一種用于預(yù)防和/或治療HIV的CRISPR-Cas9系統(tǒng)及其制備方法和用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因治療藥物領(lǐng)域，特別涉及HIV的基因治療領(lǐng)域，尤其涉及一種用 于預(yù)防和/或治療HIV的CRISPR-Cas9系統(tǒng)及其制備方法和用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 人類免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus或HIV)屬逆轉(zhuǎn)錄病毒，是一 種感染人類免疫系統(tǒng)細(xì)胞的慢病毒，能造成人類免疫系統(tǒng)缺陷，使人體失去抵抗力，易產(chǎn)生 各種疾病甚至癌癥。其導(dǎo)致的疾病一一艾滋病至今無(wú)有效療法，具有致命性。
[0003] 預(yù)防傳染病的常規(guī)手段是人為干預(yù)和疫苗，人為干預(yù)（如避孕套等）無(wú)法真正意 義上消除HIV，僅作為限制HIV的一種物理性強(qiáng)制手段；而相關(guān)疫苗雖然經(jīng)歷了三十多年的 探索和開(kāi)發(fā)，至今尚未有成熟的產(chǎn)品問(wèn)世。因此，現(xiàn)行的HIV主要療法為高效聯(lián)合抗逆轉(zhuǎn)錄 病毒法，但其同樣只能延緩HIV的發(fā)展。與以上療法不同的是，基因治療一直被視為HIV治 療的最理想模式；因其理論上可以達(dá)到預(yù)防和消除HIV的效果。
[0004] 近年來(lái)，CRISPR-Cas9技術(shù)因其高效性和簡(jiǎn)便性被迅速推廣和應(yīng)用。它是細(xì)菌和 古細(xì)菌在長(zhǎng)期演化過(guò)程中形成的一種適應(yīng)性免疫防御系統(tǒng)，可用來(lái)對(duì)抗入侵的病毒及外源 DNA。CRISPR-Cas9系統(tǒng)通過(guò)將入侵噬菌體和質(zhì)粒DNA的片段整合到CRISPR，并利用相應(yīng)的 CRISPR RNAs(SgRNAs)來(lái)指導(dǎo)同源序列的降解。該系統(tǒng)的主要組成部分為：（I)SgRNA序列， 負(fù)責(zé)革G向特異性基因位點(diǎn)；（2) Cas9酶，負(fù)責(zé)對(duì)祀向位點(diǎn)的DNA進(jìn)行修飾切割。目前，這一 技術(shù)主要應(yīng)用于基因修飾動(dòng)物模型的構(gòu)建，而將其開(kāi)發(fā)為HIV預(yù)防性或治療性的藥物則很 少被涉及。在公開(kāi)發(fā)表的論文"RNA-directed Gene Editing Specifically Eradicates Latent and Prevents New HIV-lInfection"中，劉文輝等根據(jù)HIV基因的兩個(gè)片段序列構(gòu) 建了一個(gè)長(zhǎng)度為20bp的SgRNA，其能靶向位于HIV序列5' LTR的HIV-1U3位點(diǎn)；由于位點(diǎn) 單一等原因，該系統(tǒng)僅能說(shuō)明其對(duì)于HIV的抑制具有關(guān)聯(lián)性，但抑制的效果十分有限。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種用于預(yù)防和/或治療HIV的CRISPR_Cas9系統(tǒng)及其制 備方法和用途。
[0006] 為達(dá)到以上目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
[0007] 第一方面，本發(fā)明提供一種用于預(yù)防和/或治療HIV的CRISPR_Cas9系統(tǒng)，其包括 特異性靶向HIV基因組上的特定基因位點(diǎn)的SgRNA，所述HIV基因組上的特定基因位點(diǎn)選自 Gag、Env、Pol、Tat、Nef、Vif、Vpr、Vpu、5' LTR、3' LTR 和 Rev。
[0008] 優(yōu)選地，所述HI V基因組上的特定基因位點(diǎn)包括Gag、Env、Po I、Tat、Nef、Vi f、Vpr、 Vpu、5' LTR、3' LTR 和 Rev。
[0009] 優(yōu)選地，特異性靶向每個(gè)基因位點(diǎn)的sgRNA為1條以上，例如可以是1條、2條、3 條、4條、5條、6條、7條、8條、9條、10條或11條，進(jìn)一步優(yōu)選為4條。
[0010] 進(jìn)一步優(yōu)選地，每條sgRNA的長(zhǎng)度為16_22bp，例如可以是16bp、17bp、18bp、19bp、 20bp、21bp 或 22bp。
