145156E、16K催乳素片段、利諾胺 (羅喹美克)、薩立多胺、己酮可可堿、染料木黃酮、TNP-470、內(nèi)皮他丁、紫杉醇、accutin、厄洛替尼、西多福韋、長春新堿、博萊霉素、AGM-1470、血小板因子4或米諾環(huán)素會是有用的。
其它有用的治療劑可以包括寡核苷酸，特別是優(yōu)選針對致癌基因和致癌基因產(chǎn)物的反義寡核苷酸，如bcl-2或p53。治療性寡核苷酸的優(yōu)選形式是siRNA。
診斷劑 診斷劑可選自放射性核素、放射造影劑、順磁離子、金屬、熒光標記物、化學(xué)發(fā)光標記物、超聲造影劑和光敏劑。這種診斷劑是公知的，并且可以使用任何這種已知的診斷劑。 診斷劑的非限制性例子可以包括放射性核素，如licIrKmIrKmLiul8Fj2Fh62Ciu64Ciu67Ciu
67n 68n 86v 90w 89v 94mT 94T 99mT 120T 123T 124T 125T 131T 154—158廣 j 32n Il^ 13λτ 15n 186n
Ga> Ga> Y、 Y、 Lx、 1c、 1c、 1c、丄、丄、丄、丄、 丄、 Gd、 P、 C、 N、 0、 Re、
188Re、51Mn、52mMn、55C0、72AS、75Br、76Br、82mRb、83Sr 或其它 Y _、β -或正電子-發(fā)射體。有用的順磁離子可以包括鉻(III)、錳(II)、鐵(III)、鐵(II)、鈷(II)、鎳(II)、銅(II)、釹(III)、 釤(III)、鐿(III)、釓(III)、釩(II)、鋱(III)、鏑(III)、鈥(III)或鉺(III)。金屬造影劑可以包括鑭(III)、金(III)、鉛(II)或鉍(III)。超聲造影劑可以包括脂質(zhì)體，如充氣脂質(zhì)體。不透射線診斷劑可為選自鋇化合物、鎵化合物和鉈化合物的化合物。各種熒光標記物是本領(lǐng)域中已知的，包括但不限于異硫氰酸熒光素、羅丹明、藻紅蛋白、藻藍蛋白、別藻藍蛋白、鄰苯二醛和熒光胺。有用的化學(xué)發(fā)光標記物可以包括魯米諾、異魯米諾、芳族吖啶酯、 咪唑、吖啶鹽或草酸酯。
免疫綴合物 在某些實施例中，抗癌疫苗DNL構(gòu)建體可以與一種或多種治療或診斷劑綴合。治療劑不需要相同，可以是不同的，例如藥物和放射性同位素。例如，131I可結(jié)合到抗體或融合蛋白的酪氨酸當中，而藥物連接于賴氨酸殘基的ε-氨基。治療和診斷劑還可以連接于例如還原的SH基和/或連接于碳水化合物側(cè)鏈。許多用抗體或融合蛋白制造治療或診斷劑的共價或非共價綴合物的方法是本領(lǐng)域中已知的，并且可以利用任何這種已知的方法。
治療或診斷劑可經(jīng)由二硫鍵的形成而連接在還原抗體組分的鉸鏈區(qū)。作為另外的選擇，這種試劑可使用異型雙官能交聯(lián)劑(如N-琥珀?；?-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯 (SPDP))來連接。Yu等，Int. J. Cancer 56:244(1994)。這種綴合的通用技術(shù)是本領(lǐng)域中已知的。例如，參見 Wong，CHEMISTRY OF PROTEIN CONJUGATION AND CROSS-LINKING(CRC Press 1991) ；Upeslacis 等，"Modification of Antibodies by Chemical Methods，，， MONOCLONAL ANTIBODIES PRINCIPLES AND APPLICATIONS, Birch 等(編輯)，187-230 頁 (ffiley-Liss, Inc.1995) ；Price, " Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies, “ MONOCLONAL ANTIBODIES PRODUCTION， ENGINEERING AND CLINICAL APPLICATION, Ritter 等(編輯)，60-84 頁(Cambridge University Press 1995)。作為另外的選擇，治療或診斷劑可以經(jīng)由抗體的Fc區(qū)中的碳水化合物部分綴合。碳水化合物基團可用于增加與硫醇基結(jié)合的相同試劑的負載，或者碳水化合物部分可用于結(jié)合不同的治療或診斷劑。
通過抗體碳水化合物部分將肽與抗體組分綴合的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。例如，參見，Shih 等，Int. J. Cancer 41 :832(1988) ；Shih 等，Int. J. Cancer 46 1101(1990)；和Siih等，美國專利No. 5，057，313，它們?nèi)囊砸玫姆绞讲⑷氡疚?。一般方法涉及使具有氧化的碳水化合物部分的抗體組分與具有至少一個游離胺官能團的載體聚合物反應(yīng)。這一反應(yīng)產(chǎn)生初始的席夫堿(亞胺)鍵，其可以通過還原到仲胺而穩(wěn)定化，從而形成最終綴合物。
如果用作免疫綴合物的抗體組分的抗體是抗體片段，則可以沒有Fc區(qū)。然而，有可能將碳水化合物部分引入到全長抗體或抗體片段的輕鏈可變區(qū)。例如，參見，Leimg等，I Immunol. 154 :5919 (1995) ；Hansen 等，美國專利 No. 5，443，953 (1995) ；Leung 等，美國專利 No. 6，254，868，它們?nèi)囊砸玫姆绞讲⑷氡疚?。改造的碳水化合物部分用于連接治療或診斷劑。
在一些實施例中，可以將螯合劑連接于抗體、抗體片段或融合蛋白，并用于螯合治療或診斷劑(如放射性核素)。示例性螯合劑包括但不限于DTPA (如Mx-DTPA)、D0TA、TETA、 NETA或Ν0ΤΑ。綴合以及使用螯合劑將金屬或其它配體連接于蛋白質(zhì)的方法是本領(lǐng)域中熟知的(參見例如，美國專利申請No. 12/112，觀9，其全文以引用的方式并入本文)。
在某些實施例中，放射性金屬或順磁離子可以通過與具有長尾的試劑反應(yīng)而連接于蛋白質(zhì)或肽，所述的長尾可連接用于結(jié)合離子的諸多螯合基團。這樣的尾可以是聚合物(如聚賴氨酸)、多糖或具有可結(jié)合螯合基團(例如已知可用于此目的的乙二胺四乙酸 (EDTA)、二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、卟啉、聚胺、冠醚、雙縮氨基硫脲、聚肟等)的側(cè)基的其它衍生化或可衍生化的鏈。
螯合物可以直接連接于抗體或肽，例如，如美國專利4，擬4，659中所公開的，其公開內(nèi)容以引用的方式并入本文。特別有用的金屬-螯合物組合包括2-芐基-DTPA及其單甲基和環(huán)己基類似物，其與一般能量范圍在60至4，OOOkeV的診斷同位素(如1251、1311、1231、 124I、62CU、64CU、18F、mIn、67Ga、raGa、99mTCJ4mTc^d15OjeBr) 一起用于放射成像。當與非放射性金屬(如錳、鐵和釓)絡(luò)合時，相同的螯合物可用于MRI。大環(huán)螯合物(如N0TA、D0TA 和TETA)可與多種金屬和射電金屬一起使用，特別是分別與放射性核素鎵、釔和銅一起使用。這種金屬-螯合絡(luò)合物可以通過使環(huán)的大小適應(yīng)于所關(guān)注的金屬而變得非常穩(wěn)定。可用于穩(wěn)定結(jié)合核素(如對于RAIT的223Ra)的其它環(huán)形螯合物(如大環(huán)聚醚)包括在內(nèi)。
最近，已公開了可用于PET掃描技術(shù)的18F標記方法，例如通過使F-18與金屬或其它原子(如鋁)反應(yīng)。18F-Al綴合物可以與直接連接于抗體或用于在預(yù)靶向方法中標記可靶向構(gòu)建體的螯合基團(如D0TA、N0TA或NETA)絡(luò)合。這種F-18標記技術(shù)公開在2008年 4月30日提交的美國專利申請No. 12/112，289中，其全文以引用的方式并入本文。
治療處理的方法 各種實施例涉及治療受試者(如哺乳動物，包括人、馴養(yǎng)動物或?qū)櫸?，如狗和?) 的癌癥(如，多發(fā)性骨髓瘤)的方法。該方法可包括對受試者施用有效量的抗癌疫苗DNL 構(gòu)建體。在優(yōu)選實施例中，抗癌疫苗DNL構(gòu)建體包含抗-CD74抗體或其片段和CD20異種抗原，如在下面實例中進一步的詳述。
可以通過同時或順序地施用有效量的另一種抗體來補充抗癌疫苗DNL構(gòu)建體的施用，所述另一種抗體與靶細胞表面上的另一種抗原結(jié)合或與之反應(yīng)。優(yōu)選的附加 MAb包括至少一種人化、嵌合或人MAb，其選自可與⑶209 (DC-SIGN)、⑶34、⑶74、⑶205、 TLR2 (鐸樣受體 2)、TLR 4、TLR 7、TLR 9、BDCA-2、BDCA-3、BDCA-4 禾口 HLADR 反應(yīng)的 MAb0 各種有用的抗體是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，如上面所討論。例如，參見，(ihetie等，Cancer Res. 48 :2610 (1988) ；Hekman 等，Cancer Immunol. Immunother. 32 :364(1991) ；Longo, Curr. Opin. Oncol. 8 :353 (1996)；美國專利 No. 5，798，554 ；No. 6，187，287 ；No. 6，306，393 ； No. 6，676，924 ；No. 7，109，304 ；No. 7，151，164 ；No. 7，230，084 ；No. 7，230，085 ； No. 7，238，785 ；No. 7，238，786 ；No. 7，282，567 ；No. 7，300，655 ；No. 7，312，318 和美國專利申請公開 No. 20080131363 ；No. 20080089838 ；No. 20070172920 ；No.20060193865 ； No. 20060210475 ；No. 20080138333和20080146784，各引用專利或申請的實例部分以引用的方式并入本文。
在可供選擇的實施例中，針對另一樹突狀細胞抗原的抗體或其片段(如， CD209 (DC-SIGN)、CD34、CD205、TLR 2 (鐸樣受體 2)、TLR 4、TLR 7、TLR 9、BDCA-2、BDCA-3、 BDCA-4或HLA-DR)可替換DNL復(fù)合體中的抗⑶74抗體。這種抗體可得自像美國模式培養(yǎng)物保藏所之類的公共來源或得自商業(yè)抗體供應(yīng)商。例如，針對CD209 (DC-SIGN)、CD34、 BDCA-2、TLR2、TLR 4、TLR 7 禾口 TLR 9 的抗體可以購自 Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz，CA)。針對 CD205 和 BDCA-3 的抗體可以購自 Miltenyi Biotec Inc. (Auburn, CA)?？贵w的眾多其它商業(yè)來源是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。
可以通過同時或順序地施用至少一種治療劑來進一步補充抗癌疫苗DNL構(gòu)建體治療。用于治療多發(fā)性骨髓瘤的治療劑包括地塞米松、薩立多胺/地塞米松、環(huán)磷酰胺、 VAD (長春新堿、阿霉素和地塞米松)、DVd(D0XIL (聚乙二醇化阿霉素)、長春新堿和還原的schedule地塞米松)、BCNU、美法侖、卡莫司汀、硼替佐米(VELCADE )、潑尼松和皮質(zhì)類固醇。單個治療劑可單獨使用，或以本領(lǐng)域中已知的各種組合的方式使用，如CP(環(huán)磷酰胺、潑尼松)、CT(環(huán)磷酰胺、薩立多胺)、VBMCP(長春新堿、BCNU、美法侖、環(huán)磷酰胺、 美法侖)、VMCP (長春新堿、美法侖、環(huán)磷酰胺、潑尼松)、DT-PACE (地塞米松、薩立多胺、順鉬、阿霉素、環(huán)磷酰胺、依托泊苷)、MPT(美法侖、潑尼松、薩立多胺)、CVAD(環(huán)磷酰胺和 VAD)、EDAP(依托泊苷、地塞米松、阿糖胞苷、順鉬)、MTD(美法侖、薩立多胺、地塞米松)、 VT (VELCADE 、薩立多胺)、VDT (VELCADE 、阿霉素、薩立多胺)、VADT (VELCADE 、阿霉素、 薩立多胺、地塞米松)或DCEP (地塞米松、環(huán)磷酰胺、依托泊苷、順鉬)。
在干細胞移植之前進行的多發(fā)性骨髓瘤的化學(xué)治療被稱為誘導(dǎo)治療。本文列出的某些化學(xué)治療劑比其它更適于誘導(dǎo)治療?？捎糜贛M誘導(dǎo)治療的化學(xué)治療劑的例子包括地塞米松、薩立多胺/地塞米松、環(huán)磷酰胺、VAD和DVd。因為MM常常對化學(xué)治療具有抗性，治療劑的施用可以按比常規(guī)化學(xué)治療更高的劑量進行。這種高劑量化學(xué)治療通常產(chǎn)生骨髓毒性，常與干細胞移植結(jié)合使用。MM化學(xué)治療的劑量和時程是本領(lǐng)域中公知的，可以結(jié)合抗癌疫苗DNL構(gòu)建體的施用采取任何這種已知的劑量和/或時程。
