專利名稱：能在心臟中組織特異性表達(dá)的重組腺病毒的制作方法
本申請(qǐng)申明享有于1998年9月11日登記的美國(guó)專利臨時(shí)申請(qǐng)No.60/098,960的優(yōu)先權(quán)，本文將其全部引入作為參考。
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明主要涉及一種重組腺病毒載體構(gòu)建物，和研究心臟病基因治療和基因功能的方法，更具體地說(shuō)通過(guò)采用人腺病毒相關(guān)病毒的反向末端重復(fù)序列，在心臟組織中靶向特異性表達(dá)某給定的轉(zhuǎn)基因的方法。
背景信息心血管基因治療代表一種治療遺傳性和后天性心臟病的新型方法。將基因轉(zhuǎn)移給心臟，能替代有缺陷的或缺失的擔(dān)負(fù)適當(dāng)心臟功能的細(xì)胞蛋白。體內(nèi)心臟功能的控制表現(xiàn)為多個(gè)基因、各種類型細(xì)胞和環(huán)境刺激之間的復(fù)雜相互作用，但這種相互作用的闡明仍然取決于對(duì)分子和細(xì)胞水平變化的更全面了解。通常，大多數(shù)人基因治療方案是通過(guò)將逆轉(zhuǎn)錄病毒載體引入患部細(xì)胞或組織，而依靠治療基因的活體內(nèi)(ex vivo)應(yīng)用。因?yàn)榛蛑委煹幕铙w內(nèi)方法有賴于將靶細(xì)胞移出體內(nèi)并再引入，對(duì)不能接近的或敏感的器官或組織這構(gòu)成了主要困難。故直接體內(nèi)將治療基因送遞給靶細(xì)胞的其他方法可能將是一種基因治療的優(yōu)選方法。
在體細(xì)胞組織中靶向表達(dá)基因是基因治療和基因功能體內(nèi)分析所必須的，主要通過(guò)采用安全有效的治療基因送遞系統(tǒng)，來(lái)替代損傷的基因。至今，已用重組腺病毒來(lái)替代逆轉(zhuǎn)錄病毒，作為各種細(xì)胞類型和組織的有效基因送遞載體(Yeh等人，F(xiàn)ASEB J 11,615-23,1997)。腺病毒載體在非分裂性人細(xì)胞的遺傳修飾中高度有效，而且具有攜帶長(zhǎng)遺傳信息片段的能力。將腺病毒用作基因“送遞系統(tǒng)”的障礙是，當(dāng)將腺病毒給予患者以幫助將基因送遞給特定的細(xì)胞時(shí)，患者的免疫系統(tǒng)可能對(duì)該病毒作出反應(yīng)。為了克服這種障礙，已作了修飾使腺病毒對(duì)細(xì)胞更安全、毒性更小，且刺激免疫應(yīng)答的可能性更小。這包括除去腺病毒的E1區(qū)域，從而防止腺病毒表達(dá)制造病毒顆粒所需的自身蛋白質(zhì)。在原E1區(qū)域插入治療性轉(zhuǎn)基因。這種外源基因的送遞和隨后的表達(dá)效率可以很高，因?yàn)樗ǔ２粫?huì)整合到宿主基因組中，且對(duì)固有的宿主細(xì)胞功能作用極小(Baldwin等人，Gene Ther.4,1142-49,1997)。然而，雖然腺病毒載體能夠產(chǎn)生高水平的轉(zhuǎn)基因表達(dá)，但它們?cè)诖罅考?xì)胞和組織(包括肝和肺)中感染和推進(jìn)轉(zhuǎn)基因表達(dá)的能力有限。作為高水平瞬時(shí)感染的結(jié)果，已采用一些方法來(lái)指導(dǎo)在特定組織或身體部位的轉(zhuǎn)基因表達(dá)。對(duì)于心臟組織而言，已報(bào)道作了許多嘗試，通過(guò)心肌內(nèi)或冠狀動(dòng)脈內(nèi)注射，用重組腺病毒實(shí)現(xiàn)在心臟中表達(dá)轉(zhuǎn)基因(Brody等人，Ann.N.Y.Acad.Sci.716,90-101,1994；Barr等人，Gene Ther.1,51-8,1994；Kypson等人，J.Thorac.Cardiovasc.Surg.115,623-30,1998)。直接將病毒顆粒注射入心肌或心腔，已顯示能更有效地將基因送遞到心肌，但在非心肌細(xì)胞中也有感染和轉(zhuǎn)基因表達(dá)，引起了這樣的一種思考，即已實(shí)現(xiàn)的任何特異性轉(zhuǎn)基因的表達(dá)是由靶向送遞實(shí)現(xiàn)的，而不是由限制性轉(zhuǎn)錄實(shí)現(xiàn)的(Kass等人，Gene Ther.1,395-402,1994；Kass等人，Methods Cell Bio.52,423-37,1997)。結(jié)果，異位表達(dá)(尤其是在肝和其它組織的異位表達(dá))，對(duì)于普遍采用重組腺病毒將基因轉(zhuǎn)移到在心血管系統(tǒng)和其它器官系統(tǒng)中的特定細(xì)胞類型來(lái)說(shuō)，依然有明顯限制。
在大部分重組腺病毒載體中，缺失了編碼具有轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)性能的蛋白質(zhì)的基因組E1區(qū)域，而用小基因“彈夾”替代，它通常包括一選擇的啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)基因編碼區(qū)域和聚腺苷酸化信號(hào)(Yeh等人，F(xiàn)ASEB J11,615-23,1997)。用腺病毒實(shí)現(xiàn)組織特異性轉(zhuǎn)基因表達(dá)的一個(gè)可能方法，是采用在轉(zhuǎn)錄水平具有細(xì)胞類型特異性的細(xì)胞基因啟動(dòng)子，而不是通常所用的表達(dá)水平高但缺少組織特異性的病毒基因啟動(dòng)子。過(guò)去，大量的研究使用不同的細(xì)胞啟動(dòng)子來(lái)實(shí)現(xiàn)在以下各種組織中的靶向轉(zhuǎn)基因的表達(dá)平滑肌(Kim等人，J.Clin.Invest.100,1006-14,1997)、胰腺(Dusetti等人，J.Biol.Chem.272,5800-4,1997)、內(nèi)皮(Morishita等人，J.Biol.Chem.270,27948-53,1995)、肺(Strayer等人，Am.J.Respir.Cell Mol.Bio.18,1-11,1998)和若干類型的腫瘤(Su等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA94,13891-6,1997；Sider等人，Cancer Res.56,5638-46,1996)。在腺病毒的前后序列用心臟特異性啟動(dòng)子，如肌球蛋白輕鏈-2(MLC-2v)和α-肌球蛋白重鏈(α-MHA)啟動(dòng)子所作的類似嘗試，沒(méi)能完全成功地在體內(nèi)提供組織限制性基因表達(dá)(Kim等人，J.Clin.Invest.100,1006-14,1997)。這些結(jié)果表明在缺失的Ela區(qū)域周圍的腺病毒基因組序列可能對(duì)相鄰的細(xì)胞啟動(dòng)子至少有部分特異性作用。也有人提出Ela區(qū)域周圍的序列可能含有負(fù)調(diào)節(jié)元件，它對(duì)細(xì)胞啟動(dòng)子的特異性和活性有影響(Shi等人，Hum.Ther.8,403-10,1997)。腺病毒載體這種不理想的特性使它們的應(yīng)用受限，尤其是在需要轉(zhuǎn)基因的組織特異性表達(dá)的體內(nèi)研究中。