[0011] 優(yōu)選地，所述CRISPR-Cas9系統(tǒng)還包括Cas9。
[0012] 優(yōu)選地，所述Cas9和所述特異性靶向HIV基因組上的特定基因位點(diǎn)的sgRNA分別 存在于質(zhì)粒中。
[0013] 第二方面，本發(fā)明提供第一方面所述藥物的制備方法，PCR擴(kuò)增所用引物選 自 Cas9-5' LTR-I 引物對(duì)、Cas9-5' LTR-2 引物對(duì)、Cas9-5' LTR-3 引物對(duì)、Cas9-5' LTR-4 引物對(duì)、Cas9-Pol-l 引物對(duì)、Cas9-Pol-2 引物對(duì)、Cas9-Pol-3 引物對(duì)、Cas9-Pol-4 引 物對(duì)、Cas9-vif-l 引物對(duì)、Cas9-vif-2 引物對(duì)、Cas9-vif-3 引物對(duì)、Cas9-vif-4 引物 對(duì)、Cas9_vpr_l 引物對(duì)、Cas9_vpr_2 引物對(duì)、Cas9_vpr_3 引物對(duì)、Cas9_tat_l 引物 對(duì)、Cas9-tat_2 引物對(duì)、Cas9-tat_3 引物對(duì)、Cas9-tat_4 引物對(duì)、Cas9-rev2_l 引物 對(duì)、Cas9-rev2_2 引物對(duì)、Cas9-rev2_3 引物對(duì)、Cas9-vpu_l 引物對(duì)、Cas9-vpu_2 引物 對(duì)、Cas9_env_l 引物對(duì)、Cas9_env_2 引物對(duì)、Cas9_env_3 引物對(duì)、Cas9_env_4 引物 對(duì)、Cas9-nef_l 引物對(duì)、Cas9-nef_2 引物對(duì)、Cas9-nef_3 引物對(duì)、Cas9-nef_4 引物對(duì)、 Cas9-3' LTR-I 引物對(duì)、Cas9-3' LTR-2 引物對(duì)、Cas9-3' LTR-3 引物對(duì)、Cas9-Gag-1 引物對(duì)、 Cas9-Gag_2 引物對(duì)、Cas9-Gag_3 引物對(duì)和 Cas9-Gag_4 引物對(duì)；
[0014] 所述引物對(duì)的序列按5'-3'方向如下：
[0015] Cas9_5, LTR-I 引物對(duì)：
[0016] gacaagatatccttggtttt，和 CAAGGATATCTTGTCcggtg ;
[0017] Cas9_5' LTR-2 引物對(duì)：
[0018] cctatgagcctgcagtttt，和 TGCAGGCTCATAGGcggtg ;
[0019] Cas9_5' LTR-3 引物對(duì)：
[0020] gctttttgcctgtagtttt，和 TACAGGCAAAAAGCcggtg ;
[0021] Cas9_5' LTR-4 引物對(duì)：
[0022] gacccttttagtcagtggtttt，和 CACTGACTAAAAGGGTCcggtg ;
[0023] Cas9-Pol_l 引物對(duì)：
[0024] aataccacatcccgcagtttt，和 TGCGGGATGTGGTATTCcggtg ;
[0025] Cas9-Pol_2 引物對(duì)：
[0026] ccacagggatggaagtttt，和 TTCCATCCCTGTGGcggtg ;
[0027] Cas9-Pol_3 引物對(duì)：
[0028] gtcagatttatgcgtttt，和 GCATAAATCTGACcggtg ;
[0029] Cas9-Pol_4 引物對(duì)：
[0030] cctggattcctgaatgtttt，和 ATTCAGGAATCCAGGcggtg ;
[0031] Cas9-vif_l 引物對(duì)：
[0032] tcagaagtacacatcccag，和 GATGTGTACTTCTGAcggtg ;
[0033] Cas9-vif_2 引物對(duì)：
[0034] acatattggggtctgcatacgtttt，和 CAGACCCCAATATGTcggtg ;
[0035] Cas9-vif_3 引物對(duì)：
[0036] gccagggagtctccatagaagtttt，和 TTCTATGGAGACTCCcggtg ;
[0037] Cas9-vif_4 引物對(duì)：
[0038] gatctctacaatactgtttt，和 AGTATTGTAGAGATCcggtg ;
[0039] Cas9-vpr_l 引物對(duì)：
[0040] atggctccatagcttgtttt，和 AAGCTATGGAGCCATcggtg ;
[0041] Cas9-vpr_2 引物對(duì)：