在DNL疫苗用于匪以外的其它類型癌癥的情況下，其它化學(xué)治療方案是已知的。 例如，“CVB” (1. 5g/m2環(huán)磷酰胺、200-400mg/m2依托泊苷和150-200mg/m2卡莫司汀)是用于治療非何杰金氏淋巴瘤的方案。Patti等，Eur. J.Haematol. 51 :18(1993)。其它合適的組合化學(xué)治療方案是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。參見例如Freedman等，“Non-Hodgkin' s Lymphomas, “ CANCER MEDICINE, VOLUME 2，3rdEdition，Holland 等(編輯)，2028-2068 頁 (Lea&Febiger 1993)。作為例示，治療中度非何杰金氏淋巴瘤(NHL)的第一代化學(xué)治療方案包括C-MOPP (環(huán)磷酰胺、長春新堿、丙卡巴胼和潑尼松)和CHOP (環(huán)磷酰胺、阿霉素、長春新堿和潑尼松)。有用的第二代化學(xué)治療方案是m-BAC0D(甲氨蝶呤、博萊霉素、阿霉素、環(huán)磷酰胺、長春新堿、地塞米松和亞葉酸)，而合適的第三代方案是MACOP-B(甲氨蝶呤、阿霉素、環(huán)磷酰胺、長春新堿、潑尼松、博萊霉素和亞葉酸)。針對其它類型癌癥可用的化學(xué)治療劑包括但不限于5-氟尿嘧啶、阿普立啶、阿扎立平、阿納托唑、蒽環(huán)霉素、苯達莫司汀、博萊霉素、硼替佐米、苔蘚抑素-1、白消安、刺孢霉素、喜樹堿、卡鉬、10-羥基喜樹堿、卡莫司汀、 西樂葆、瘤可寧、順鉬、Cox-2抑制劑、依立替康(CPT-Il)、SN-38、卡鉬、克拉屈濱、喜樹堿、 環(huán)磷酰胺、阿糖胞苷、氮烯唑胺、多西他奇、更生霉素、柔紅霉素、阿霉素、2-吡咯啉并阿霉素(2P-D0X)、氰基嗎啉代阿霉素、葡糖苷酸阿霉素、葡糖苷酸表柔比星、雌氮芥、表葉毒素、 雌激素受體結(jié)合劑、依托泊苷(VP 16)、葡糖苷酸依托泊苷、磷酸依托泊苷、氟尿苷(FUdR)、 3'，5' -0-二油?；?FudR(FUdR-d0)、氟達拉濱、氟他米特、法尼基蛋白轉(zhuǎn)移酶抑制劑、吉西他濱、羥基脲、去甲氧正定霉素、異環(huán)磷酰胺、L-天冬酰胺酶、來那度胺、亞葉酸、環(huán)己亞硝脲、二氯甲基二乙胺、美法侖、巰嘌呤、6-巰基嘌呤、甲氨蝶呤、米托蒽醌、米拉霉素、絲裂霉素、米托坦、諾維本、亞硝基脲、丁酸苯酯、普卡霉素、丙卡巴胼、紫杉醇、噴司他丁、PSI-341、 雷洛昔芬、司莫司汀、鏈佐星、它莫西芬、紫杉酚、替莫唑胺(DTIC的含水形式)、反鉬、薩立多胺、硫鳥嘌呤、噻替派、替尼泊苷、托泊替康、尿嘧啶氮芥、長春瑞濱、長春花堿、長春新堿和長春花生物堿。
配方 可以根據(jù)已知制備藥用組合物的方法來配制抗癌疫苗DNL構(gòu)建體，由此使抗癌疫苗DNL構(gòu)建體在混合物中與藥用輔料結(jié)合。消毒磷酸鹽緩沖鹽水是藥用輔料的一個例子。其它合適的輔料是本領(lǐng)域中公知的。參見例如Ansel等，PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS,5th Edition(Lea&Febiger 1990)和 Gennaro(編輯)REMINGTON' S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18th Edition (Mack Publishing Company 1990)及其修訂版本。
抗癌疫苗可以配制成用以通過例如團注或連續(xù)輸注來進行靜脈內(nèi)施用。可以按單位劑型提供用于注射的制劑，例如在安瓶或多劑量容器中并添加防腐劑。組合物所采取的形式可以為例如在油或水性載體中的懸浮液、溶液或乳液，并且可以含有配制劑，如懸浮劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑。作為另外的選擇，在使用前，活性成分可以為與合適的載體(例如消毒無熱原水)配合的粉末形式。
可以采用另外的制藥方法來控制抗癌疫苗的作用持續(xù)時間?？梢酝ㄟ^使用聚合物來復(fù)合或吸附抗癌疫苗DNL構(gòu)建體來制備緩釋制劑。例如，生物相容性聚合物包括乙烯-醋酸乙烯酯共聚物基質(zhì)和硬脂酸二聚體與癸二酸的聚酸酐共聚物基質(zhì)。Sherwood 等，Bio/Technology 10:1446(1992)。從這種基質(zhì)中釋放的速率取決于抗癌疫苗DNL構(gòu)建體的分子量、基質(zhì)內(nèi)的抗癌疫苗量以及分散粒子的尺寸。Saltzman等，Biophys. 1 55: 163(1989) ；Sherwood 等，上文· Other solid dosage forms are described in Ansel 等， PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS,5th Edition(Lea&Febiger 1990)和 Gennaro (編輯)，REMINGTON' S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18th Edition (Mack Publishing Company 1990)及其修訂版本。
也可以對哺乳動物皮下或甚至通過其它非腸道途徑施用抗癌疫苗DNL構(gòu)建體。此外，施用可以通過連續(xù)輸注或通過單次或多次團注進行。優(yōu)選地，通過皮下注射方式以單次或多次團注施用抗癌疫苗。
一般來講，對人施用的抗癌疫苗DNL構(gòu)建體的劑量隨諸如患者年齡、體重、身高、 性別、一般體格狀況和既往病史之類的因素而不同?？扇〉氖菫榻邮苷咛峁┑目拱┮呙鏒NL 構(gòu)建體的劑量范圍是單次施用為lmg/kg至25mg/kg，但視情況而定，也可以施用較低或較高的劑量。例如，對于70kg患者來說，l-20mg/kg的劑量是70-1，400mg,或者對于1. 7m患者來說，為41-82%ig/m2。為誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，根據(jù)需要可以重復(fù)該劑量。
在優(yōu)選實施例中，疫苗DNL構(gòu)建體可用于癌癥的治療。癌癥的例子包括但不限于癌瘤、淋巴瘤、成膠質(zhì)細胞瘤、黑色素瘤、肉瘤和白血病、骨髓瘤或淋巴惡性腫瘤。此類癌癥的更具體的例子如下所述，包括鱗狀細胞癌(如，上皮鱗狀細胞癌)、尤因肉瘤、維爾姆斯瘤、星形細胞瘤、肺癌(包括小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、肺鱗狀癌)、腹膜癌、肝細胞癌、胃癌(包括胃腸癌)、胰腺癌、多形性成膠質(zhì)細胞瘤、宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、 肝細胞瘤、肝細胞癌、神經(jīng)內(nèi)分泌瘤、甲狀腺髓質(zhì)癌、分化型甲狀腺癌、乳腺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌、直腸癌、子宮內(nèi)膜癌或子宮癌、唾液腺癌、腎癌、前列腺癌、外陰癌、肛門癌、陰莖癌以及頭頸癌。術(shù)語“癌癥”包括原發(fā)惡性細胞或腫瘤(例如，其細胞尚未遷移到受試者體內(nèi)初始惡性腫瘤或腫瘤部位以外的部位的那些)和次發(fā)性惡性細胞或腫瘤(例如，由轉(zhuǎn)移-惡性細胞或腫瘤細胞遷移到不同于初始腫瘤部位的次發(fā)部位-引起的那些)。
癌癥或惡性腫瘤的其它例子包括但不限于急性兒童成淋巴細胞性白血病、急性成淋巴細胞性白血病、急性淋巴細胞性白血病、急性骨髓性白血病、腎上腺皮質(zhì)癌、成人 (原發(fā)性)肝細胞癌、成人(原發(fā)性)肝癌、成人急性淋巴細胞性白血病、成人急性骨髓性白血病、成人何杰金氏淋巴瘤、成人淋巴細胞性白血病、成人非何杰金氏淋巴瘤、成人原發(fā)性肝癌、成人軟組織肉瘤、艾滋病相關(guān)淋巴瘤、艾滋病相關(guān)惡性腫瘤、肛門癌、星形細胞瘤、膽管癌、膀胱癌、骨癌、腦干膠質(zhì)瘤、腦腫瘤、乳腺癌、腎盂輸尿管癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)(原發(fā)性) 淋巴瘤、中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤、小腦星形細胞瘤、大腦星狀細胞瘤、宮頸癌、兒童(原發(fā)性) 肝細胞癌、兒童(原發(fā)性)肝癌、兒童急性成淋巴細胞白血病、兒童急性骨髓性白血病、兒童腦干膠質(zhì)瘤、兒童小腦星形細胞瘤、兒童大腦星狀細胞瘤、兒童顱外生殖細胞腫瘤、兒童何杰金氏病、兒童何杰金氏淋巴瘤、兒童小丘腦及視通路膠質(zhì)瘤、兒童成淋巴細胞白血病、兒童成神經(jīng)管細胞瘤、兒童非何杰金氏淋巴瘤、兒童松果體及幕上原始神經(jīng)外胚層腫瘤、兒童原發(fā)性肝癌、兒童橫紋肌肉瘤、兒童軟組織肉瘤、兒童視通路及下丘腦膠質(zhì)瘤、慢性淋巴細胞性白血病、慢性髓細胞性白血病、結(jié)腸癌、皮膚T淋巴細胞瘤、內(nèi)分泌胰島細胞癌、內(nèi)分泌癌、子宮內(nèi)膜癌、室鼓膜瘤、上皮癌、食管癌、尤因肉瘤及相關(guān)腫瘤、外分泌胰腺癌、顱外生殖細胞腫瘤、性腺外生殖細胞腫瘤、肝外膽管癌、眼癌、女性乳腺癌、高歇氏病、膽囊癌、胃癌、胃腸類腫瘤、胃腸腫瘤、生殖細胞腫瘤、妊娠性滋養(yǎng)層細胞瘤、毛細胞性白血病、頭頸癌、 肝細胞癌、何杰金氏淋巴瘤、高丙種球蛋白血癥、咽下癌、腸癌、眼內(nèi)黑素瘤、胰島細胞癌、胰島細胞胰腺癌、卡波濟氏肉瘤、腎癌、喉癌、唇及口腔癌、、肝癌、肺癌、淋巴增生性障礙、巨球蛋白血癥、男性乳腺癌、惡性間皮瘤、惡性胸腺瘤、成神經(jīng)管細胞瘤、黑色素瘤、間皮瘤、轉(zhuǎn)移性不明原發(fā)性頸部鱗狀細胞癌、轉(zhuǎn)移性原發(fā)頸部鱗狀細胞癌、轉(zhuǎn)移性頸部鱗狀細胞癌、多發(fā)性骨髓瘤、多發(fā)性骨髓瘤/漿細胞贅生物、骨髓增生異常綜合征、粒細胞性白血病、骨髓性白血病、骨髓增生障礙、鼻腔及鼻旁竇癌、鼻咽癌、成神經(jīng)細胞瘤、非何杰金氏淋巴瘤、非黑素瘤皮膚癌、非小細胞肺癌、不明原發(fā)轉(zhuǎn)移性頸部鱗狀細胞癌、口咽癌、骨纖維/惡性纖維肉瘤、骨肉瘤惡性纖維組織細胞瘤、骨肉瘤/骨惡性纖維組織細胞瘤、卵巢上皮癌、卵巢生殖細胞腫瘤、卵巢低度惡性潛能腫瘤、胰腺癌、異常蛋白血癥、真性紅細胞增多癥、甲狀旁腺癌、陰莖癌、嗜鉻細胞瘤、垂體腫瘤、原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤、原發(fā)性肝癌、前列腺癌、直腸癌、腎細胞癌、腎盂輸尿管癌、視網(wǎng)膜母細胞瘤、橫紋肌肉瘤、唾液腺癌、伯克氏肉樣肉瘤、 塞扎萊綜合征、皮膚癌、小細胞肺癌、小腸癌、軟組織肉瘤、頸部鱗狀細胞癌、胃癌、幕上原發(fā)性神經(jīng)外胚層及松果體腫瘤、T-細胞淋巴瘤、睪丸癌、胸腺瘤、甲狀腺癌、腎盂及輸尿管的移行細胞癌、移行腎盂及輸尿管癌、滋養(yǎng)葉瘤、輸尿管及腎盂細胞癌、尿道癌、子宮癌、子宮肉瘤、陰道癌、視通路及下丘腦膠質(zhì)瘤、外陰癌、瓦爾登斯特倫氏巨球蛋白血癥、維爾姆斯氏瘤以及除了位于上面所列器官系統(tǒng)中的生瘤以外的任何其它的增生過多疾病。
本文所述并要求保護的方法和組合物可用于治療惡性或惡化前的癥狀以及防止惡化成腫瘤或惡性腫瘤狀態(tài)，包括但不限于上述的那些疾病。這種用途顯示在已知或疑似為腫瘤形成或癌癥的前期病變的病癥中，特別是已發(fā)生包括增生、轉(zhuǎn)化的非腫瘤細胞生長，最具體地說，出現(xiàn)發(fā)育異常的情況(關(guān)于這種異常生長狀態(tài)的綜述，參見RcAbins和 Angell, Basic Pathology,2d Ed. , W.B.Saunders Co. , Philadelphia,68-79 M (1976))。
發(fā)育異常往往是癌癥的先兆，主要見于上皮。其為非腫瘤細胞生長的最無序形式， 涉及個體細胞一致性和細胞結(jié)構(gòu)定向的喪失。發(fā)育異常典型地出現(xiàn)在有慢性刺激或炎癥的地方?？梢灾委煹陌l(fā)育異常病癥包括但不限于無汗性外胚層發(fā)育異常、面前發(fā)育異常、窒息性胸廓發(fā)育異常、心房-手指發(fā)育異常、支氣管肺發(fā)育異常、大腦發(fā)育異常、宮頸非典型增生、軟骨外胚層發(fā)育異常、鎖骨顱骨發(fā)育異常、先天性外胚葉發(fā)育異常、顱骨骨干發(fā)育異常、 顱腕跗發(fā)育異常、顱骨干骺端發(fā)育異常、牙本質(zhì)發(fā)育異常、骨干發(fā)育異常、外胚層發(fā)育異常、 琺瑯質(zhì)發(fā)育異常、腦性眼球發(fā)育異常、偏側(cè)骨骺發(fā)育異常、多發(fā)性骨骺發(fā)育異常、點狀骨骺發(fā)育異常、上皮異常增生、面-指(趾)-生殖器發(fā)育異常、家族性頌骨纖維異常增殖癥、家族性黏膜白色皺襞發(fā)育異常、纖維肌性發(fā)育異常、骨纖維異常增殖癥、旺盛骨性發(fā)育異常、 遺傳性腎視網(wǎng)膜發(fā)育異常、出汗性外胚層發(fā)育異常、少汗性外胚葉發(fā)育異常、淋巴細胞減少性胸腺發(fā)育異常、乳腺發(fā)育異常、下腭面骨發(fā)育異常、干骺端發(fā)育異常、蒙底尼發(fā)育異常、單骨纖維發(fā)育異常、粘膜上皮發(fā)育異常(mucoepithelial dysplasia)、多發(fā)性骨骺發(fā)育異常、眼耳脊椎發(fā)育異常、眼齒指發(fā)育異常、直腸椎骨發(fā)育異常(culovertebral dysplasia)、牙源性發(fā)育異常、opthalmomandibulomelic dysplasia、根尖周牙骨質(zhì)異常增生、多發(fā)性骨纖維性發(fā)育異常、假性軟骨發(fā)育不全性脊椎骨骺發(fā)育異常、視網(wǎng)膜發(fā)育不全、視-隔發(fā)育異常、脊椎骨骺發(fā)育異常和腦室橈骨發(fā)育異常。