因此，仍然需要一種采用重組腺病毒載體的轉(zhuǎn)基因表達(dá)系統(tǒng)，此系統(tǒng)對(duì)用于體外和體內(nèi)基因治療和成人和新生兒的基因功能分析具有組織特異性。本發(fā)明滿足了這種需要并且還提供了相關(guān)的優(yōu)點(diǎn)。
發(fā)明概述本發(fā)明提供一種人5型重組腺病毒載體，利用心肌細(xì)胞限制性心錨蛋白重復(fù)蛋白(CARP)啟動(dòng)子與人腺病毒相關(guān)病毒(AAV)的反向末端序列(ITR)的協(xié)同，在成人和新生兒中實(shí)現(xiàn)心臟限制性轉(zhuǎn)錄。這種聯(lián)合能有效地在體外和體內(nèi)實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因的心臟組織特異性轉(zhuǎn)錄。
本發(fā)明還提供在新生兒和成人的心臟組織中，實(shí)現(xiàn)對(duì)給定的轉(zhuǎn)基因的組織靶向表達(dá)的方法。這種方法在遺傳和后天性心臟病的基因研究和基因治療中可能有明顯的應(yīng)用。
附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示了重組腺病毒載體的構(gòu)建。所有重組腺病毒載體都是通過(guò)在293細(xì)胞中pJM17質(zhì)粒DNA和特異性穿梭質(zhì)粒DNA之間的同源重組產(chǎn)生的。
圖2顯示了腺病毒感染后，培育的細(xì)胞中GFP的相關(guān)細(xì)胞類型特異性轉(zhuǎn)錄的Northern印跡分析。用GFP編碼序列為探針，并以GAPDH mRNA雜交信號(hào)為標(biāo)準(zhǔn)，用Northern印跡分析了未感染的、對(duì)照的和感染的心肌細(xì)胞的RNA。
圖3顯示了腺病毒感染后，培育的細(xì)胞中GFP的相關(guān)細(xì)胞類型特異性轉(zhuǎn)錄的Northern印跡分析。用NotⅠ和XhoⅠ限制性內(nèi)切酶消化對(duì)照和感染細(xì)胞的DNA，檢測(cè)到約3.0kb大小的Adv/CMV/GFP，和760堿基的Adv/CG/ITR的GFP表達(dá)。
圖4顯示了心內(nèi)注射腺病毒載體后，用Northern印跡分析了小鼠心臟和肝中GFP轉(zhuǎn)錄的水平。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供一種通過(guò)采用重組腺病毒基因送遞載體，而實(shí)現(xiàn)在新生兒的和成熟的心臟組織中轉(zhuǎn)基因的心臟限制性轉(zhuǎn)錄的方法，此載體經(jīng)基因工程改造而含有心肌細(xì)胞-限制性CARP啟動(dòng)子，并連接有人腺病毒相關(guān)病毒的反向末端重復(fù)序列(該序列本文納入作為參考)。在構(gòu)建腺病毒載體中，最常見(jiàn)的是除去血清5型腺病毒基因的Ela和Elb區(qū)域，以防止腺病毒DNA的復(fù)制。通過(guò)將所需的外源遺傳信息，包括左側(cè)反向末端重復(fù)序列(ITR)、信號(hào)增強(qiáng)子、表達(dá)所需外源基因的啟動(dòng)子和聚腺苷酸化信號(hào)，插入到腺病毒的前體E1位置來(lái)構(gòu)建原型載體。Fu等人(Nat.Biotechnol.16,253-7,1998)已報(bào)道了該反向末端重復(fù)(ITR)序列(腺病毒相關(guān)病毒特有)的異常特性，本文將其納入作為參考。腺病毒相關(guān)病毒是從復(fù)制缺陷性細(xì)小病毒衍生出的衛(wèi)星病毒，常常發(fā)現(xiàn)它與腺病毒和單純皰疹病毒相伴。野生型AAV是不致病的，但可特異性整合入宿主的基因組、可轉(zhuǎn)導(dǎo)非分裂性細(xì)胞，不誘導(dǎo)可破壞轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的免疫應(yīng)答。Fu等人已顯示用病毒基因啟動(dòng)子或組織特異性細(xì)胞基因啟動(dòng)子，將AAV-ITR序列的左側(cè)和右側(cè)末端片段都包括入非洲爪蟾屬(Xenopus)發(fā)育的胚胎中，可賦予提高轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平和組織特異性的能力。另外，Philip等人(Mol.Cell Bio.14,2411-8,1994)已證明將右側(cè)和左側(cè)末端AAV-ITR序列包含到哺乳動(dòng)物質(zhì)粒構(gòu)建物中，將提高轉(zhuǎn)基因表達(dá)的效率和穩(wěn)定性。當(dāng)用心臟限制性啟動(dòng)子時(shí)，將腺病毒相關(guān)病毒左側(cè)和右側(cè)末端ITR序列包含入一重組腺病毒載體，能提高外源轉(zhuǎn)基因表達(dá)的組織特異性。
為了在心臟組織中實(shí)現(xiàn)靶向基因的表達(dá)，選擇CARP基因的213堿基對(duì)5’側(cè)翼啟動(dòng)子片段來(lái)指導(dǎo)轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。產(chǎn)生了三種轉(zhuǎn)基因小鼠品系，它們包含各種CARP啟動(dòng)子/β-半乳糖苷酶報(bào)告基因，用于研究這種5’側(cè)翼CARP啟動(dòng)子。CARP(心錨蛋白重復(fù)蛋白)是同源框基因NKx2-5途徑中推定的下游調(diào)節(jié)基因，它調(diào)節(jié)心室肌球蛋白輕鏈-2(MLC-2)基因的表達(dá)(Zou等人，Development 124,793-804,1997)。該研究鑒定了鄰近CARP基因上游調(diào)節(jié)區(qū)域中一個(gè)基本的GATA-4結(jié)合位點(diǎn)，和Nkx2.5與GATA-4介導(dǎo)的協(xié)同轉(zhuǎn)錄調(diào)控。這種協(xié)同調(diào)控依賴于GATA-4結(jié)合于啟動(dòng)子中它的相應(yīng)DNA序列，這提示Nkx2.5可能對(duì)CARP啟動(dòng)子有控制作用，至少部分通過(guò)GATA-4。如本文所用術(shù)語(yǔ)“同源框基因Nkx2.5”指果蠅基因tinman的鼠同源物，已證明它是哺乳動(dòng)物心臟發(fā)育中心管成環(huán)形成和心室特異性肌球蛋白輕鏈-2表達(dá)所需要的。