[0042] ggagatacttggacgtttt，和 GTCCAAGTATCTCCcggtg ;
[0043] Cas9-vpr_3 引物對(duì)：
[0044] tgccaacatagcagaatgtttt，和 ATTCTGCTATGTTGGCAcggtg ;
[0045] Cas9-tat_l 引物對(duì)：
[0046] agccctggaagcatccgtttt，和 GGATGCTTCCAGGGCTcggtg ;
[0047] Cas9-tat_2 引物對(duì)：
[0048] ccaggaagtcagcctgtttt，和 AGGCTGACTTCCTGGcggtg ;
[0049] Cas9-tat_3 引物對(duì)：
[0050] atggcaggaagaaggtttt，和 CTTCTTCCTGCCATAcggtg ;
[0051] Cas9_tat_4 引物對(duì)：
[0052] cgaaggaatcgaagagtttt，和 TCTTCGATTCCTTCGcggtg ;
[0053] Cas9_rev2_l 引物對(duì)：
[0054] tcttagcactgttctgtttt，和 AGAACAGTGCTAAGAcggtg ;
[0055] Cas9_rev2_2 引物對(duì)：
[0056] acttactcttgattgtagcggtttt，和 ACAATCAAGAGTAAGTcggtg ;
[0057] Cas9_rev2_3 引物對(duì)：
[0058] ggtgggaagtcctcatgtttt，和 ATATTTGAGGACTTCCCACCcggtg ;
[0059] Cas9_vpu_l 引物對(duì)：
[0060] caataatagcaatagttatagtttt，和 TATAACTATTGCTATTATTGcggtg ;
[0061] Cas9_vpu_2 引物對(duì)：
[0062] ccatagtattaataaaatatgtttt，和 ATATTTTATTAATACTATGGcggtg ;
[0063] Cas9_env_l 引物對(duì)：
[0064] catggtagaccagatgcatggtttt，和 CATGCATCTGGTCTACCATGcggtg ;
[0065] Cas9_env_2 引物對(duì)：
[0066] tgctctttcaatatcaccacgtttt，和 GTGGTGATATTGAAAGAGCAcggtg ;
[0067] Cas9_env_3 引物對(duì)：
[0068] gtctagcagaagaaggtttt，和 CTTCTTCTGCTAGACcggtg ;
[0069] Cas9_env_4 引物對(duì)：
[0070] ctgctattaacaagagagtttt，和 TCTCTTGTTAATAGCAGcggtg ;
[0071] Cas9-nef_l 引物對(duì)：
[0072] aatgggatggcctgctgtaagtttt，和 TTACAGCAGGCCATCCCATTcggtg ;
[0073] Cas9-nef_2 引物對(duì)：
[0074] gagctgagccagcagcagatgtttt，和 ATCTGCTGCTGGCTCAGCTCcggtg ;
[0075] Cas9-nef_3 引物對(duì)：
[0076] gggagcagcatctagagaccgtttt，和 GGTCTCTAGATGCTGCTCCCcggtg ;
[0077] Cas9-nef_4 引物對(duì)：
[0078] tgcctggctagaagcacaaggtttt，和 CTTGTGCTTCTAGCCAGGCAcggtg ;
[0079] Cas9_3, LTR-I 引物對(duì)：
[0080] gatttccactgacctttggagtttt，和 TCCAAAGGTCAGTGGAAATCcggtg ;
[0081] Cas9_3, LTR-2 引物對(duì)：
[0082] cggagaaagaagtgttagtggtttt，和 CACTAACACTTCTTTCTCCGcggtg ;
[0083] Cas9_3, LTR-3 引物對(duì)：
[0084] ctttccgctggggactttccgtttt，和 GGAAAGTCCCCAGCGGAAAGcggtg ;
[0085] Cas9-Gag_l 引物對(duì)：
[0086] gtcagtattaagtgcgtttt，和 GCACTTAATACTGACcggtg ;
[0087] Cas9-Gag_2 引物對(duì)：
[0088] cacaggaaaaggcagccgtttt，和 GGCTGCCTTTTCCTGTGcggtg ;
[0089] Cas9-Gag_3 引物對(duì)：
[0090] gaacgatttgcagtcaagtttt，和 TTGACTGCAAATCGTTCcggtg ;
[0