可以治療的另外的腫瘤前病癥包括但不限于良性異常增生疾病(例如，良性腫瘤、纖維囊性病癥、組織肥大、腸息肉或腺瘤和食管癌前病變)、粘膜白斑病、角化病、博文氏病、慢性光化性皮炎、日光性唇炎和日光性角化病。
在優(yōu)選實施例中，本發(fā)明的方法用于抑制癌癥(特別是上面所列那些)的生長、惡化和/或轉(zhuǎn)移。
另外的增生過多性疾病、病癥和/或癥狀包括但不限于如下的惡性腫瘤及相關(guān)病癥的惡化和/或轉(zhuǎn)移白血病(包括急性白血病(例如，急性淋巴細胞性白血病、急性骨髓性白血病(包括成髓細胞、前髓細胞、髓單核細胞、單核細胞和紅白血病))及慢性白血病 (例如，慢性髓細胞(粒細胞)白血病和慢性淋巴細胞性白血病))、真性紅細胞增多癥、淋巴瘤(如，何杰金氏病和非何杰金氏病)、多發(fā)性骨髓瘤、瓦爾登斯特倫氏巨球蛋白血癥、 重鏈病和實體瘤，包括但不限于肉瘤和癌瘤，如纖維肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、 成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、內(nèi)皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管內(nèi)皮肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、尤因氏瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結(jié)腸癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鱗狀細胞癌、 基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳突狀腺癌、囊腺癌、髓樣癌、支氣管癌、腎細胞癌、肝癌、膽管癌、絨毛膜癌、精原細胞瘤、胚胎癌、維爾姆斯瘤、宮頸癌、睪丸瘤、肺癌、 小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、星形細胞瘤、成神經(jīng)管細胞瘤、顱咽管瘤、室鼓膜瘤、松果體瘤、成血管細胞瘤、聽神經(jīng)瘤、少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤、腦膜瘤、黑色素瘤、神經(jīng)母細胞瘤和視網(wǎng)膜母細胞瘤。
試劑盒 各實施例可涉及容納適于治療或診斷患者病變組織的組分的試劑盒。示例性試劑盒可以含有至少一種或多種如本文所述的抗癌疫苗構(gòu)建體。如果含施用組分的組合物不是配制成經(jīng)由消化道遞送(如通過口服)，則可以包括能夠通過一些其它途徑遞送試劑盒組分的裝置。對于諸如非腸道施用之類的應(yīng)用而言，一種類型的裝置是用來向受試者體內(nèi)注入組合物的注射器。也可以使用吸入裝置。在某些實施例中，可以以含消毒液制劑或凍干制劑的預(yù)裝注射器或自動注射筆的形式提供治療劑。
試劑盒組分可以包裝在一起或分裝在兩個或多個容器中。在一些實施例中，容器可以是小瓶，所述小瓶中含有適于調(diào)配的組合物的消毒凍干制劑。試劑盒還可以含有一種或多種適于調(diào)配和/或稀釋其它試劑的緩沖劑?？梢允褂玫钠渌萜靼ǖ幌抻诖?、盤、 盒、管等等。試劑盒組分可以消毒地包裝并保存在容器內(nèi)。可以包括在內(nèi)的另一部分是用戶使用試劑盒的使用說明書。
表達載體 另外一些實施例可以涉及包含編碼抗癌疫苗構(gòu)建體或其組成融合蛋白的核酸的 DNA序列。融合蛋白可以包含連接于不同肽或蛋白質(zhì)(如，用于DNL構(gòu)建體形成的AD和DDD 肽)的抗CD74抗體或CD20異種抗原，其將在下面的實例中更詳細描述。作為另外的選擇， 編碼的融合蛋白可以包含連接于不同抗體或異種抗原的DDD或AD部分。
各實施例涉及包含編碼DNA序列的表達載體。載體可以含有編碼人免疫球蛋白的輕鏈和重鏈恒定區(qū)以及鉸鏈區(qū)的序列，嵌合、人化或人可變區(qū)序列可連接于上述序列。載體可另外含有表達選定宿主細胞中的編碼蛋白的啟動子、增強子和信號或前導(dǎo)序列。特別有用的載體是pdHL2或GS。更優(yōu)選地，輕鏈和重鏈恒定區(qū)以及鉸鏈區(qū)可來自于人EU骨髓瘤免疫球蛋白，其中任選地，至少一個異型位置上的氨基酸被改成見于不同IgGl異型中的氨基酸，且其中任選地，基于EU數(shù)體系的EU的重鏈的氨基酸253可以用丙氨酸替換。參見 Edelman 等，Proc. Natl. Acad, ki USA 63:78-85(1969)。在其它實施例中，IgGl 序列可以轉(zhuǎn)換為IgG4序列。
本領(lǐng)域技術(shù)人員會意識到，基因改造表達構(gòu)建體并插入宿主細胞以表達改造的蛋白質(zhì)的方法是本領(lǐng)域中公知的，只需進行例行的試驗。例如，2005年7月25日提交的美國專利申請No. 11/187，863,2005年10月20日提交的No. 11/253，666以及2006年7月14 日提交的No. 11/487,215中已描述了表達克隆抗體或片段的宿主細胞及方法，它們每個的實例部分以引用的方式并入本文。
實例 提供下面的實例以說明(但不限制)本發(fā)明的權(quán)利要求。
實例1.對接和鎖定(DNL)構(gòu)建體的制備 DDD和AD融合蛋白 DNL技術(shù)可以用來制備包含幾乎任何抗體或其片段或其它效應(yīng)子部分的二聚體、 三聚體、四聚體、六聚體等。對于某些優(yōu)選實施例而言，IgG抗體、F(ab' )2抗體片段和異種抗原(例如CD20異種抗原)可以被制成含二聚及對接域(DDD)或錨定域(AD)序列的融合蛋白。盡管在優(yōu)選實施例中，DDD和AD部分被制成融合蛋白，但本領(lǐng)域技術(shù)人員會意識到， 在權(quán)利要求的方法和組合物的范圍內(nèi)可以利用其它的綴合方法，如化學(xué)交聯(lián)。
可以通過將例如抗⑶74抗體的Fab-DDD融合蛋白與⑶20-AD融合蛋白結(jié)合而形成DNL構(gòu)建體。作為另外的選擇，可以制備將IgG-AD融合蛋白與CD20-DDD融合蛋白結(jié)合的構(gòu)建體。所述技術(shù)不是限制性的，任何可用的蛋白質(zhì)或肽都可以制成用于結(jié)合到DNL構(gòu)建體當中的AD或DDD融合蛋白。在利用化學(xué)交聯(lián)的情況下，AD和DDD綴合物不限于蛋白質(zhì)或肽，可以包括能通過本領(lǐng)域中已知的任何交聯(lián)技術(shù)與AD或DDD序列交聯(lián)的任何分子。
可以為每個DDD或AD融合蛋白開發(fā)獨立的轉(zhuǎn)基因細胞系。一旦產(chǎn)生，可根據(jù)需要純化模塊，或保存在細胞培養(yǎng)上清液中。在產(chǎn)生之后，可以將任何DDD融合蛋白模塊與任何 AD融合蛋白模塊結(jié)合以產(chǎn)生DNL構(gòu)建體。對于不同類型的構(gòu)建體而言，可以利用不同的AD 或DDD序列。下面提供了示例性的DDD和AD序列。
DDDl SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA (SEQ ID NO: 10) DDD2 CGHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA (SEQ ID NO 11) ADl:QIEYLAKQIVDNAIQQA(SEQ ID NO :12) AD2 :CGQIEYLAKQIVDNAIQQAGC(SEQ ID NO :13) 表達載體 質(zhì)粒載體pdHL2被用于產(chǎn)生多種抗體和基于抗體的構(gòu)建體。參見Gillies等，J Immunol Methods(1989)，125 :191-202 ；Losman 等，Cancer (Phila) (1997) ,80 :2660_6。雙順反子哺乳動物表達載體主導(dǎo)IgG的重鏈和輕鏈的合成。對許多不同的IgG-pdHL2構(gòu)建體來說，載體序列大部分是相同的，區(qū)別僅在可變域(VH和VL)序列。使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的分子生物學(xué)工具可以將這些IgG表達載體轉(zhuǎn)變成Fab-DDD或Fab-AD表達載體。為了產(chǎn)生Fab-DDD表達載體，重鏈的鉸鏈、CH2和CH3域的編碼序列用編碼鉸鏈前4個殘基、14殘基Gly-Ser連接體和人RII α的前44個殘基的序列替換(被稱為DDD1)。為了產(chǎn)生Fab-AD 表達載體，IgG的鉸鏈、CH2和CH3域的序列用編碼鉸鏈前4個殘基、15殘基Gly-Ser連接體和稱為AKAP-IS的17殘基合成AD的序列替換(被稱為ADl)，上述序列的產(chǎn)生利用了生物信息學(xué)和肽陣列技術(shù)，顯示出與RII α 二聚體的高親和力結(jié)合(0.4ηΜ)。參見Alto等， Proc. Natl. Acad. Sci.，U. S. A (2003)，100 4445-50 設(shè)計兩種穿梭載體以幫助IgG_pdHL2載體轉(zhuǎn)為Fab-DDDl或Fab-ADl表達載體，如下所述。
CHl的制備 使用pdHL2質(zhì)粒載體為模板，通過PCR擴增CHl域。左側(cè)PCR引物由CHl域的上游 (5')端和McII限制性核酸內(nèi)切酶位點組成，該位點為CHl編碼序列的5'。右側(cè)引物由編碼鉸鏈(PKSC(SEQ ID NO :29)的前4個殘基且后面有4個甘氨酸和絲氨酸的序列組成， 最后兩個密碼子(GS)包含Barn HI限制性位點。將410bp PCR擴增引物克隆到PGEMT PCR克隆載體( 1 01^64 ,111(3.)，并篩選用于17(5')方向的插入物的克隆。
公開為(SEQID NO 14)的(G4S)2DDDK(G4S)2 的構(gòu)建 由Sigma GENOSYS (Haverhill，UK)合成雙鏈寡核苷酸(名稱為 (QS)2DDDl (Oi4S)2,公開為SEQ ID NO 14))以編碼前面有連接肽的11個殘基的氨基酸序列 DDD 1，前兩個密碼子包含BamHI限制性位點。終止密碼子和fegl限制性位點附于3'端。 編碼的多肽序列在下面示出。
GSGGGGSGGGGSHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVE YFTRLREARA(SEQ ID NO: 15) 合成兩種寡核苷酸(名稱為RIIA1-44頂部和RIIA1-44底部，由其3'端上的30 個堿基對重疊)(Sigma GENOSYS )，結(jié)合以包含174bpDDD 1序列的中央154堿基對。對寡核苷酸退火并使之經(jīng)受與Taq聚合酶的引物延伸反應(yīng)。引物延伸后通過PCR擴增雙鏈。 將擴增引物克隆到PGEMT ，并篩選用于T7(5')方向的插入物。
公開為SEQ ID NO 14)的(G4S)2-ADK(G4S)2 的構(gòu)建 合成雙鏈寡核苷酸(名稱為(G4S)2-ADl((G4S)2,公開為 SEQ ID NO 14)) (Sigma GENOSYS )以編碼前面有連接肽的11個殘基的氨基酸序列ADl，前兩個密碼子包含BamHI 限制性位點。終止密碼子和fegl限制性位點附于3'端。編碼的多肽序列在下面示出。
GSGGGGSGGGGSQIEYLAKQIVDNAIQQA(SEQ ID NO :16) 合成編碼上述肽序列的兩條互補重疊寡核苷酸(名稱為AKAP-IS頂部和AKAP-IS 底部)并退火。通過PCR擴增雙鏈。將擴增引物克隆到PGEMT 載體并篩選用于T7(5') 方向的插入物。
連接DDDl 與 CHl 用BamHI和NotI限制性內(nèi)切酶從PGEMT 上切下編碼DDDl序列的190bp片段， 然后連接到CH1-PGEMT⑧中的相同位點以產(chǎn)生穿梭載體CH1-DDD1-PGEMT ‘ 。
連接ADl 與 CHI 用BamHI和NotI從PGEMT 上切下含AD 1序列的IlObp片段并連接到 CH1-PGEMT 中的相同位點以產(chǎn)生穿梭載體CH1-AD1-PGEMTO 。
將CHl-DDDl或CH1-AD1克隆到基于pdHL2的載體 通過這種模塊化設(shè)計可以將CHI-DDDl或CHl-ADl結(jié)合到pdHL2載體中的任何 IgG構(gòu)建體當中。通過將McII/fegl限制性片段(CH1-CH3)從pdHL2中移除并用從相應(yīng)的pGemT穿梭載體上切下的CHl-DDDl或CHl-ADl的McII/fegl片段替換，由此將整個重鏈恒定域被上述構(gòu)建體之一替換。
h679-Fd-ADl_pdHL2 的構(gòu)建 h679-Fd-ADl_pdHL2是用以產(chǎn)生h679 Fab的表達載體，后者帶有經(jīng)由14個氨基酸殘基組成的柔性Gly/Ser肽間隔物與Fd的CHl域的羧基末端偶聯(lián)的AD1。通過用 CHl-ADl片段替片段而將含h679的可變域的基于pdHL2的載體轉(zhuǎn)變成 h679-Fd-ADl-pdHL2，所述 CH1-AD1 片段是用 SacII 和 Eagl 從 CH1-AD1-SV3 穿梭載體上切下的。