心室肌球蛋白輕鏈-2(MLC-2v)，一種哺乳動(dòng)物心臟發(fā)生過(guò)程中心室分區(qū)的最早標(biāo)記，已是各種尋求鑒定指導(dǎo)心室分區(qū)、發(fā)育成熟和形態(tài)發(fā)生的分子途徑的研究對(duì)象。這些研究已鑒定了MLC-2v啟動(dòng)子區(qū)域中28個(gè)堿基對(duì)的HF-1a/MEF-2 cis-元件，它在心臟發(fā)生過(guò)程中看來(lái)賦予心室特異性基因表達(dá)，并且顯示普遍存在的轉(zhuǎn)錄因子YB-1與輔因子協(xié)同結(jié)合于HF-1a位點(diǎn)。另外，數(shù)據(jù)還表明CARP基因的5’側(cè)翼區(qū)域中的調(diào)節(jié)元件能指導(dǎo)心臟中的區(qū)域特異性(心房對(duì)心室，左對(duì)右)轉(zhuǎn)基因表達(dá)。CARP基因的5’側(cè)翼區(qū)域中的213個(gè)堿基對(duì)序列元件看來(lái)足以賦予錐干(conotruncal)特異性轉(zhuǎn)基因表達(dá)。
CARP在心肌細(xì)胞中與YB-1形成一種物理復(fù)合物，且內(nèi)源性CARP似乎位于心肌細(xì)胞的核中。Zou等人(Development 124,793-804,1997)已證明在心肌細(xì)胞中，CARP以HF-1序列依賴性方式負(fù)調(diào)節(jié)HF-1-TK最小啟動(dòng)子活性，而且當(dāng)與心臟和非心臟細(xì)胞中的GAL4 DNA結(jié)合區(qū)域融合時(shí)，表現(xiàn)出轉(zhuǎn)錄抑制活性。用標(biāo)準(zhǔn)Northern印跡方法分析表明在心臟組織的肌細(xì)胞中CARP mRNA水平豐富，達(dá)到骨骼肌中較低的水平，且通過(guò)對(duì)細(xì)胞因子活性的誘導(dǎo)，可在心臟和其它組織中上調(diào)內(nèi)源性CARP的表達(dá)(Chu等人，J.Biol.Chem.270,10236-45,1995；Jeyaseelan等人，J.Biol.Chem.272,22800-8,1997)。
細(xì)胞因子在控制和維持調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物多種器官系統(tǒng)生理機(jī)能的信號(hào)傳導(dǎo)途徑中有重要作用。它們普遍的重要性反映于細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)在組織中的廣泛分布，缺少細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)元件將導(dǎo)致多種器官缺陷。在Hirota等人(Cell 97,189-198,1999年4月16日)的研究(本文納入作為參考)中，研究者研究了IL-6相關(guān)細(xì)胞因子在心力衰竭發(fā)病機(jī)制中的作用，它是美國(guó)和其它發(fā)達(dá)國(guó)家中發(fā)病率和死亡率綜合的首要原因。在對(duì)血壓慢性增高和血容量過(guò)載的反應(yīng)中(這在心肌受損中非常常見(jiàn))，心臟的反應(yīng)是增大以維持正常的心臟功能，這是一種稱為代償性增生的過(guò)程。CT-1(IL-6細(xì)胞因子家族的一個(gè)成員)能激發(fā)體外心肌細(xì)胞發(fā)生增生，且已顯示其通過(guò)阻斷心肌細(xì)胞發(fā)生調(diào)亡而成為心肌細(xì)胞中強(qiáng)有力的心肌細(xì)胞存活因子的重要作用。還有其它證據(jù)表明在心肌細(xì)胞中存在細(xì)胞因子受體gp130的表達(dá)，能導(dǎo)致代償性心臟肥大，從而延緩細(xì)胞調(diào)亡的發(fā)生，和最終的心力衰竭。gp130細(xì)胞因子受體信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的缺陷常常導(dǎo)致發(fā)育胚胎的嚴(yán)重心臟缺陷，可能導(dǎo)致子宮中胚胎早期死亡。用本發(fā)明的組織特異性腺病毒載體送遞系統(tǒng)，將gp130的轉(zhuǎn)基因編碼區(qū)域直接引入子宮內(nèi)胚胎心臟細(xì)胞中，這一治療策略是可行的治療方法。類似地，通過(guò)連接于本發(fā)明的心臟特異性CARP啟動(dòng)子，在恒定的生物力學(xué)應(yīng)力下，將gp130基因引入成熟心肌細(xì)胞，可以引發(fā)gp130細(xì)胞因子受體途徑的表達(dá)，從而增加心臟代償性增生，抵銷心肌細(xì)胞調(diào)亡，由此避免了心力衰竭。
重組腺病毒載體的產(chǎn)生用Wang等人，J.Biol.Chem.273,2161-8,1998描述的腺病毒/CMV載體的構(gòu)建方法，通過(guò)含轉(zhuǎn)基因的穿梭質(zhì)粒DNA和含人5型腺病毒全基因組的pJM17質(zhì)粒DNA之間的同源重組，構(gòu)建了本發(fā)明的重組腺病毒載體。按專利程序的國(guó)際承認(rèn)的微生物保藏布達(dá)佩斯條約及該條約頒布的條款，將含質(zhì)粒pJM17(它包含復(fù)制缺陷性人5型腺病毒的全基因組的DNA)的大腸桿菌宿主在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(10801 University Blvd.,Manassas,Virginia 20110-2209,U.S.A.)保藏，ATCC登錄號(hào)為_(kāi)______。此保藏材料的樣品可提供給工業(yè)產(chǎn)權(quán)部，和接受該條約和條例的條款，承認(rèn)美國(guó)的專利法和條例有法律資格的人，以及所有遞交過(guò)本申請(qǐng)或要求本申請(qǐng)優(yōu)先權(quán)的其他國(guó)家或國(guó)際組織。
用2.5千堿基的CARP啟動(dòng)子(從CARP基因的5’側(cè)翼區(qū)域切下，插入到pXCJL.2的Bam HⅠ和Xho Ⅰ位點(diǎn)之間)裝配穿梭質(zhì)粒pAdv/CARP。(含質(zhì)粒pJM17的大腸桿菌宿主(pJM17包含人5型腺病毒全基因組DNA，且含有插入的鼠CARP啟動(dòng)子序列)，已被保藏為ATCC登錄號(hào)No.______)。得到的構(gòu)建物顯示出足以在培養(yǎng)的細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因小鼠中進(jìn)行局限于心臟的標(biāo)記基因的表達(dá)。(見(jiàn)Zou等人，(Development 124,793-804,1997)。)為闡明CARP的功能，用此2.5千堿基的CARP啟動(dòng)子來(lái)產(chǎn)生腺病毒/CARP/標(biāo)記構(gòu)建物，在體外和體內(nèi)給予這種腺病毒構(gòu)建物后，用綠熒光蛋白(GFP)基因作為鑒定腺病毒/CARP啟動(dòng)子活性的可見(jiàn)報(bào)告物。為了構(gòu)建報(bào)告基因，通過(guò)Bam HⅠ和Afl Ⅲ消化，從pEGFP-N1(Clontech,CA)切下GFP編碼序列，插入到pAdv/CARP的Xho Ⅰ位點(diǎn)，產(chǎn)生pAdv/CG。將得到的重組腺病毒命名為Adv/CG。