C-DDDl-Fd-hMN-14-pdHL2 的構(gòu)建 C-DDDl-Fd-hMN-14-pdHL2 是用以產(chǎn)生含有兩個融合蛋白 C_DDDl-Fab-hMN_14 的拷貝的穩(wěn)定二聚體的表達載體，其中DDDl經(jīng)由柔性肽間隔物在CHl的羧基末端與 hMN-14 Fab連接。通過用SacII和fegl限制性核酸內(nèi)切酶消化以移除CH1-CH3域并插入CHl-DDDl片段，由此將已被用來產(chǎn)生hMN-14 IgG的質(zhì)粒載體hMN_14 (I)-pdHL2轉(zhuǎn)變成 C-DDDl-Fd-hMN-14-pdHL2，所述 CH1-DDD1 片段是用 SacII 和 fegl 從 CH1-DDD1-SV3 穿梭載體上切下的。
已經(jīng)利用相同的技術(shù)產(chǎn)生用于各種已知抗體(如，hLLl、hLL2、hPAM4、hRl、hRS7、 hMN-14、hMN15、hA19、hA20及許多其它抗體)的Fab表達的質(zhì)粒。一般來講，抗體可變區(qū)編碼序列存在于pdHL2表達載體，并且如上所述轉(zhuǎn)變該表達載體以產(chǎn)生AD-或DDD-融合蛋白。
C-DDD2-Fd-hMN-14-pdHL2 的構(gòu)建 C-DDD2-Fd-hMN-14-pdHL2 是用以產(chǎn)生 C-DDD2_FabhMN_14 的表達載體，后者具有經(jīng)由14氨基酸殘基GlyAer肽附于hMN-14的Fd的羧基末端的DDD2的二聚及對接域序列。 分泌的融合蛋白由通過DDD2域的非共價相互作用保持在一起的兩個相同的hMN-14 Fab的拷貝組成。
表達載體的改造如下。以合成方式制備兩條重疊互補的寡核苷酸，所述寡核苷酸包含部分連接肽(GGGGSGGGCG，SEQ ID NO 17)的編碼序列和DDD2的1_13殘基。寡核苷酸退火并用T4 PNK磷酸化，在5'和3'端上產(chǎn)生懸垂部分，所述懸垂部分對與分別用限制性核酸內(nèi)切酶BamHI和I^stI消化的DNA的連接是相容的。
雙鏈DNA與通過用BamHI和I3StI消化制備的穿梭載體CHI-DDDI-PGEMT ’ 連接以產(chǎn)生穿梭載體 CH1-DDD2-PGEMT 。用 SacII 和 EagI 從 CHl-DDD2-PGEMT 上切下 507bp 片段，并與通過用SacII和fegl消化制備的IgG表達載體hMN-14(I)-pdHL2連接。最終表達構(gòu)建體被稱為C-DDD2-FdhMN-14-pdHL2。類似的技術(shù)已被用于產(chǎn)生許多不同人化抗體的 Fab片段的DDD2融合蛋白。
h679-Fd-AD2-pdHL2 的構(gòu)建 h679-Fd-AD2-pdHL2是用以產(chǎn)生h679-Fab-AD2表達載體，后者具有經(jīng)由14氨基酸殘基Gly/Ser肽連接體附于CHl域的羧基末端的AD2的錨定域序列。AD2在ADl的錨定域序列之前具有一個半胱氨酸殘基，在其后具有另一個半胱氨酸殘基。
表達載體的改造如下。以合成方式制備兩條重疊互補的寡核苷酸，所述寡核苷酸包含AD2的編碼序列和部分連接體序列。寡核苷酸退火并用T4 PNK磷酸化，在5'和3' 端上產(chǎn)生懸垂部分，所述懸垂部分對與分別用限制性核酸內(nèi)切酶BamHI和Spel消化的DNA 的連接是相容的。
將雙鏈DNA連接到通過用BamHI和Spel消化制備的穿梭載體CH1_AD1_PGEMT 以產(chǎn)生穿梭載體CH1-AD2-PGEMT ‘ 。用SacII和fegl限制性內(nèi)切酶從穿梭載體上切下含CHl 和AD2編碼序列的4 堿基對片段并連接到通過用那些相同的酶消化制備的h679-pdHL2 載體。最終的表達載體是h679-Fd-AD2-pdHL2。
TF2三聚DNL構(gòu)建體的產(chǎn)生 通過使C-DDD2-Fab-hMN-14與h679_Fab_AD2反應(yīng)獲得被稱為TF2的三聚DNL構(gòu)建體。如下產(chǎn)生試驗批量的TF2，產(chǎn)率> 90%。按1.4 1的摩爾比混合蛋白L-純化的 C-DDD2-Fab-hMN-14 (200mg)與 h679_Fab_AD2 (60mg)。在含有 ImM EDTA 的 PBS 中的總蛋白濃度為5mg/ml。后續(xù)步驟涉及TCEP還原、HIC色譜法、DMSO氧化和IMP 291親合色譜法。 在添加TCEP之前，SE-HPLC不顯示任何￡1213形成的跡象。添加5mM TCEP迅速導(dǎo)致形成與二元結(jié)構(gòu)所預(yù)計的157kDa蛋白質(zhì)一致的a2b復(fù)合體。通過IMP 291親合色譜法將TF2純化到接近同質(zhì)(未示出)。IMP 291是含有679Fab與之結(jié)合的HSG半抗原的合成肽(Rossi等， 2005, Clin Cancer Res 11 :7122s_29s)。IMP291 未結(jié)合部分的 SE-HPLC 分析證實了 ￡i4、a2 和游離κ鏈從產(chǎn)物中的移除(未示出)。
非還原性SDS-PAGE分析證實了大部分TF2存在為大共價結(jié)構(gòu)，IgG結(jié)構(gòu)的附近有相對的移動性(未示出)。還原性SDS-PAGE表明，因為只有表示TF2的組成多肽的帶是明顯的(未示出)，所以在非還原凝膠中明顯的任何附加帶都與產(chǎn)物相關(guān)(未示出)。然而， 四種多肽中的每種的相對移動性太接近而不能分辨。MALDI-T0F質(zhì)譜法(未示出)顯示 156，434Da的單峰，其在TF2計算質(zhì)量(157，319Da)的99. 5%之內(nèi)。
通過BIAC0RE ⑧試驗確定 TF2 的官能度。將 TF2、C-DDDl-hMN-14^679_ADl (用作非共價￡i2b復(fù)合體的對照樣品)或C-DDD2-hMN-14^679-AD2 (用作未還原的ει2和b組分的對照樣品)稀釋到1 μ g/ml (總蛋白)，并通過用HSG固定的傳感芯片。TF2的響應(yīng)是兩個對照樣品的大約兩倍，表明只有對照樣品中的h679-Fab-AD組分與傳感芯片結(jié)合并保持在其上。隨后注射WI2 IgG(hMN-14的抗個體基因型抗體)表明，只有TF2具有與h679_Fab_AD 緊密結(jié)合的DDD-Fab-hMN-14組分，如附加的信號響應(yīng)所指示的那樣。由WI2與固定在傳感芯片上的TF2結(jié)合引起的響應(yīng)單元的額外增加與兩個全功能結(jié)合位點相對應(yīng)，每個所述結(jié)合位點由C-DDD2-Fab-hMN-14的一個亞單元提供。TF2與WI2的兩個Fab片段結(jié)合的能力證實了這一點(未示出)。
實例2. CH3-AD2-IgG 表達載體 產(chǎn)生質(zhì)粒穿梭載體以幫助將任何IgG_pdHL2載體轉(zhuǎn)變成CH3-AD2_IgG-pdHL2載體。 使用pdHL2載體為模板和以下的寡核苷酸引物，通過PCR擴增Fc的基因(CK2和Ch3域) Fc BglII 左側(cè) AGATCTGGCGCACCTGAACTCCTG(SEQ ID NO 8) Fc Bain-EcoRI ^iM GAATTCGGATCCTTTACCCGGAGACAGGGAGAG(SEQ ID NO :9)。
擴增引物在pGemT PCR克隆載體(Promega)中克隆。用)(ba I和Bam HI從 pGemT上切下Fc插入片段并與通過用Xba I和Bam HI消化h679-Fab_AD2-pdHL2 (Rossi 等，Proc Natl Acad Sci USA 2006，103 :6841-6)制備的 AD2_pdHL2 載體連接，從而產(chǎn)生穿梭載體 ^-Α02-ρ(1Η 2。為了將IgG-pdHL2表達載體轉(zhuǎn)變成CH3-AD2_IgG-pdHL2表達載體，從前者上切下861bp BsrG I/Nde I限制性片段，并用從Fc-AD2-pdHL2載體上切下的 952bp BsrG I/Nde I限制性片段替換。下面是已產(chǎn)生并用以生產(chǎn)重組人化IgG_AD2模塊的 CH3-AD2-IgG-pdHL2表達載體的部分列表 CH3-AD2-IgG-hA20 (抗 CD20)
CH3-AD2-IgG-hLL2 (抗 CD22) CH3-AD2-IgG-hL243 (抗 HLA-DR) CH3-AD2-IgG-hLLl (抗 CD74) CH3-AD2-IgG-hRl (抗 IGF-1R) CH3-AD2-IgG-h734 (抗銦-DTPA)。
實例3. CH3-AD2-IgG 的生產(chǎn) 穩(wěn)定CH3-AD2_IgG分泌細胞系的轉(zhuǎn)染和選擇 所有細胞系生長在Hybridoma SFM(Invitrogen, Carlsbad CA)中。 CH3-AD2-IgG-pdHL2載體(30 μ g)通過用Ml I限制性核酸內(nèi)切酶消化而線性化，并通過電穿孔(450伏，25 μ F)轉(zhuǎn)染到Sp2/0-Agl4(2.8xl06細胞)。pdHL2載體含允許通過甲氨蝶呤 (MTX)克隆選擇和基因擴增的二氫葉酸還原酶的基因。
在轉(zhuǎn)染之后，將細胞涂布在96孔板上，并在含0. 2 μ M MTX的培養(yǎng)基中選擇轉(zhuǎn)基因克隆。使用涂以特定抗個體基因型MAb的96孔微量滴定板，通過夾心ELISA對克隆進行CH3-AD2-IgG產(chǎn)率的篩選。將推定克隆的條件培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至微板的孔中，通過辣根過氧化物酶綴合的山羊抗人IgGF(ab' )2進行融合蛋白的檢測(Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) 0擴增給出最強信號的孔并最終用于生產(chǎn)。
CH3-AD2_IgG模塊的生產(chǎn)和純化 為生產(chǎn)融合蛋白，以2xl05細胞/ml接種滾瓶培養(yǎng)物，并在5% CO2和37°C下于滾瓶培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，直到細胞活力下降到25%以下(-10天)。通過離心澄清肉湯培養(yǎng)物，過濾并通過超濾濃縮到50倍。為了純化CH3-AD2-IgG模塊，將濃縮的上清液裝載到蛋白 A (MAB選擇)親和柱上。柱用PBS沖洗至基線，用0. IM甘氨酸(pH2. 5)洗脫融合蛋白。
實例4. DDD2-mCD20 (136-178)的產(chǎn)生和 DDD2_mCD20 (136-178)-pdHL2 的構(gòu)建 DDD2-mCD20 (136-178)-pdHL2 是 DDD2_mCD20 (136-178)的表達載體，后者包含 DDD2-連接體 _mCD20 (136-178)-HHHHHH (HHHHHH 被公開為 SEQ ID NO 30)。小鼠⑶20(mCD20)的胞外域被稱為mCD20 (136-178)，包含下示序列的136至178氨基酸殘基 TLSHFLKMRRLELIQTSKPYVDIYDCEPSNSSEKNSPSTQYCN(SEQ ID NO :18) 小鼠CD20異種抗原的氨基酸序列在下面示出。
MSGPFPAEPTKGPLAMQPAPKVNLKRTSSLVGPTQSFFMRESKAL GAVQIMNGLFHITLGGLLMIPTGVFAPICLSVWYPLWGGIMYIISG SLLAAAAEKTSRKSLVKAKVIMSSLSLFAAISGIILSIMDIL匪TLS HFLKMRRLELIQTSKPYVDIYDCEPSNSSEKNSPSTQYCNSIQSVFL GILSAMLISAFFQKLVTAGIVENEWKRMCTRSKSNVVLLSAGEKN
EQTIKMKEEIIELSGVSSQPKNEEEIEIIPVQEEEEEEAEINFPAPPQE QESL PVENEIAP(SEQ ID NO 7) 使用全長鼠⑶20 cDNA克隆為模板和下示的兩種引物，通過PCR獲得包含 mCD20 (136-178)的核苷酸序列且兩側(cè)有BamHl和Biol限制性位點的DNA片段。
上游引物BamHImCD20 引物(30-mer) 5' -GGATCCACACTTTCTCATTTTTTAAAAATG(SEQ ID NO 31) 下游引物=XhoImCD20 引物(30-mer) 5' -CTCGAGGTTACAGTACTGTGTAGATGGGGA(SEQ ID NO 32) 將PCR 擴增引物(141bp)克隆到 PGEMT 載體(PROMEGA )。制備 DDD2_pdHL2 哺乳動物表達載體，例如，N-DDD2-hG-CSF-His-pdHL2，用以通過用XbaI和Bam HI限制性核酸內(nèi)切酶消化與擴增引物連接。用)(bal和Barn HI從PGEMT 上切下mCD20_擴增引物， 并連接到DDD2-pdHL2載體以產(chǎn)生表達載體DDD2_mCD20 (136-178)-pdHL2。
轉(zhuǎn)染并篩選以獲得表達DDD2_mCD20 (136-178)的克隆 載體DDD2_mCD20 (136-178)通過用Mil酶消化而線性化，并通過電穿孔穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染到SpESF骨髓瘤細胞(參見，例如，美國專利7，537，930，其實例部分以引用的方式并入本文)。通過ELISA發(fā)現(xiàn)許多克隆具有可檢測水平的DDD2-mCD20 (136-178)，由其中選出最佳生產(chǎn)的克隆并隨后通過在五周內(nèi)將甲氨蝶呤(MTX)濃度從0. 1提高到0.8 μ M來進行擴增。 在此階段，其通過限制稀釋來亞克隆，并擴增最高產(chǎn)的亞克隆。
用0. 8 μ M MTX將克隆擴增到含總共20L無血清Hybridoma SFM的34個滾瓶中， 并使之達到末期培養(yǎng)。通過離心使上清液澄清并過濾(0.2 μ Μ)。濾液滲濾進入IX結(jié)合緩沖液(IOmM咪唑，0. 5Μ NaCl, 50mM NaH2PO4, pH 7. 5)，并在制備時濃縮到310mL，用于通過固定化金屬親和色譜法(IMAC)進行純化。將濃縮物裝載至30-mL Ni-NTA柱，該柱已經(jīng)用Tween 20在IX結(jié)合緩沖液中的0. 02%溶液500mL的清洗，然后經(jīng)^OmL的30mM咪唑、 0. 02% Tween 20、0. 5M NaCl、50mM NaH2PO4 (pH 7. 5)清洗。產(chǎn)物用 IlOmL 的 250mM 咪唑、 0. 02% Tween 20、150mM NaCl、50mM NaH2PO4(pH 7.5)洗脫。在還原條件下通過 SDS-PAGE 測定 DDD2-mCD20 (136-178)的純度。
實例5.產(chǎn)生包含連接于四個mCD20(136-178)的拷貝的hLLl IgG的74_mCD20 DNL
疫苗 如實例2和實例3所述制備CH3-AD2-IgG_hLLl (抗CD74)。構(gòu)建體包含連接于hLLl IgG的每個重鏈C末端的AD2部分。如實例4所述制備DDD2-mCD20(136-178)。通過在含 ImM還原谷胱甘肽的PBS中混合hLLl IgG_AD2和DDD2_mCD20 (136-178)來進行DNL反應(yīng)。在次日加入氧化的谷胱甘肽至2mM的最終濃度，M小時后在蛋白A柱上純化反應(yīng)混合物。 在此實施例中，兩個DDD2-mCD20的拷貝連接于每個AD2部分，產(chǎn)生包含一個hLLl IgG部分和四個mCD20異種抗原部分的DNL復(fù)合體。
在一個可供選擇的實施例中，hLLl的Fab連接于DDD2，mCD20 (136-178)連接于AD2。如上所述形成的DNL構(gòu)建體導(dǎo)致形成名稱為hLLl-F(ab)2-mCD20(136-178)的匪疫苗，其包含連接于hLLl的兩個Fab部分的單個mCD20 (136-178)。實例6描述了 AD2-mCD20 (136-178)的產(chǎn)生。
對患有MM 的受試者施用 74-mCD20 (136-178)或 hLLl-F (ab) 2_mCD20 (136-178)誘導(dǎo)針對CD138MgCD20+推定干細胞的免疫反應(yīng)。免疫反應(yīng)能有效地減少或消除受試者的MM 病細胞。
實例6.重組 AD2_mCD20 (136-178)的產(chǎn)生 AD2-mCD20 (136-178)-pdHL2 是重組 AD2_mCD20 (136-178)的表達載體，后者包含 AD2-連接體-mCD20 (136-178)-HHHHHH(HHHHHH被公開為 SEQ ID NO :30)。使用全長鼠 CD20 cDNA克隆為模板和下示的兩種引物，通過PCR獲得包含mCD20 (136-178)的核苷酸序列且兩側(cè)具有Bgl2和fegl限制性位點的DNA片段。
上游引物Bgl2_mCD20引物(30-mer) 5' -AGATCTACACTTTCTCATTTTTTAAAAATG(SEQ ID NO 33) 下游引物Eagl_mCD20引物(48-mer) 5' CGGCCGTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTTACAGTACTGTGT AGATGG (SEQ ID NO :34) 將PCR擴增引物(162bp)克隆到PGEMT 載體(PROMEGA. )。制備AD2_pdHL2 哺乳動物表達載體，例如，N-AD2-hTransferrin-His-pdHL2，用以通過用Bgl2和fegl限制性核酸內(nèi)切酶消化與擴增弓丨物連接。用Bgl2和fegl從PGEMT 上切下mCD20_擴增引物，并連接到AD2-pdHL2載體，從而產(chǎn)生表達載體AD2-mCD20 (136-178) -pdHL2。如實例4所述獲得表達 AD2-mCD20 (136-178)的克隆，并使用 Ni_select 由培養(yǎng)上清液純化 AD2_mCD20 (136-178)。
實例7. AD和DDD序列變體 在某些優(yōu)選實施例中，結(jié)合到DNL復(fù)合體的AD和DDD序列包含氨基酸序列 AD2 (SEQ ID NO :13)禾口DDD2(SEQ ID NO :11)，如上所述。然而，在可供選擇的實施例中，AD和 /或DDD部分的序列變體可用于構(gòu)建細胞因子-MAb DNL復(fù)合體。AD和DDD域的結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系已成為研究的主題(參見,如,Burns-Hamuro 等，2005，Protein Sci 14 =298292 ；Carr 等， 2001，J Biol Chem 276 :17332-38 ；Alto等，2003，Proc Natl Acad Sci USA 100 :4445-50 ； Hundsrucker等，2006，Biochem J 396 :297-306 ；Stokka 等，2006，Biochem J 400 :493-99 ； Gold 等，2006，Mol Cell 24 :383-95 ;Kinderman 等，2006，Mol Cell24 :397-408)。
例如，Kinderman等Q006)檢查了 AD-DDD結(jié)合相互作用的晶體結(jié)構(gòu)，并得出結(jié)論認為，人DDD序列含有許多在二聚體形成或AKAP結(jié)合中重要的保守氨基酸殘基，在下面的 SEQ ID NO :10中加以下劃線(參見Kinderman等的圖1，2006)。本領(lǐng)域技術(shù)人員會意識到， 在設(shè)計DDD序列的序列變體時，期望要避免改變?nèi)魏渭酉聞澗€的殘基，而對在二聚和AKAP 結(jié)合中不那么重要的殘基可以進行保守的氨基酸替換。
來自蛋白激酶A的人DDD序列 SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO :10) Alto等Q003)進行了各種AKAP蛋白的AD序列的生物信息學(xué)分析，用以設(shè)計被稱 ^ AKAP-IS (SEQ ID NO 12)的RII選擇性AD序列，其對DDD的結(jié)合常數(shù)為0. 4nM。AKAP-IS 序列被設(shè)計為AKAP與PKA結(jié)合的肽拮抗劑。在AKAP-IS序列中，若進行替換往往會降低與 DDD的結(jié)合性的殘基在下面的SEQ ID NO 12中加下劃線表示。
AKAP-IS 序列 QIEYLAKQIVDNAIQQA(SEQ ID NO 12) 類似地，Gold(2006)利用結(jié)晶學(xué)和肽篩選開發(fā)出SuperAKAP-IS序列(SEQ ID NO 19)，其顯示出對PKA的RII異形體的選擇性比RI異形體的高五個數(shù)量級。加下劃線的殘基表示相對于AKAP-IS序列的氨基酸替換位置，這種替換可提高RII α與DDD部分的結(jié)合性。在此序列中，N末端Q殘基被編為4號殘基，C末端A殘基是20號殘基?？梢赃M行替換以影響RII α親和力的殘基是8、11、15、16、18、19和20號殘基(Gold等，2006)?？稍O(shè)想在某些可供選擇的實施例中，SuperAKAP-IS序列可以替換AKAP-IS AD部分序列以制備細胞因子-MAb DNL構(gòu)建體。可替換AKAP-IS AD序列的其它替代性序列示于SEQ ID NO: 20-22。相對于AKAP-IS序列的替換以下劃線表示。可預(yù)計的是，與SEQ ID NO 19中所示的AKAP-IS序列一樣，AD部分也可以包括額外的N-末端殘基半胱氨酸和甘氨酸以及C末端殘基甘氨酸和半胱氨酸。
SuperAKAP-IS QIEYVAKQIVDYAIHQA(SEQIDNO19) 替代性AKAP序列 QIEYKAKQIVDHAIHQA(SEQIDNO20) QIEYHAKQIVDHAIHQA(SEQIDNO21) QIEYVAKQIVDHAIHQA(SEQIDNO22) Stokka等Q006)還開發(fā)了 AKAP與PKA結(jié)合的肽競爭物，示于SEQ ID NO :23_25。 肽拮抗劑名稱為 Ht31(SEQ ID NO :23)、RIAD (SEQ ID NO :24)和 PV-38 (SEQ ID NO :25)。 Ht-31肽顯示出PKA對RII異形體更大的親和力，而RIAD和PV-38顯示出對RI更大的親和力。
Ht31 DLIEEAASRIVDAVIEQVKAAGAY(SEQ ID NO :23) RIAD LEQYANQLADQIIKEATE (SEQ ID NO :24) PV-38 FEELAffKIAKMIffSDVFQQC(SEQ ID NO :25) Hundsrucker等Q006)開發(fā)了另外其它的AKAP與PKA結(jié)合的肽競爭物，PKA的 RII形式對DDD的結(jié)合常數(shù)低至0. 4nM。各種AKAP肽拮抗劑的序列提供在Hundsrucker等 (以引用方式并入本文)的表1中。在不同AKAP蛋白的AD域中高度保守的殘基參照AKAP IS序列(SEQ ID N0 12)以下劃線表示。所述殘基與Alto等(2003)所觀察的相同，加上C 末端丙氨酸殘基(參見Hundsrucker等Q006)的圖4，其以引用方式并入本文)。具有特別高RII DDD序列親和力的肽拮抗劑的序列示出在SEQ ID NO :26- 中。
AKAP-IS QIEYLAKQIVDNAIQQA(SEQ ID NO: 12) AKAP7δ-wt-pep PEDAELVRLSKRLVENAVLKAVQQY(SEQ ID NO :26) AKAP7δ-L304T-p印 PEDAELVRTSKRLVENAVLKAVQQY(SEQ ID NO :27) AKAP7δ_L308D_p印 PEDAELVRLSKRDVENAVLKAVQQY(SEQ ID NO :28) Carr等Q001)檢查了來自人和非人蛋白的不同AKAP結(jié)合DDD序列之間的序列同源程度，并鑒別了 DDD序列中看起來在不同DDD部分中最高度保守的殘基。這些參照SEQ ID N0:10的人PKA RII α DDD序列加下劃線表示。特別保守的殘基用斜體字進一步指出。 所述殘基與Kinderman等認為對與AKAP蛋白結(jié)合重要的殘基重疊但不完全相同。

SmOIPFGLTELLOGYTVEVLRQOPmLYEFAWEYFTRLREARA (SEQ ID NO: 10) 本領(lǐng)域技術(shù)人員會意識到，一般而言，在來自不同蛋白的DDD和AD序列中高度保守的那些氨基酸殘基是優(yōu)選在進行氨基酸替換中保持不變的那些，而更容易改變不那么高度保守的殘基，以產(chǎn)生本文所述的AD和/或DDD序列的序列變體。
本領(lǐng)域技術(shù)人員會意識到，DNL構(gòu)建體的抗體部分或連接體部分中的這些或其它氨基酸替換可以用來增強所得DNL構(gòu)建體的治療和/或藥物動力學(xué)特性。
實例8. hLLl對DC的影響-hLLl與APC的不同亞群的有效結(jié)合 早期研究表明⑶74在包括血液DC、B細胞、單核細胞在內(nèi)的大多數(shù)抗原呈遞細胞中表達。為了進一步表征⑶74在APC中的表達模式，我們檢查了⑶74在人PBMC的不同亞群中以及在離體單核細胞源性DC中的表達。使用圖IA所示的門控策略(gating strategy), 我們發(fā)現(xiàn)所有的血液DC亞群、骨髓DC KMDC 1)及DC2(MDC2)和類漿細胞DC (PDC)均表達 ⑶74，MDC2表達最高水平的⑶74(圖1B)。⑶74也在單核細胞源性未成熟DC中表達，表達水平比在LPS成熟DC中高得多(圖2A)。與⑶74表達模式一致，hLL 1與血液DC亞群、B 細胞、單核細胞和單核細胞源性未成熟DC高效結(jié)合(圖1C、圖2B)，但不與LPS成熟DC結(jié)合(圖2B、圖2C)。hLLl在這些APC亞群中的結(jié)合效率與其⑶74表達水平密切相關(guān)。這些數(shù)據(jù)提供了通過對接和鎖定技術(shù)使用hLLl為靶載體將抗原體內(nèi)靶向至APC的基礎(chǔ)。
hLLl對⑶74的細胞毒性效應(yīng)-表達惡性B細胞，但對正常DC沒有影響 因為⑶74在未成熟DC中的高度表達，而hLLl與未成熟DC高效結(jié)合，如圖IA和圖IB所示，我們想知道hLLl是否在DC中具有與其在CD74表達B細胞淋巴瘤中相同的細胞毒性，后者在前面示出(Stein等，Blood 2004，104 :3705-11)。為此目的，利用MTS試驗和顯微鏡成像，將hLLl對B細胞惡性腫瘤Daudi細胞和人單核細胞源性DC的細胞活力的影響進行并列對比。結(jié)果表明，在存在GAH(山羊抗人抗體)一用于hLLl交聯(lián)的第二抗體一的情況下，hLLl顯著降低了 Daudi細胞的細胞活力，但沒有降低DC的細胞活力(圖3A)，如上所示，DC通常表達高水平的⑶74。顯微鏡成像顯示，用以GAH交聯(lián)的hLLl處理的Daudi 細胞集結(jié)并濃縮，而DC在相同處理后維持正常的形態(tài)(圖3C、圖3D)。以GAH交聯(lián)的hLLl對Daudi細胞的細胞毒性與Mein等Q004)的早期研究一致，顯示hLLl在離體和體內(nèi)對 B細胞惡性腫瘤是有細胞毒性的。在細胞凋亡試驗中進一步證實了 hLLl加上GAH對DC沒有細胞毒性，該試驗顯示亞二倍體細胞核群不受以GAH交聯(lián)的hLLl的影響(未示出)。