為了測(cè)定腺病毒基因組中包含的AAV ITR序列是否具有提高轉(zhuǎn)基因組織特異性表達(dá)的能力，通過(guò)Bam HⅠ和SaI Ⅰ消化從pAdv/CG取出含CARP啟動(dòng)子和GFP編碼序列的DNA片段，隨后插入到pAdv/AAV質(zhì)粒(其衍生自含兩個(gè)AAV ITR序列拷貝的pXCJL.2)的Xho Ⅰ位點(diǎn)。用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的轉(zhuǎn)化技術(shù)，將得到的質(zhì)粒pAdv/CG/ITR用于產(chǎn)生重組腺病毒，命名為Adv/CG/ITR。圖1提供了該重組腺病毒構(gòu)建物的圖解說(shuō)明。用標(biāo)準(zhǔn)方法將所有重組腺病毒載體噬斑純化，用PCR分析在病毒基因組中是否存在轉(zhuǎn)基因。如Wang等人，J.Biol.Chem.273,2161-8,1998所述，在CsCl梯度上一次超速離心(本領(lǐng)域熟知的方法)制備了高滴度的病毒儲(chǔ)藏液。
心肌細(xì)胞和心臟成纖維母細(xì)胞培養(yǎng)和腺病毒感染為了建立本發(fā)明的腺病毒載體的心臟組織特異性，如Iwaki等人，J.Biol.Chem.265,13809-17,1990所述，用Percoll梯度方法從1-2日齡的Sprague-Dawley大鼠制備了原代心室肌細(xì)胞和心臟成纖維母細(xì)胞。從Percoll梯度的上層區(qū)帶分離出心臟成纖維母細(xì)胞，隨后將其置于補(bǔ)充有10％胎牛血清的高葡萄糖Dulbecco改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)液中。從Percoll梯度的下層區(qū)帶分離出心肌細(xì)胞，隨后置于4:1Dulbecco改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)液；199培養(yǎng)液，10％馬血清和5％胎牛血清中。分離后24小時(shí)，以不同感染復(fù)數(shù)(M.O.I.)用該重組腺病毒感染心臟成纖維母細(xì)胞和肌細(xì)胞，然后再培養(yǎng)48小時(shí)，之后作DNA、RNA和熒光顯微照相分析。
RNA和DNA分析按制造商說(shuō)明(TELTEST,Texas)，用RNAzol B溶液從培養(yǎng)的細(xì)胞和小鼠組織中制備RNA樣品。按標(biāo)準(zhǔn)程序(本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的)進(jìn)行Northern印跡雜交，用GFP編碼序列產(chǎn)生P32標(biāo)記探針。按Purogene DNA分離試劑盒指導(dǎo)的方法制備了培養(yǎng)的細(xì)胞和小鼠組織純化的總DNA，然后用限制性內(nèi)切酶Xho Ⅰ/Not Ⅰ消化作Southern印跡分析，采用與Northern印跡雜交所用的相同P32標(biāo)記的GFP編碼序列探針。
體內(nèi)腺病毒注射入新生小鼠心臟如Brody等人，Ann.N.Y.Acd.Sci.716,90-101,1994所述，用高效程序?qū)⑼ㄟ^(guò)腺病毒載體的長(zhǎng)期表達(dá)注射入新生小鼠中，4℃低溫麻醉1日齡新生小鼠2分鐘。用固定在顯微操作器的火焰拉伸毛細(xì)管，將含有2×109個(gè)病毒顆粒的10μl病毒溶液直接注射到心腔中。毛細(xì)管中搏動(dòng)性血液倒流表明腔內(nèi)安置正確。重加溫到室溫，使新生小鼠復(fù)蘇，然后將它們放回它們的母親處48小時(shí)。48小時(shí)后，處死新生小鼠，從它們的尸體中取出心臟和肝，用于DNA、RNA和熒光顯微照相分析。
小鼠胚胎培養(yǎng)和顯微注射腺病毒載體用Cockroft等人，《胚胎移植后的解剖和培養(yǎng)1990》(IRL Press,Oxford,England)所述的方法制備大鼠血清。按Sturm和Tam，酶學(xué)方法，225,164-90,1993的方法培養(yǎng)全小鼠胚胎。如此方法，通過(guò)頸椎脫位處死控時(shí)的懷孕雌性小鼠。從尸體中解剖下子宮，用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)淋洗除去任何殘留的血液，然后再轉(zhuǎn)移到含PB1培養(yǎng)基(137mM NaCl；2.7mMKCl；0.5mM MgCl2；8.04mM Na2HPO4；1.47mM KH2PO4；0.9mM CaCl2；0.33丙酮酸鈉；1g/L葡萄糖；0.01g酚紅；pH7.35；100ml/L鏈霉素；100U/ml青霉素)的無(wú)菌容器中；所有試劑都是從Sigma Biochemicals,St.Louis,MO購(gòu)得。從子宮中解剖取下交配后11天的胚胎，除去蛻膜和Riechert膜。將胚胎與卵巢和羊膜分開(kāi)，在解剖過(guò)程中它們是相連的，以確保連接胚胎和卵巢的脈管或連接胚胎和胎盤的臍血管的完整性。然后將分離的胚胎轉(zhuǎn)移到搖床上培養(yǎng)轉(zhuǎn)瓶中的預(yù)平衡好的培養(yǎng)液中(含50％大鼠血清，連續(xù)通氣95％O2、5％CO2),37℃培養(yǎng)。培養(yǎng)1小時(shí)后，將胚胎置于培養(yǎng)皿上，用6μm直徑的玻璃移液管將胚胎顯微注射入左心室。用多階移液管牽拉器(Suter InstrumentCo.,Novato,CA)預(yù)先制備顯微移液吸管，將1mm玻璃毛細(xì)管牽拉成6μm針頭構(gòu)型。用電極鉗將每根顯微移液吸管連接于MX-110-R4手動(dòng)顯微操作器軸(Newport Instruments,Newport,CA)。低流速0.2-0.5μl/秒(每微升2-5秒)心內(nèi)注射1μl高滴度病毒溶液(2×108)。
轉(zhuǎn)基因靶向表達(dá)于體內(nèi)心肌細(xì)胞中的能力代表了一種新型強(qiáng)效的方法，可用來(lái)研究和操縱心臟發(fā)育過(guò)程中特異性基因的功能和用基因治療技術(shù)治療心臟病。用心臟限制性細(xì)胞啟動(dòng)子與AAV的左右兩邊ITR序列(分別為SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2)組合的策略，以實(shí)現(xiàn)在胚胎中和出生后心臟組織中心臟特異性轉(zhuǎn)基因表達(dá)，從而使本發(fā)明不同于本領(lǐng)域已有的其它重組腺病毒載體。另外，在心臟限制性重組腺病毒載體的前后序列中包含有AAV-ITR序列，可保留體外和體內(nèi)該細(xì)胞啟動(dòng)子活性的組織特異性，且當(dāng)與靶向送遞系統(tǒng)聯(lián)合時(shí)，能使本發(fā)明用作基因治療來(lái)治療心臟病，并提供一種研究胚胎心臟和出生后心臟特異性基因功能的方法。
如Fu等人和Phillip等人先前研究所報(bào)道的，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)以及發(fā)育的非洲蟾蜍胚胎中存在AAV-ITR序列具有提高轉(zhuǎn)基因表達(dá)的作用。本文將Fu等人和Phillip等人的研究報(bào)道納入作為參考。雖然非洲蟾蜍胚胎實(shí)驗(yàn)提示ITR序列促進(jìn)了復(fù)制細(xì)胞中的DNA分離，但其它研究表明在轉(zhuǎn)染后AAV-ITR序列提高了基因組整合，至少在體外裝配中如此。
不管為何種作用模式，大部分腺病毒DNA在感染細(xì)胞時(shí)為游離形式。由于出生后心肌細(xì)胞本身不呈現(xiàn)強(qiáng)復(fù)制，這兩種特性不可能對(duì)提高心臟組織中的組織特異性(表達(dá))有明顯作用。在非洲蟾蜍研究中還表明另一機(jī)理AAV-ITR有絕緣特性，這使得側(cè)翼轉(zhuǎn)基因不受腺病毒基因組中其它調(diào)節(jié)元件的影響。事實(shí)上，腺病毒Ela區(qū)域(它可調(diào)節(jié)相鄰細(xì)胞啟動(dòng)子的特異性)周圍存在負(fù)調(diào)節(jié)元件的發(fā)現(xiàn)，支持這種作用方式。已有的兩個(gè)研究，F(xiàn)ranz等人(Cardiovasc.Res.35,560-6,197)和Rothman等人(Gene Ther.3,919-26,1996)報(bào)道了用MLC-2啟動(dòng)子產(chǎn)生心肌細(xì)胞特異性腺病毒，但用α-MHC啟動(dòng)子則不行，雖然這兩種啟動(dòng)子都具有心肌細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄活性。本文將Franz等人和Rothman等人的研究報(bào)道納入作為參考。缺少Adv/CG(無(wú)AAV ITR的CARP啟動(dòng)子)轉(zhuǎn)基因表達(dá)，表明細(xì)胞啟動(dòng)子特異性轉(zhuǎn)錄活性受到周圍腺病毒基因組的顯著影響。所以，包含AAV ITR提供了一種用其它細(xì)胞啟動(dòng)子實(shí)現(xiàn)組織特異性轉(zhuǎn)錄的通用策略。
Hammond等人(美國(guó)專利No.5,792,453)報(bào)道了含編碼血管生成蛋白或肽的轉(zhuǎn)基因的復(fù)制缺陷型腺病毒載體，可通過(guò)冠狀動(dòng)脈內(nèi)注射將其直接送入冠狀動(dòng)脈，靶向患者的心肌，來(lái)治療心肌缺血。為了送遞這些血管生成蛋白(可能包括aFGF、bFGF、FGF-5(成纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子)和VEGF(血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子))，Hammond等人依靠心室肌細(xì)胞特異性啟動(dòng)子(稱為MLC-2和α-MHC的啟動(dòng)子)來(lái)實(shí)現(xiàn)靶向送遞。然而如本發(fā)明所建立的方法，心肌細(xì)胞中血管生成蛋白轉(zhuǎn)基因的心肌表達(dá)更可能是腺病毒載體直接應(yīng)用于心臟的結(jié)果，而不是用MLC-2v或α-MHC啟動(dòng)子的結(jié)果。除CARP基因啟動(dòng)子(SEQID NO:3)外，本發(fā)明AAV-ITR序列(SEQ ID NO:1和2)可與其它心臟限制性啟動(dòng)子一起使用，這包括以下基因的啟動(dòng)子1．α-肌球蛋白重鏈基因2．β-肌球蛋白重鏈基因3．肌球蛋白輕鏈2v基因4．肌球蛋白輕鏈2a基因5．CARP基因6．心α-肌動(dòng)蛋白基因7．心m2蠅蕈堿乙酰膽堿基因8．ANF9．心肌肌鈣蛋白C10．心肌肌鈣蛋白I11．心肌肌鈣蛋白T12．心肌肌質(zhì)網(wǎng)Ca-ATP酶基因13．骨骼肌α-肌動(dòng)蛋白14．從MLC-2v基因衍生的人工心肌啟動(dòng)子也可用AAV-ITR序列產(chǎn)生其它靶載體，用可誘導(dǎo)啟動(dòng)子進(jìn)行條件性基因表達(dá)。在Hammond等人的腺病毒載體中含有本發(fā)明的AAV-ITR序列，能確保血管生成轉(zhuǎn)基因的組織特異性表達(dá)，從而避免了這些血管生成蛋白對(duì)身體其它組織的負(fù)效應(yīng)。
以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，對(duì)本發(fā)明無(wú)任何限制。
實(shí)施例1在培養(yǎng)細(xì)胞中Adv/CG/ITR載體介導(dǎo)的細(xì)胞類型特異性轉(zhuǎn)錄本實(shí)施例提供了對(duì)包含心肌細(xì)胞富含的CARP啟動(dòng)子(SEQ ID NO:3)(偶聯(lián)于人腺病毒相關(guān)病毒(AAV)的反向末端重復(fù)序列(ITR)(SEQ ID NO:1和2))的重組腺病毒的轉(zhuǎn)錄特異性的評(píng)價(jià)。
用純化的腺病毒載體來(lái)感染從新生大鼠心臟制備的原代心臟成纖維母細(xì)胞和心肌細(xì)胞。用含人巨細(xì)胞病毒(CMV)增強(qiáng)子/啟動(dòng)子(驅(qū)動(dòng)GFP表達(dá))的腺病毒載體(Adv/CMV/GFP)作為病毒感染和GFP檢測(cè)的陽(yáng)性對(duì)照。如Wang等人，J.Biol.Chem.273,2161-8,1998所報(bào)道的，重組腺病毒能有效感染許多類型的細(xì)胞，包括心肌細(xì)胞，感染復(fù)數(shù)(M.O.I.)小于100病毒粒子/細(xì)胞，而且可在95％以上新生大鼠的培養(yǎng)的心肌細(xì)胞中檢測(cè)到高水平的GFP表達(dá)。但心成纖維母細(xì)胞需要大于1,000病毒粒子/細(xì)胞的M.O.I.來(lái)實(shí)現(xiàn)約70％感染。用相同水平的病毒感染(100或1,000病毒粒子/細(xì)胞)，無(wú)論是用Adv/CG載體感染的成纖維母細(xì)胞或心肌細(xì)胞中都未檢測(cè)到GFP的表達(dá)。相反，當(dāng)用Adv/CG/ITR載體作為感染劑時(shí)，在90％以上的心肌細(xì)胞中觀察到GFP的表達(dá)，但在心成纖維母細(xì)胞中未觀察到任何可評(píng)估的水平。這些結(jié)果表明心特異性CARP啟動(dòng)子/AAV-ITR是實(shí)現(xiàn)在培養(yǎng)的新生大鼠心臟心室肌細(xì)胞中轉(zhuǎn)基因特異性轉(zhuǎn)錄所必須的，而即使在高M(jìn).O.I也未在成纖維母細(xì)胞中觀察到轉(zhuǎn)錄表達(dá)。