為了進一步證實hLLl對DC沒有細胞毒性，我們使用流式細胞儀進行了細胞凋亡試驗。細胞核從用未成熟DC處理的hLLl獲得，并用PI染色用于流式細胞儀分析。PI+粒子首先被門控，并且首先通排門控出低SSC粒子而排除碎屑。通過測量亞二倍體細胞核群來分析所得門控的細胞核的細胞凋亡(圖2A)。結(jié)果證明hLLl在存在或不存在用于交聯(lián) (GAH,F(ab' )2 GAH IgG Fc γ-特異性)的第二 mAM20 μ g/ml)的情況下對兩個供體中的 DC細胞凋亡沒有影響(圖2B、圖2C)。這些數(shù)據(jù)證明，不像其對B細胞惡性腫瘤的細胞毒性作用那樣，hLLl對同樣表達CD74表面抗原的正常樹枝狀細胞具有很少細胞毒性。
通過hLLl適度增強DC組成性成熟 人IgG可以通過FcR連接與DC相互作用，并且根據(jù)所涉及的FcR的亞型，其可對 DC成熟具有相反作用。作為人化IgG，hLLl不僅可以通過⑶74也可以通過在DC上表達的 FcR與人DC相互作用。為此，我們推測hLLl可以通過與⑶74或FcR或兩者相互作用來影響DC功能。為了研究這種情況，我們測試了在存在hGM-CSF和hIL-4的情況下，hLLl在單核細胞的離體培養(yǎng)期間對DC組成性成熟的作用。
因為DC成熟通常反映在其形態(tài)變化，所以我們也檢查hLLl處理對DC形態(tài)是否具有任何作用。如圖3B所示，在不存在或存在GAH交聯(lián)的情況下，用hLLl以不同劑量處理不同天數(shù)的DC看起來健康完整。hLLl處理的DC顯示出以纖維樣細胞為特征的一些微小的形態(tài)變化，所述變化類似于LPS處理的DC(未示出)，但較不明顯。
因為成熟DC主要在抗原呈遞和共刺激分子表達的上調(diào)、改變的細胞因子產(chǎn)生以及增強的T細胞刺激能力方面不同于未成熟DC，我們隨后研究了 hLLl對DC中的抗原遞呈分子HLA-DR和共刺激分子(⑶M和⑶86)的表達水平是否具有任何作用(圖4)。結(jié)果顯示hLLl可以在0. 05-5ug/ml的hLLl濃度范圍內(nèi)以劑量依賴性方式上調(diào)HLA-DR、⑶討和 CD86 (圖4A)。然而，因為在5 μ g/ml hLLl與Oug/ml相比的情況下，HLA-DR和共刺激分子 (⑶M和⑶86)的表達僅上調(diào)了 10% (圖4B)，所以效果不強烈。在最高濃度(50 μ g/ml) 條件下，HLA-DRjDM和⑶86的表達與在5 μ g/ml hLLl下相比沒有進一步的上調(diào)，而是略有減少(圖4B)。這些結(jié)果表明，盡管不是非常有效，但hLLl可以增強DC的組成性成熟。
hLLl處理的DC對T細胞擴增沒有顯著影響 未成熟DC和成熟DC之間的功能差別在于，成熟DC有較強的刺激T細胞增殖和擴增的能力。因為hLLl可以通過上調(diào)DC中的HLA-DR、⑶討和⑶86的表達來增強組成性成熟(圖4B)，所以我們想確定是否可以通過被DC增強的T細胞擴增來反映這種DC成熟作用。如圖5所示，用0.05至50 μ g/ml hLLl處理的DC不影響DC介導(dǎo)的T細胞擴增，包括總T細胞(⑶4+和⑶4-T細胞)(圖5)。此結(jié)果表明hLLl增強的DC組成性成熟不夠強烈， 不能被轉(zhuǎn)化為增強的T細胞刺激能力。
原態(tài)⑶4+T細胞通過hLLl處理DC向Thl效應(yīng)子細胞的極化 然而，DC具有另一重要功能極化原態(tài)CD4 T細胞，以分化為不同的效應(yīng)子細胞 Thl、Th2、Thl7以及新定義的Thl7-1細胞。Thl細胞對針對細胞內(nèi)病原體和癌癥的細胞免疫是至關(guān)重要的，而Th2細胞的誘導(dǎo)是體液免疫的原因。產(chǎn)生IL-17的Thl7和Thl7-1細
40胞是其它的極化細胞群體，該細胞群體在對某些病原體和自身免疫炎癥的免疫方面具有多種功能。這些效應(yīng)子細胞的極化主要通過DC對DC/T細胞突觸中的T細胞提供的DC分泌的細胞因子(所謂的“信號3”)來介導(dǎo)。CD4+原態(tài)T細胞可以分化為介導(dǎo)不同效應(yīng)子功能的Thl、Th2和ThO細胞，其中Thl效應(yīng)子細胞在維持針對癌癥和傳染病的CTL反應(yīng)方面發(fā)揮重要作用。我們已證明0. 05至50 μ g/ml的hLLl可以以微弱但劑量依賴的方式增強DC 組成性成熟，但用這些濃度的hLLl處理的DC不影響DC介導(dǎo)的T細胞擴增(圖5)。我們隨后關(guān)注hLLl處理的DC是否可以影響⑶4+原態(tài)T細胞的極化。如圖5所示，hLLl處理的 ⑶極化⑶4+原態(tài)T細胞，以向越來越多的Thl效應(yīng)子細胞以及越來越少的Th2和Tnp細胞分化。這些結(jié)果表明DC可以通過hLLl被功能性調(diào)節(jié)。因為Thl在針對腫瘤和傳染病的適應(yīng)性免疫方面發(fā)揮關(guān)鍵作用，hLLl在用于疫苗接種時可以具有輔劑樣活性。
實例9. 74-mCD20的離體特性一通過人PBMC中的74_mCD20誘導(dǎo)hCD20特異性免疫 ⑶20是在B細胞中正常表達的自體抗原，其因免疫耐受性在理論上難以通過疫苗方法靶向。然而，已通過用編碼人⑶20胞外域的小基因(I^lomba等，Clin Cancer Res 2005 ；11 370-9)或包含人CD20胞外域和含QS21輔劑的載體蛋白的綴合物(Roberts 等，Blood2002 ；99 :3748-55)接種而在荷瘤小鼠中實現(xiàn)對⑶20的特異性T細胞免疫反應(yīng)。若干其它報道也證明使用異種抗原來打破免疫耐受性的可行性，如動物模型中(Ding 等，Blood 2008 ；112 :2817-25 ；Soares 等，J Immunol 2001 ； 166 :6555-63)以及在患者中 (Ramanathan 等，Cancer Immunol Immunother 2005 ；54 :254-64)的 MUCl 所示。為了測試 74-mCD20是否可以成功誘導(dǎo)hCD20特異性免疫，并克服CD20的免疫耐受性，進行下面的試驗。
通過在存在hGM-CSF和hIL_4的情況下培養(yǎng)5天，從PBMC中產(chǎn)生人DC。對未成熟 DC加載74-m⑶20，并通過LPS加上IFN- γ而成熟化。成熟DC被用來刺激自體PBMC 10天。 每周兩次進行用相同加載DC的重新刺激。在最后一次重新刺激后，通過在由分選的CD20 陽性MM癌干細胞刺激時測量細胞因子反應(yīng)(IFN-γ)來檢驗T細胞的抗原特異性。T細胞顯示對CD20陽性匪癌干細胞的陽性反應(yīng)，但對對照CD20陰性匪細胞沒有陽性反應(yīng)。
74-mCD20在離體的各種抗原遞呈細胞中的特異性結(jié)合、內(nèi)在化和細胞內(nèi)定位 我們的初步數(shù)據(jù)已顯示hLLl與不同的APC(包括骨髓DCl和骨髓DC2、類漿細胞 DC、B細胞和單核細胞)有效和特異性地結(jié)合。為了證實4-mCD20在與APC結(jié)合方面具有與單獨hLLl相同的效率和特異性，進行了下面的試驗。
使用74-mCD20和對照Ml-mCD20(包含連接于四個mCD20的拷貝的抗MUCl抗體)。 結(jié)合試驗進行如下。簡而言之，按制造商的說明，用ΖΕΝ0ΝΤΜ ALEXA FLU0R. 488人IgG標記試劑盒(INVITR0GEN )標記15 μ g的74_mCD20或Ml_mCD20。書標記的制劑被用來染色人PBMC，如下所述。
在4°C用人FcR阻斷試劑(MiltenyiBiotec, 1 20稀釋)對使用FIC0LL-PAQUETM 從血塊黃層中分離的人PBMC處理10分鐘。洗過的細胞用特異性標記的mAb染色，并通過流式細胞儀(FACSCALIBUR0)分析。用于研究的標記mAb包括FITC-標記的抗⑶74 mAb ； ALEXA FLUOR 488-標記的 74_mCD20 ；ALEXAFLU0R488 標記的 Ml_mCD20 ；PE 綴合的抗 ⑶19 mAb (用于B細胞)；PE綴合的抗⑶14 mAb (用于單核細胞)；和APC綴合的mAb至BDCA-I (用于MDC1)、BDCA_2 (用于PDC)或BDCA-3 (用于MDC2)。門控策略被用于鑒別B細胞、單核細胞、MDC1、MDC2和PDC。數(shù)據(jù)通過FlowJo軟件分析平均熒光強度和表達表面標記物的陽性細胞群。
為了解74_mCD20是否被內(nèi)在化到用以進一步處理成MHC II級呈遞和MHC I級交叉呈遞的內(nèi)涵體，進行下面的試驗。使74-mCD20或Ml_mCD20與人PBMC混合，在4°C下培養(yǎng)1小時，然后進行充分的沖洗。然后將細胞轉(zhuǎn)到37°C，在不同時間點(0、15、30或45分鐘)固定，并在進行或不進行前期透化的情況下用ALEXAFLU0R. 標記的抗人IgG第二抗體染色。通過流式細胞儀確定平均熒光，通過從在不同時間點以固定和透化的細胞(內(nèi)在化且表面結(jié)合)記錄的熒光中減去固定細胞(表面結(jié)合)中的平均熒光來計算內(nèi)在化的抗體量。
結(jié)果顯示74-mCD20DNL復(fù)合體在與APC結(jié)合方面具有與單獨hLLl相同的效率和特異性。
實例10.通過74_mCD20離體誘導(dǎo)h⑶20特異性免疫反應(yīng) 將⑶34+人臍血細胞(HLA Al健康供體)肝內(nèi)注入受輻照的新生 Rag2-/" Y C-/"小鼠以產(chǎn)生用于重組人適應(yīng)性免疫系統(tǒng)(包括人T、B和DC細胞以及構(gòu)建的一級和二級淋巴器官)的動物模型(Huff等，J Clin Oncol. 2008,26 :2895900 Jang和 Chang, Cancer Invest. 2008，26 :741-55)。這些小鼠被稱為 Hu-Rag2_/- y c_/_ 小鼠。
為了評估由74-mCD20誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)，用74_mCD20或Ml_mCD20 (每個小鼠50yg)，結(jié)合或不結(jié)合用于體內(nèi)DC成熟的CpG(每個小鼠50yg)，每周對在 Rag2-/" Y C-/"小鼠中重組的人⑶34+細胞免疫三次。在最后一次免疫之后五天，分離每個動物的脾細胞并用HLA配型MM癌干細胞重新刺激，用于產(chǎn)生細胞因子(INF- y )，通過用流式細胞儀的細胞內(nèi)細胞因子染色進行評估。通過鈣黃綠素AM釋放試驗評估針對MM癌干細胞的特異性細胞毒性，以MM癌干細胞為靶細胞。使用磁珠從MM細胞系RPMI182 中分離⑶20+MM癌干細胞。通過用醛脫氫酶染色來驗證干細胞特性。結(jié)果表明74-mCD20能夠在體內(nèi)誘導(dǎo)抗hcd20特異性免疫反應(yīng)。
實例11. 74-mCD20針對匪癌干細胞的治療潛力通過hPBMC/NOD/SCID小鼠模型或繼承性轉(zhuǎn)移的體內(nèi)評價。
體內(nèi)評價74_mCD20的治療效果的最佳方法是對可以同時支持MM生長以及人適應(yīng)性免疫系統(tǒng)發(fā)育的動物模型進行免疫。因為人⑶34+細胞重組的Rag2-/_ y c-/_小鼠是有免疫能力的，其可能不支持MM生長，使用hPBMC/NOD/SCID小鼠模型檢驗74_mCD20對MM 干細胞的治療效果。N0D/SCID 小鼠已被 Matsui 等(Blood 2004,103 :2332-6 ；Cancer Res 2008,68 :190-7)用于植入克隆源性多發(fā)性骨髓瘤干細胞。
N0D/SCID小鼠也被用于通過腫瘤細胞和hPBMC的共植入評價治療效果。通過仔細地調(diào)節(jié)注入的細胞數(shù)量，這個模型可以同時支持腫瘤生長和hPBMC植入，并已被用于檢驗體內(nèi)疫苗靶向DC-SIGN的效果。
用300cGy 照射四至六周齡雌性 N0D/SCID 小鼠(Jackson Laboratories, Barr Harbor ,Maine)(使用137Cs γ輻照器，別cGy/min)。12-16小時后，經(jīng)由背側(cè)尾部靜脈注射分選的CD20+MM癌干細胞O百萬個)。同時，對小鼠皮下注入人PBMC(3百萬個)、未成熟 DC (30，000)和DNL疫苗的混合物。在某時間點(天)，將小鼠無痛處死，從長骨中收獲骨髓，通過人⑶138+MM細胞染色來確定植入和治療效果。
為了進一步評價74_mCD20的治療潛力，采用通過繼承性轉(zhuǎn)移的替代方法來檢驗疫苗引發(fā)的針對匪干細胞的細胞毒性。人⑶34+細胞重組的Rag2-/_ y c-/_小鼠用 74-mCD20免疫，如上所述。收獲脾細胞并經(jīng)尾靜脈注入植以⑶20+MM癌干細胞的N0D/SCID 小鼠內(nèi)。在某時間點(天)，將小鼠無痛處死，從長骨中收獲骨髓，通過人⑶138+MM細胞染色來確定植入和治療效果。結(jié)果證實74-mCD20能夠在體內(nèi)誘導(dǎo)針對⑶20+MM干細胞的免疫反應(yīng)。