用檢測(cè)mRNA的標(biāo)準(zhǔn)Norhtern印跡方法，在轉(zhuǎn)錄水平上進(jìn)一步評(píng)估了Adv/CG/ITR產(chǎn)生的GFP心臟局限性表達(dá)。如圖2所示，易測(cè)得在Adv/CMV/GRP感染的心肌細(xì)胞和心成纖維母細(xì)胞中GFP mRNA的水平。在Adv/CG感染的細(xì)胞中，未測(cè)得GFP mRNA，這與用熒光顯微照相評(píng)估得到的觀察結(jié)果相一致。相反，受Adv/CG/ITR感染的心肌細(xì)胞的RNA樣品顯示了GFP轉(zhuǎn)錄的顯著水平，而感染的心成纖維母細(xì)胞的RNA樣品的GFP水平則明顯較低。
為了確保觀察到的Adv/CG/ITR載體的心肌細(xì)胞局限性表達(dá)是在轉(zhuǎn)錄水平上而不是感染作用的繼發(fā)影響，用感染的成纖維母細(xì)胞和肌細(xì)胞DNA樣品作標(biāo)準(zhǔn)Southern印跡分析。如圖3所示，在受Adv/CMV/GFP或Adv/CG/ITR載體感染的心肌細(xì)胞和成纖維母細(xì)胞中存在相等水平的病毒DNA。這些結(jié)果證實(shí)CARP啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性在腺病毒基因組的前后序列中受抑制，其含有AAV的ITR序列使得培養(yǎng)的細(xì)胞中保留了CARP啟動(dòng)子的限制于心肌類型細(xì)胞的特異性。
實(shí)施例2體內(nèi)新生小鼠心臟中Adv/CG/ITR載體介導(dǎo)的心肌限制性轉(zhuǎn)基因表達(dá)為了使本發(fā)明成為治療遺傳性和獲得性心臟病的一種基因治療方法，重要的是要確立，Adv/CG/ITR載體的細(xì)胞類型特異性(在體外已得到證明)也可在體內(nèi)指導(dǎo)組織靶向的轉(zhuǎn)基因表達(dá)。為了對(duì)其進(jìn)行測(cè)試，將約2×109個(gè)腺病毒粒子直接注射到一日齡的小鼠心肌中。將Adv/CMV/ITR載體直接注射入心腔后，測(cè)得感染水平約為10％，主要集中分布在心室壁心外膜中。另外，在受感染動(dòng)物的肝臟中也測(cè)得高水平的GFP表達(dá)。該觀察與許多早期發(fā)表的研究相一致，這些早期研究確定通過(guò)全身循環(huán)送遞重組腺病毒，常常導(dǎo)致肝臟和其它非心臟組織中高水平的感染。與已有的觀察相似，直接心內(nèi)注射Adv/CG載體將導(dǎo)致在任何組織(包括心臟)中測(cè)不到GFP。如所預(yù)計(jì)的，本發(fā)明的腺病毒載體Adv/CG/ITR能在心臟組織中引發(fā)高水平GFP表達(dá)，而在肝臟和其它非心臟組織中表達(dá)水平低得多。
為了進(jìn)一步評(píng)估轉(zhuǎn)基因的組織特異性表達(dá)，對(duì)感染小鼠心臟和肝臟制備的RNA樣品作了Northern印跡分析。圖4顯示了該分析結(jié)果。在注射Adv/CMV/GFP的動(dòng)物中，在心臟和肝臟中都檢測(cè)到高水平GFP mRNA，證明了Northern印跡分析產(chǎn)生的結(jié)果。然而在注射Adv/CG/ITR的小鼠中，測(cè)得GFPmRNA主要在心臟中，肝臟中的水平明顯低許多。如本發(fā)明所述，在腺病毒載體中含有AAV ITR，能提高體內(nèi)轉(zhuǎn)基因表達(dá)的組織特異性，使本發(fā)明的腺病毒載體適合用于基因治療制劑的送遞。
實(shí)施例3培養(yǎng)的小鼠胚胎中受Adv/CG/ITR載體介導(dǎo)的心臟局限性轉(zhuǎn)基因表達(dá)也可將本發(fā)明的組織特異性基因轉(zhuǎn)移特性用于胚胎心臟發(fā)育過(guò)程中的基因功能研究。為了證明靶向基因表達(dá)的能力，在發(fā)育的心臟組織中，用組織特異性腺病毒載體，約2×108個(gè)粒子/重組腺病毒載體，Adv/CMV/GFP、Adv/CG和Adv/CG/ITR，顯微注射入交配11天后發(fā)育的小鼠胚胎的心腔中。首次注射腺病毒載體后再培養(yǎng)25小時(shí)，評(píng)估GFP的表達(dá)。Adv/CMV/GFP載體注射導(dǎo)致在發(fā)育心臟以及許多其它組織中相對(duì)高水平的GFP表達(dá)。這種大范圍表達(dá)模式證實(shí)先前的證據(jù)Adv/CMV/GFP載體能指導(dǎo)大范圍組織中轉(zhuǎn)基因的表達(dá)，而且轉(zhuǎn)基因的表達(dá)很可能受發(fā)育胚胎中病毒粒子分布的指引。注射重組Adv/CG載體后，熒光顯微照相分析表明在胚胎的任何部分都無(wú)GFP表達(dá)，這與體外培養(yǎng)細(xì)胞得到的結(jié)果以及新生小鼠研究的體內(nèi)數(shù)據(jù)相一致。注射Adv/CMV/ITR載體能引發(fā)心臟組織中GFP的表達(dá)，而在其它組織中無(wú)異位表達(dá)(用熒光顯微照相檢測(cè))。尤其是GFP表達(dá)在心房中水平最高。
這些結(jié)果表明含有AAV的ITR序列(如本發(fā)明的Adv/CG/ITR載體構(gòu)建物)能消除轉(zhuǎn)基因的異位表達(dá)，使得在直接將腺病毒載體注射入發(fā)育胚胎后，能夠心臟組織特異性表達(dá)。這種由本發(fā)明的Adv/CG/ITR載體指導(dǎo)的組織特異性表達(dá)，可用于開(kāi)發(fā)含AAV的ITR序列的其它重組腺病毒載體，并可在治療心臟損傷和功能失調(diào)中賦予治療性轉(zhuǎn)基因的心臟特異性表達(dá)。
雖然本發(fā)明已參考上述實(shí)例進(jìn)行描述，但可以理解在不脫離本發(fā)明精神時(shí)還可有許多改進(jìn)。另外，本發(fā)明僅受限于附帶的權(quán)利要求書。