實例12. DDD2-mPAP和DNL疫苗復(fù)合體的產(chǎn)生 根據(jù)實例4的方法由鼠前列腺酸性磷酸酶產(chǎn)生DDD2綴合的PAP異種抗原。前面已公開了基于樹枝狀細胞的通過PAP異種抗原的疫苗接種的效力(Rmg等，J Immunol 2001， 167 :7150-56)。如實例4所述構(gòu)建DDD2_mPAP-pdHL2表達載體，并根據(jù)實例4所述在細胞培養(yǎng)物中表達DDD2-mPAP異種抗原融合蛋白。在NCBI數(shù)據(jù)庫中(Accession No.AAF23171) 公開了例如鼠前列腺酸性磷酸酶序列。如實例4所述，DDD2-mPAP-6His融合蛋白被表達并通過固定化金屬親和色譜法(IMAC)純化。
根據(jù)實例5的方法來制備包含一個CH3-AD2-IgG-hLLl (抗⑶74)的拷貝和四個 DDD2-mPAP的拷貝的DNL構(gòu)建體。hLLl IgG部分包含連接于hLLl IgG的每個重鏈的C末端的AD2序列。通過在含ImM還原谷胱甘肽的PBS中混合hLLl IgG_AD2和DDD2_mPAP來進行DNL反應(yīng)。在次日，加入氧化的谷胱甘肽至2mM的最終濃度，24小時后在蛋白A柱上純化反應(yīng)混合物。兩個DDD2-mPAP的拷貝連接于每個AD2部分，產(chǎn)生包含一個hLLl IgG部分和四個mPAP異種抗原部分的DNL復(fù)合體。
對患有前列腺癌的受試者施用DNL疫苗抗⑶74-mPAP誘導(dǎo)針對表達前列腺癌干細胞的PAP的免疫反應(yīng)。所述免疫反應(yīng)能有效地減少或消除受試者的前列腺癌細胞。
實例13. DDD2-mEGFR和DNL疫苗復(fù)合體的產(chǎn)生 根據(jù)實例4的方法由鼠EGFR產(chǎn)生DDD2綴合的EGFR異種抗原。前面已公開了 EGFR 異種抗原在誘導(dǎo)體液免疫反應(yīng)方面的效力(Fang等，ht J Mol Med 2009，23 :181-88)。 如實例4所述構(gòu)建包含鼠EGFR胞外域的DDD2-mEGFR-pdHL2表達載體，并根據(jù)實例4在細胞培養(yǎng)物中表達DDD2-mEGFR異種抗原融合蛋白。鼠EGFR序列公開在例如NCBI數(shù)據(jù)庫中 (Accession No. AAG43241)。如實例4所述，DDD2_mEGFR-6His融合蛋白被表達并通過固定化金屬親和色譜法(IMAC)純化。
根據(jù)實例5的方法來制備包含一個CH3-AD2-IgG-hLLl (抗CD74)(抗CD74)的拷貝和四個DDD2-mEGF的拷貝的DNL構(gòu)建體。hLLlIgG部分包含連接于hLLl IgG的每個重鏈的 C末端的AD2序列。通過在含ImM還原谷胱甘肽的PBS中混合hLLl IgG_AD2和DDD2_mEGFR 來進行DNL反應(yīng)。在次日，加入氧化的谷胱甘肽至2mM的最終濃度，24小時后在蛋白A柱上純化反應(yīng)混合物。兩個DDD2-mEGFR的拷貝連接于每個AD2部分，產(chǎn)生包含一個hLLl IgG 部分和四個mEGFR異種抗原部分的DNL復(fù)合體。
對帶有表達NSCLC的EGFR的受試者施用DNL疫苗抗⑶74_mEGFR誘導(dǎo)針對表達癌干細胞的EGFR的免疫反應(yīng)。所述免疫反應(yīng)能有效地減少或消除受試者的EGFR陽性癌細胞。
本領(lǐng)域技術(shù)人員會意識到，可以根據(jù)本文所述的技術(shù)構(gòu)建和利用基于DNL的疫苗，所述疫苗結(jié)合了對應(yīng)于各種腫瘤相關(guān)抗原的異種抗原部分。
43 在無需進行過度實驗的情況下，可以根據(jù)本發(fā)明的內(nèi)容制造和使用本文所公開并要求保護的所有組合物和方法。盡管已按照優(yōu)選實施例描述了所述組合物和方法，但是對本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，在沒有背離本發(fā)明的構(gòu)思、實質(zhì)和范圍的情況下，本文所述方法的步驟或步驟順序的變化可應(yīng)用于所述組合物和方法。更具體地說，化學(xué)和生理學(xué)相關(guān)的某些試劑可以代替本文所述的試劑，同時可以達到相同或相似的結(jié)果。對本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，所有這種相似的替換和修改被認為在由所附權(quán)利要求書所限定的本發(fā)明的實質(zhì)、范圍和構(gòu)思內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種DNL (對接和鎖定)抗癌疫苗復(fù)合體，包含a)與樹突狀細胞結(jié)合的抗體部分，其中所述抗體部分連接于DDD(二聚及對接域)部分，其中所述DDD部分具有來自蛋白激酶A的二聚及對接域的肽序列；和b)連接于AD(錨定域)部分的異種抗原部分，其中所述AD部分具有來自AKAP (A激酶錨定蛋白)的錨定域的肽序列；其中所述DDD部分形成二聚體，所述二聚體與所述AD部分結(jié)合以形成所述DNL復(fù)合體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNL復(fù)合體，其中所述抗體部分是抗CD74抗體或其抗原結(jié)合片段。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNL復(fù)合體，其中所述異種抗原選自碳酸酐酶IX、甲胎蛋白、 α -輔肌動蛋白-4、A3、Α33 抗體特異性抗原、ART-4、Β7、Ba 733、BAGE、BrE3-抗原、CAl25、 CAMEL、CAP-I、CASP-8/m、CCCL19、CCCL21、CD1、CDla、CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CDl 1A、CD 14、 CD15、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD29、CD30、CD32b、CD33、CD37、CD38、 CD40、CD40L、CD45、CD46、CD52、CD54, CD55、CD59、CD64、CD66a_e、CD67、CD70、CD74、CD79a、 CD80、CD83、CD95、CD126、CD133、CD138、CD147、CD154、CDC27、CDK_4/m、CDKN2A、結(jié)腸特異性抗原-P(CSAp)、CEA(CEACAM5)、CEACAM6、DAM、EGFR、EGFRvIII、EGP-U EGP-2、ELF2-M、 EpCAM、Flt-U Flt-3、葉酸鹽受體、G250 抗原、GAGE、gplOO、GROB, HLA-DR、HMl. 24、人體絨毛膜促性腺激素(HCG)及其亞單元、HER2/neu、HMGB-l、缺氧誘導(dǎo)因子(HIF-I)、HSP70-2M、 HST-2、la、IGF-1R、IFN- y、IFN- α、IFN- β、IL-2、IL-4R、IL-6R、IL-13R、IL-15R、IL-17R、 IL-18R、IL-6、IL-8、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-25、胰島素生長因子-1 (IGF-I)、KC4 抗原、KS-I 抗原、KS1-4、Le-Y、LDR/FUT、巨噬細胞移動抑制因子(MIF)、MAGE、MAGE-3、 MART-1、MART-2、NY-ESO-l、TRAG-3、mCRP、MCP-1、MIP-1A、MIP-1B、MIF、MUC1、MUC2、MUC3、 MUC4、MUM-1/2, MUM-3、NCA66、NCA95、NCA90、PAM-4 抗體特異性抗原、胎盤生長因子、p53、 前列腺酸性磷酸酶、PSA、PRAME, PSMA、PlGF、ILGF、ILGF-1R、IL-6、IL-25、RS5、RANTES, TlOU SAGE, S100、存活素、存活素 2B、TAC、TAG-72、腱生蛋白、TRAIL 受體、TNF- α、Tn 抗原、 TF(Thomson-Friedenreich)抗原、腫瘤壞死抗原、VEGFR、ED_B 纖連蛋白、WT-1、17-1A 抗原、 補體因子C3、C3a、C3b、C5a、C5、血管生成標記物、bcl_2、bcl_6、Kras, cMET、致癌基因標記物和致癌基因產(chǎn)物。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的DNL復(fù)合體，其中所述異種抗原是CD20。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNL復(fù)合體，進一步包含所述DDD與AD部分之間的二硫鍵。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNL復(fù)合體，其中所述DDD部分包含選自SEQID NO :11和 SEQ ID NO 10的氨基酸序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的DNL復(fù)合體，其中所述DDD部分包含氨基酸序列SEQID NO 11。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNL復(fù)合體，其中所述AD部分包含選自SEQID NO 13, SEQ ID NO :12、SEQ ID NO :19、SEQ ID NO :20、SEQ ID NO :21、SEQ ID NO :22、SEQ ID NO :23、 SEQ ID NO 24,SEQ ID NO 25、SEQ ID NO 26、SEQ ID N0:27 禾口 SEQ ID NO 28 的氨基酸序列。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的DNL復(fù)合體，其中所述AD部分包含氨基酸序列SEQID NO13。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNL復(fù)合體，其中所述抗體部分選自IgG抗體和抗原結(jié)合抗體片段。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的DNL復(fù)合體，其中所述抗體部分是包含輕鏈可變互補決定區(qū)(CDR)序列 CDRl (RSSQSLVHRNGNTYLH ；SEQ ID NO 1)、CDR2 (TVSNRFS ;SEQ ID NO 2) 和 CDR3 (SQSSHVPPT ；SEQ ID NO 3)以及重鏈可變區(qū) CDR 序列 CDRl (NYGVN ；SEQ ID NO 4)、 CDR2 (WINPNTGEPTFDDDi7KG ；SEQ ID NO 5)和 CDR3 (SRGKNEAWFAY ；SEQ ID NO 6)的人化或嵌合LLl抗CD74抗體或其抗原結(jié)合片段。
12.根據(jù)權(quán)利要求4所述的DNL復(fù)合體，其中所述CD20異種抗原部分包含氨基酸序列 SEQ ID NO :7。
13.根據(jù)權(quán)利要求4所述的DNL復(fù)合體，其中連接于DDD部分的抗CD74抗體部分形成第一融合蛋白，連接于AD部分的CD20異種抗原部分形成第二融合蛋白。
14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNL復(fù)合體，其中所述DNL復(fù)合體用于抗癌疫苗，所述抗癌疫苗能夠誘導(dǎo)針對CD138mgCD20+MM干細胞的免疫反應(yīng)。
15.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNL復(fù)合體，其中所述抗體部分與選自⑶209(DC-SIGN)、 CD34、CD74、CD205、TLR 2 (鐸樣受體 2)、TLR 4、TLR 7、TLR 9、BDCA-2、BDCA-3、BDCA-4 和 HLA-DR的抗原結(jié)合。
16.一種DNL抗癌疫苗復(fù)合體，包含c)與樹突狀細胞結(jié)合的抗體部分，其中所述抗體部分連接于AD部分，其中所述AD部分具有來自AKAP (A激酶錨定蛋白)的錨定域的肽序列；和d)連接于DDD部分的異種抗原部分，其中所述DDD部分具有來自蛋白激酶A的二聚及對接域的肽序列；其中所述DDD部分形成二聚體，所述二聚體與所述AD部分結(jié)合以形成所述DNL復(fù)合體。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的DNL復(fù)合體，其中所述抗體部分的每一重鏈在其C末端連接于AD部分，且所述復(fù)合體包含一個抗體部分和四個異種抗原部分。
18.根據(jù)權(quán)利要求16所述的DNL復(fù)合體，其中所述抗體部分與選自⑶209(DC-SIGN)、 CD34、CD74、CD205、TLR 2 (鐸樣受體 2)、TLR 4、TLR 7、TLR 9、BDCA-2、BDCA-3、BDCA-4 和 HLA-DR的抗原結(jié)合。
19.根據(jù)權(quán)利要求16所述的DNL復(fù)合體，其中所述抗體部分與CD74結(jié)合。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的DNL復(fù)合體，其中所述抗體部分是包含輕鏈可變互補決定區(qū)(CDR)序列 CDRl (RSSQSLVHRNGNTYLH ；SEQ ID NO 1)、CDR2 (TVSNRFS ；SEQ ID NO 2) 和 CDR3 (SQSSHVPPT ；SEQ ID NO 3)以及重鏈可變區(qū) CDR 序列 CDRl (NYGVN ；SEQ ID NO 4)、 CDR2 (WINPNTGEPTFDDDi7KG ；SEQ ID NO 5)和 CDR3 (SRGKNEAWFAY ；SEQ ID NO 6)的人化或嵌合LLl抗CD74抗體或其抗原結(jié)合片段。
21.根據(jù)權(quán)利要求16所述的DNL復(fù)合體，其中所述異種抗原選自碳酸酐酶IX、甲胎蛋白、α -輔肌動蛋白-4、Α3、Α33抗體特異性抗原、ART-4、B7、Ba 733、BAGE、BrE3抗原、CA125、 CAMEL、CAP-I、CASP-8/m、CCCL19、CCCL21、CD1、CDla、CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CDl 1A、CD 14、 CD15、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD29、CD30、CD32b、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD45、CD46、CD52、CD54、CD55、CD59、CD64、CD66a_e、CD67、CD70、CD74、CD79a、 CD80、CD83、CD95、CD126、CD133、CD138、CD147、CD154、CDC27、CDK_4/m、CDKN2A、結(jié)腸特異性抗原-P(CSAp)、CEA(CEACAM5)、CEACAM6、DAM、EGFR、EGFRvIII、EGP-U EGP-2、ELF2-M、 Ep-CAM、Flt-1、Flt-3、葉酸鹽受體、G250 抗原、GAGE、gplOO、GROB, HLA-DR、HMl. 24、人體絨毛膜促性腺激素(HCG)及其亞單元、HER2/neu、HMGB-l、缺氧誘導(dǎo)因子(HIF-I)、HSP70-2M、 HST-2、la、IGF-1R、IFN- y、IFN- α、IFN- β、IL-2、IL-4R、IL-6R、IL-13R、IL-15R、IL-17R、 IL-18R、IL-6、IL-8、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-25、胰島素生長因子-1 (IGF-I)、KC4 抗原、KS-I 抗原、KSl-4、Le-Y、LDR/FUT、巨噬細胞移動抑制因子(MIF)、MAGE、MAGE_3、MART-1、 MART-2、NY-ES0-1、TRAG-3、mCRP、MCP-U MIP-1A、MIP-1B、MIF、MUCl、MUC2、MUC3、MUC4、 MUM-l/2、MUM-3、NCA66、NCA95、NCA90、PAM-4抗體特異性抗原、胎盤生長因子、p53、前列腺酸性磷酸酶、PSA、PRAME, PSMA, PlGF, ILGF, ILGF-1R、IL-6、IL-25、RS5、RANTES, TlOl、SAGE、 S100、存活素、存活素-2B、TAC、TAG-72、腱生蛋白、TRAIL受體、TNF-α、Τη抗原、TF抗原、腫瘤壞死抗原、VEGFR、ED-B纖連蛋白、WT-I、17-1Α抗原、補體因子C3、C3a、C3b、Cfe、C5、血管生成標記物、bcl-2、bcl-6、Kras, cMET、致癌基因標記物和致癌基因產(chǎn)物。
22.根據(jù)權(quán)利要求16所述的DNL復(fù)合體，其中所述異種抗原是CD20。
23.一種治療癌癥的方法，包括a)獲得根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗癌疫苗DNL復(fù)合體；以及b)對患有癌癥的受試者施用所述復(fù)合體。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中所述癌癥選自上皮癌、間質(zhì)癌、血液系統(tǒng)癌、神經(jīng)系統(tǒng)癌、癌瘤、黑色素瘤、肉瘤、神經(jīng)母細胞瘤、白血病、淋巴瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤和骨髓瘤。
25.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中所述異種抗原是CD20，且所述抗原部分是抗 CD74抗體或其抗原結(jié)合片段。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中所述癌癥是B細胞癌。
27.根據(jù)權(quán)利要求沈所述的方法，其中所述癌癥選自B細胞淋巴瘤、B細胞白血病、急性淋巴細胞白血病、慢性淋巴細胞白血病、濾泡性淋巴瘤、外套細胞淋巴瘤、小淋巴細胞性淋巴瘤、彌漫性B細胞淋巴瘤、邊緣區(qū)淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤、伯基特淋巴瘤、何杰金氏淋巴瘤和非何杰金氏淋巴瘤。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述癌癥是多發(fā)性骨髓瘤。
29.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，進一步包括對所述受試者施用一種或多種治療劑。
30.根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其中在施用所述抗癌疫苗DNL復(fù)合體之前或同時對所述受試者施用所述治療劑。
31.根據(jù)權(quán)利要求四所述的方法，其中所述治療劑連接于所述抗癌疫苗DNL復(fù)合體。
32.根據(jù)權(quán)利要求四所述的方法，其中所述治療劑選自放射性核素、免疫調(diào)節(jié)劑、抗血管生成劑、細胞因子、趨化因子、生長因子、激素、藥物、前體藥物、酶、寡核苷酸、siRNA、促凋亡劑、光敏治療劑、細胞毒素劑、化學(xué)治療劑、毒素、其它抗體及其抗原結(jié)合片段。
33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中所述藥物選自氮芥、乙撐亞胺衍生物、烷基磺酸鹽、亞硝基脲、吉西他濱、三氮烯、葉酸類似物、蒽環(huán)霉素、紫杉烷、C0X-2抑制劑、嘧啶類似物、嘌呤類似物、抗生素、酶抑制劑、表鬼白毒素、鉬配位絡(luò)合物、長春花生物堿、取代脲、甲基胼衍生物、腎上腺皮質(zhì)抑制劑、激素拮抗劑、內(nèi)皮他丁、紫杉酚、喜樹堿、SN-38、阿霉素及其類似物、抗代謝物、烷化劑、抗有絲分裂物質(zhì)、抗血管生成劑、酪氨酸激酶抑制劑、mTOR抑制劑、熱休克蛋白(HSP90)抑制劑、蛋白酶體抑制劑、HDAC抑制劑、促凋亡劑、甲氨蝶呤和 CPT-I1。
34.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中所述毒素選自篦麻毒素、相思豆毒素、α毒素、 皂草素、核糖核酸酶(RNA酶)、DNA酶I、葡萄球菌腸毒素Α、商陸抗病毒蛋白、白樹毒素、白喉毒素、假單胞菌外毒素和假單胞菌內(nèi)毒素。
35.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中所述放射性核素選自llUn、177Lu、212Bi、 213Bi、211At、62Cu、67Cu、90Y、125I、131I、32P、33P、47Sc、lllAg、67Ga、142Pr、153Sm、 161Tb、152Dy、166Dy、161Ho、I66H0、186Re、188Re、189Re、212Pb、223Ra、225Ac、59Fe、75Se、 77As、89Sr、99Mo、105Rh、109Pd、143Pr、149Pm、169Er、194Ir、198Au、199Au、211Pb、58Co、 80mBr、99mTc、103mRh、109Pt、119Sb、189m0s、192Ir、219Rn、215Po、221Fr、217At、255Fm、 11C、13N、150、75Br、224Ac、1261、1331、77Br、113mIn、95Ru、97Ru5、103Ru、105Ru、107Hg、 203Hg、121mTe、122mTe、125mTe、165Tm、167Tm、168Tm、197Pt、143Pr、57Co、51Cr、75Se、 201Tl、76Br 和 169%。
36.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中所述酶選自蘋果酸脫氫酶、葡萄球菌核酸酶、 δ -V型類固醇異構(gòu)酶、酵母乙醇脫氫酶、α -磷酸甘油脫氫酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶、辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β -半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、過氧化氫酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、葡糖淀粉酶和乙酰膽堿酯酶。
37.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中所述免疫調(diào)節(jié)劑選自細胞因子、干細胞生長因子、淋巴毒素、成血因子、集落刺激因子(CSF)、白介素(IL)、干擾素(IFN)、干細胞生長因子、促紅細胞生成素、促血小板生成素、腫瘤壞死因子(TNF)、粒細胞集落刺激因子 (G-CSF)、粒-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、干擾素-α、干擾素-β、干擾素-、和被稱為“Si因子”的干細胞生長因子。
38.根據(jù)權(quán)利要求37所述的方法，其中所述細胞因子選自人生長激素、N-蛋氨酰人生長激素、牛生長激素、甲狀旁腺激素、甲狀腺素、胰島素、胰島素原、松弛素、松弛素原、糖蛋白 促卵泡素(FSH)、促甲狀腺素(TSH)、黃體化激素(LH)、胎盤生長因子(PlGF)、肝細胞生長因子、前列腺素、成纖維細胞生長因子、催乳素、胎盤泌乳素、OB蛋白、腫瘤壞死因子-α、腫瘤壞死因子-β、繆勒氏管抑制物質(zhì)、小鼠促性腺激素相關(guān)肽、抑制素、激活素、血管內(nèi)皮生長因子、整聯(lián)蛋白、促血小板生成素(TPO)、NGF-β、血小板生長因子、TGF-α、TGF-β、胰島素樣生長因子-I、胰島素樣生長因子-II、促紅細胞生成素(EPO)、骨誘導(dǎo)因子、干擾素-α、 干擾素-β、干擾素-Y、巨噬細胞-CSF(M-CSF)、IL-I、IL-I α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、 IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-IU IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、 IL-21、11^-25、1^正、卩1^-3、厄洛替尼、血小板反應(yīng)蛋白、內(nèi)皮他丁3咿-0和LT。
39.根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，進一步包括誘導(dǎo)針對⑶138neg⑶20+MM干細胞的免疫反應(yīng)。
40.根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，進一步包括誘導(dǎo)⑶138neg⑶20+MM干細胞的細胞凋亡。
41.根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中所述能有效地抑制或消除MM干細胞。
42.一種治療癌癥的方法，包括a)獲得根據(jù)權(quán)利要求16所述的抗癌疫苗DNL復(fù)合體；以及b)對患有癌癥的受試者施用所述復(fù)合體。
全文摘要
本發(fā)明涉及采用對接和鎖定技術(shù)形成抗癌疫苗DNL復(fù)合體的方法和組合物。在優(yōu)選的實施例中，抗癌疫苗DNL復(fù)合體包含與樹突狀細胞結(jié)合的抗體部分，如抗CD74抗體或其抗原結(jié)合片段，其連接于AD(錨定域)部分；和連接于DDD(二聚及對接域)部分的異種抗原，如CD20，其中兩個DDD部分的拷貝形成與AD部分結(jié)合的二聚體，導(dǎo)致形成DNL復(fù)合體。該抗癌疫苗DNL復(fù)合體能夠誘導(dǎo)針對表達異種抗原的癌細胞(如CD138negCD20+MM干細胞)的免疫反應(yīng)，并且誘導(dǎo)癌細胞的細胞凋亡以及抑制其生長或?qū)⑵湎?。用于癌癥治療的對接和鎖定(DNL)疫苗。
文檔編號A61K39/00GK102186499SQ200980141590
公開日2011年9月14日 申請日期2009年8月20日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月20日
發(fā)明者C-H·張, D·M·古德伯格 申請人:Ibc醫(yī)藥公司