序列表<110>Kenneth ChienYibin WangSylvia Evans<120>能在心臟中組織特異性表達(dá)的重組腺病毒<130>6627-8045<140>未知<141>1999年9月10日<150>US 60/099,960<160>3<170>Word Perfect 8.1版本<210>1<211>174<212>ssDNA<212>腺病毒相關(guān)病毒2；病毒；ssDNA病毒；細(xì)小病毒；Parvovirineae；依賴病毒<220><221>增強(qiáng)子；5’反向末端重復(fù)序列<222>1…174<400>1ggccactccc tctctgcgcg ctcgctcgct cactgaggcc gcccgggcaa 50agcccgggcg tcgggcgacc tttggtcgcc cggcctcagt gagcgagcga 100gcgcgcagag agggagtggc caactccatc actaggggtt cctggagggg 150tggagtcgtg acgtgaatta cgta 174<210>2<211>183<213>腺病毒相關(guān)病毒2；病毒；ssDNA病毒；細(xì)小病毒；Parvovirineae；依賴病毒<220><221>增強(qiáng)子；3’反向末端重復(fù)序列<222>1…183<400>2catggctacg tagataagta gcatggcggg ttaatcatta actacaagga 50acccctagtg atggagttgg ccactccctc tctgcgcgct cgctcgctca 100ctgaggccgg gcgaccaaag gtcgcccgac gcccgggcttt gcccgggcg 150gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag gga 183<210>3<221>2247<222>小家鼠；真核細(xì)胞；多細(xì)胞動(dòng)物；脊索動(dòng)物；有頭類；脊椎動(dòng)物；哺乳動(dòng)物；真獸亞綱；嚙齒目；Sciurognathi；鼠科；鼠亞科；鼠屬。<220><221>啟動(dòng)子<222>1-2247<300><301>Zou,Y.，等人<302>CARP，心錨蛋白重復(fù)蛋白，位于Nkx2-5同源框基因途徑的下游<303>發(fā)育<304>124<305>4<306>793-804<307>1997<400>3nagctcncat gcctgcaggt cgactctaga ggatcctttc atgtttaaca 50atatcaaccc taacccaagg ggaacagcct gcctgacagt ggctttgcca 100cccatgaata cttcctagtc tagtccgttt gtgaaactca gcccatccca 150acacttctgc aagccccatc ctctacaagg tgctcattgg gaatttcctg 200gagcttctct ttcaggatca gcctgattct agggcagcag ttctcaacct 250gggggcctcg acccctttgg gggaatcaaa cgacccttta caggggtcac 300atatcatcta tcctatatgt caggtattta cattacgatt cgtaacagta 350gcaaaattac aggtatgaaa tagcaatgaa ataattttat gattgaaggt 400caccacaaca tgaggccgcc acactgttct agagaaaaat cacctgggtg 450gggaaaggtt tgggaaagcc tttctgtcca ttcttcattc ttcaaagtga 500tgtgttcaca gaaagccttt cagctgttct gctggggctc ttagtaagtc 550tgagtaggaa ctgtatgtac caggtctgct tcttatgggt ggagccaaga 600cgcatcgtgg gtggagcgaa gacgcaacct caccttctac tctgcatcca 650tagcaagtag cctaatgttc tgngtctagg gtcatctctg tgaatcgaga 700tccttggccc ttgtttgaat tagggaggca caaaatctta aaaaattcaa 750gactgntcaa caanccanaa gtcctttctc aaaaggaaag gncttaactn 800tnancccccc tttacttttg agtcaaggcc tggaaccaaa ccggccccag 850gaatgaaaaa agcttgccat nacctggttg gcccctttna anaggncaaa 900aaaaaattgt ggttaacntt gaaaaaccga agaccaacag ttatcctcta 950gaaacacaat ttgctggttg aacagctgaa gtggggtggg ggttcttacc 1000ccatgttcat ggaagggtga gtgaggagag acagatatat gaggccagca 1050taacaaacat acacaacacc ctaattaaca cttccctctt ctactgacac 1100ccccttcact ctcctctttc ataaaaaata aaaaaagtat tttagtggct 1150cttacgatag aatctttcct cgaactataa aaagatctaa atatttatat 1200ttttcacatt ttaatatctt agcgatgaca agccagaaac aagatttttt 1250gcctctctca acagcaaagc ttggggcctt tttgtttccg tgttaggaat 1300agaacacgag agccccgtgt atctaggcag atgctctatc attagcccat 1350gagtctccag cctcagacgc acatttttct cgggctctct taagcttttc 1400ccacagcatt gggaaacttt actgacagca tccaagttgt gcttctgcta 1450agaactggac tcacatctct ctggcatcac ttcggcccgt tttggggtag 1500atcctctgat tagccttcag atttagaaca cggtgagcct gtggtcacta 1550attatggcca gtgacaccat agagtcaaag tgcattactg aatgctttca 1600atttctccta atgctggtac gatggcatgt cacagggcca ttttagctgc 1650agacatcatc cagagaattc caaacagata ggacaagtgg cacccagacc 1700catctccttc ccctcgggct gattatcccc aaaataggat gtcccaaagc 1750aacacttccc agccaactgg agtgctgata agtccagtta tcagaaagat 1800atggctgtaa gtgtgatgca cagtgcttgc attttcttga tacgttagtc 1850atatgagagc tgacaaagaa ggaaaaagag cagcgatgtg tgcaatatta 1900acaggcagct gtcccctggc ttcccgatac gtgggatgac tcgcattgct 1950gagcggtgtg gtcactgcca aaggaatgac cctctcacat ttcttcctga 2000ttcgcatacg ccgcggccag cttgtcatct ccctcttggg cttcccagac 2050actaagtctg gaatgaaaat tcacctgcct ctgaattggc cactggtggg 2100agcaggggtg tgacttggct tcccaggctg gaagattatc tcacccagcc 2150ctactatata acgggctggt gtggaggggc tccacagggc cagttccagg 2200ggttcatcca caagagagaa aaacatagac tcacggctgc caacatg 224權(quán)利要求
1．一種人5型重組腺病毒載體，其具有組織特異性轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)基因，其特征在于，所述的腺病毒載體含有組織限制性啟動(dòng)子；和人腺病毒相關(guān)病毒(AAV)的反向末端重復(fù)序列。
2．如權(quán)利要求1所述的人5型重組腺病毒載體，其特征在于，所述的組織限制性啟動(dòng)子是心臟限制性啟動(dòng)子。
3．如權(quán)利要求1所述的人5型重組腺病毒載體，其特征在于，所述的組織特異性是對(duì)心臟組織的。
4．如權(quán)利要求1所述的人5型重組腺病毒載體，其特征在于，所述AAV的反向末端重復(fù)序列含有兩個(gè)反向末端重復(fù)序列的拷貝。
5．如權(quán)利要求4所述的人5型重組腺病毒載體，其特征在于，所述的AAV的兩個(gè)反向末端重復(fù)序列拷貝包含左端和右端反向末端重復(fù)序列。
6．如權(quán)利要求5所述的人5型重組腺病毒載體，其特征在于，所述的AAV的左端和右端反向末端重復(fù)序列分別包含5’端和3’端反向末端重復(fù)序列。
7．如權(quán)利要求2所述的人5型重組腺病毒載體，其特征在于，所述的心臟限制性啟動(dòng)子包括以下心臟限制性啟動(dòng)子α-肌球蛋白重鏈基因、β-肌球蛋白重鏈基因、肌球蛋白輕鏈2v基因、肌球蛋白輕鏈2a基因、CARP基因、心肌α-肌動(dòng)蛋白基因、心肌m2蠅蕈堿乙酰膽堿基因、ANF、心肌肌鈣蛋白C、心肌肌鈣蛋白I、心肌肌鈣蛋白T、心肌肌質(zhì)網(wǎng)Ca-ATP酶基因、骨骼肌α-肌動(dòng)蛋、MLC-2v基因衍生的人工心肌啟動(dòng)子。
8．如權(quán)利要求7所述的人5型重組腺病毒載體，其特征在于，所述的心臟限制性啟動(dòng)子是心肌細(xì)胞限制性錨蛋白重復(fù)蛋白(CARP)啟動(dòng)子。
9．一種靶向基因治療心臟病的方法，其特征在于，所述的方法包括將心臟限制性細(xì)胞啟動(dòng)子與腺病毒相關(guān)病毒的反向末端重復(fù)序列結(jié)合。
10．如權(quán)利要求9所述的靶向基因治療心臟病的方法，其特征在于，所述的AAV的反向末端重復(fù)序列含有兩個(gè)反向末端重復(fù)序列的拷貝。
11．如權(quán)利要求9所述的靶向基因治療心臟病的方法，其特征在于，所述的AAV的兩個(gè)反向末端重復(fù)序列拷貝包含左端和右端反向末端重復(fù)序列。
12．如權(quán)利要求9所述的靶向基因治療心臟病的方法，其特征在于，所述的AAV的左端和右端反向末端重復(fù)序列分別包含5’端和3’端反向末端重復(fù)序列。
13．如權(quán)利要求9所述的靶向基因治療心臟病的方法，其特征在于，所述的心臟限制性啟動(dòng)子包括以下心臟限制性啟動(dòng)子α-肌球蛋白重鏈基因、β-肌球蛋白重鏈基因、肌球蛋白輕鏈2v基因、肌球蛋白輕鏈2a基因、CARP基因、心肌α-肌動(dòng)蛋白基因、心肌m2蠅蕈堿乙酰膽堿基因、ANF、心肌肌鈣蛋白C、心肌肌鈣蛋白I、心肌肌鈣蛋白T、心肌肌質(zhì)網(wǎng)Ca-ATP酶基因、骨骼肌α-肌動(dòng)蛋、MLC-2v基因衍生的人工心肌啟動(dòng)子。
14．一種評(píng)估基因功能的方法，其特征在于，所述的方法包括將心臟限制性細(xì)胞啟動(dòng)子與腺病毒相關(guān)病毒的反向末端重復(fù)序列結(jié)合。
15．如權(quán)利要求14所述的評(píng)估基因功能的方法，其特征在于，所述的心臟限制性細(xì)胞啟動(dòng)子是CARP啟動(dòng)子。
16．如權(quán)利要求14所述的評(píng)估基因功能的方法，其特征在于，所述的心臟限制性細(xì)胞啟動(dòng)子是含標(biāo)記基因的CARP啟動(dòng)子。
17．如權(quán)利要求16所述的評(píng)估基因功能的方法，其特征在于，所述的標(biāo)記基因含有綠熒光蛋白基因。
18．如權(quán)利要求14所述的評(píng)估基因功能的方法，其特征在于，所述的AAV的反向末端重復(fù)序列含有兩個(gè)反向末端重復(fù)序列的拷貝。
19．如權(quán)利要求14所述的評(píng)估基因功能的方法，其特征在于，所述的AAV的兩個(gè)反向末端重復(fù)序列拷貝包含左端和右端反向末端重復(fù)序列。
20．如權(quán)利要求19所述的評(píng)估基因功能的方法，其特征在于，所述的AAV的左端和右端反向末端重復(fù)序列分別包含5’端和3’端反向末端重復(fù)序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于實(shí)現(xiàn)心臟限制性轉(zhuǎn)錄的人5型重組腺病毒載體,包括用心肌細(xì)胞限制性心錨蛋白重復(fù)蛋白(CARP)啟動(dòng)子與含有人腺病毒相關(guān)病毒(AAV)的反向末端重復(fù)序列。用綠熒光蛋白(GFP)作為標(biāo)記基因,該重組腺病毒載體(Ad/CG/ITR)顯示出在體外和體內(nèi)小鼠模型中能指導(dǎo)轉(zhuǎn)基因表達(dá)于心肌組織。
文檔編號(hào)A61K35/76GK1325451SQ99813064
公開(kāi)日2001年12月5日 申請(qǐng)日期1999年9月10日 優(yōu)先權(quán)日1998年9月11日
發(fā)明者K·R·基耶, 王義斌, S·埃文斯 申請(qǐng)人:加利福尼亞大學(xué)董事會(huì)