豬圓環(huán)病毒2型競爭elisa抗體檢測試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種試劑盒，特別涉及一種豬圓環(huán)病毒2型競爭ELISA抗體檢測試劑 盒，屬于免疫學領域。
【背景技術】
[0002] 豬圓環(huán)病毒2型（Porcinecircovirustype2，PCV2)屬于圓環(huán)病毒科圓 環(huán)病毒屬成員，是迄今為止動物病毒中最小的病毒之一，直徑為17nm，二十面體對稱， 無囊膜。病毒基因組由單股閉合環(huán)狀DNA組成，含有1766~1769核苷酸（Olvera A,CorteyM，SegalesJ.Molecularevolutionofporcinecircovirustype 2genomes:Phylogenyandclonality[J].Virology, 2007, 357(2) :175 ~185；Huang L.P. ,LuY.H. ,WeiY.ff. ,etal.Identificationofonecriticalaminoacidthat determinesaconformationalneutralizingepitopeinthecapsidproteinof porcinecircovirustype2.BMCMicrobiol. 2011a，11:188. )。PCV2基因組主要包 含 2 個大的開放閱讀框架（0RF1 和 0RF2)(CheungAK.Transcriptionalanalysisof porcinecircovirustype2.Virology，2003, 305:168-180.)DORFl編碼復制酶相關蛋 白，參與病毒的復制，0RF2編碼Cap蛋白，是病毒的唯一結構蛋白，具有良好的免疫原性， 是該病毒途斷方法研制的理想革E抗原（LiuC，IharaT，NunoyaT，etal.Development ofanELISAbasedonthebaculovirus-expressedcapsidproteinofporcine circovirustype2asantigen[J].JVetMedSci.，2004, 66 (3) :237 ~242.)。雖然 PCV2只有一個血清型，然而卻分為多種基因型，包括PCV2a、PCV2b、PCV2c和PCV2d等。 這些基因型的差異使其Cap蛋白抗原性存在差異。PCV2多抗不能識別這些差異，只有 單抗可以區(qū)分（SahaD.，HuangL.P.，BussalleuE.，etal.Antigenicsubtypingand epitopes'competitionanalysisofporcinecircovirustype2usingmonoclonal antibodies.Vet.Microbiol. 2012, 157:13-22；HuangL.P. ,LuY.H.,WeiY.ff. ,et al.Identificationofonecriticalaminoacidthatdeterminesaconformational neutralizingepitopeinthecapsidproteinofporcinecircovirustype2.BMC Microbiol. 2011a，11:188.)。
[0003]PCV2是引起臨床上發(fā)生PMWS疾病的主要病原體，但其致病機制尚未完全闡明。 Meerts等(PeterMeerts，GeraldMisinzo,DavidLefebvre，JensNielsen，AnetteBotner,CharlotteSKristensen，HansJNauwynck.Correlationbetweenthepresenceof neutralizingantibodiesagainstporcinecircovirus2(PCV2)andprotection againstreplicationofthevirusanddevelopmentofPCV2-associateddisease[J]. BMCVetRes2006,2:6 - 16.)研究表明，豬體內缺乏PCV2中和抗體與病毒復制能力增 強有關，因體內中和抗體效價較低，不能夠完全中和體內病毒增殖，最終發(fā)展成為臨床 PMWS疾病D為了進一步證實這種觀點，F(xiàn)ort等（FortM，01veraA，SibilaM，Segal6s J，MateuE:Detectionofneutralizingantibodiesinpostweaningmultisystemic wastingsyndrome(PMffS)-affectedandnon-PMWS-affectedpigs[J].VetMicrobiol2007, 125:244 - 255.)進行了系統(tǒng)試驗，應用血清中和試驗、IPMA和定量PCR檢測PMffS豬、 沒有PMffS表現(xiàn)而PCV2陽性豬以及PCV2陰性豬，結果發(fā)現(xiàn)：中和抗體與血清中病毒載量呈 負相關，中和抗體增長的同時病毒數(shù)量明顯下降；PMffS豬血清中和抗體水平明顯低于沒有 PMffS表現(xiàn)而PCV2陽性豬。可見中和抗體在清除血液循環(huán)中PCV2和疾病康復過程中發(fā)揮重 要作用。因此，體液免疫在PCV2相關疾病方面可能占有重要地位。
[0004] 用于PCV2血清抗體檢測的方法主要IIF、IPMA、間接ELISA、阻斷ELISA、競爭 ELISA和免疫膠體金技術等，其中以IIF和IPM最為經(jīng)典和常用，盡管這兩種方法具有諸多 優(yōu)點，但是在結果判定方面存在一定的主觀性，難于實現(xiàn)高通量和自動化檢測需要使其推 廣受到限制?；谥亟M蛋白建立的間接ELISA具有較好的特異性，但其敏感性低于IPM(張 朝霞，劉長明，危艷武，等，豬圓環(huán)病毒2型ELISA抗體檢測試劑盒的研制及應用[J].中 國預防獸醫(yī)學報，2008, 30 (7) :548-551 ;張志慧，危艷武，吳洪麗，等，豬圓環(huán)病毒2型幾種 ELISA抗體檢測試劑盒的比較與應用[J].中國預防獸醫(yī)學報，2014, 36 (2) :129-133)，上述 幾種方法檢測結果不能直接反應PCV2中和抗體。本發(fā)明利用PCV2中和性單抗建立的競爭 ELISA法可以直接檢測血清中和抗體，具備規(guī)模化批量生產(chǎn)的優(yōu)勢，可實現(xiàn)自動化檢測要 求，特異性強，敏感性與IPM相當，為該病毒疫苗免疫及臨床發(fā)病動物血清抗體的檢測提 供了一種有效手段。

【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明的第一個目的在于提供一種豬圓環(huán)病毒2型競爭ELISA抗體檢測試劑盒， 該試劑盒操作簡便，特異性好，敏感性高，為PCV2流行病學調查及血清抗體檢測提供了一 種有效技術手段；
[0006] 本發(fā)明的第二個目的在于提供一種使用以上所述的試劑盒在制備檢測豬血清豬 圓環(huán)病毒2型抗體試劑中的應用；
[0007] 本發(fā)明的第三個目的在于提供用于建立以上所述試劑盒的單克隆抗體及分泌該 單克隆抗體的雜交瘤細胞株。
[0008] 為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明提供了如下技術方案：
[0009] 本發(fā)明以純化的PCV2作為免疫原，分別對6周齡雌性BALB/c鼠進行3次免疫。首 免，每只鼠注射腹腔50yg(0. 5ml)的純化病毒；間隔3周進行二免，免疫原、劑量和方法同 上；再間隔2周相同方法加強免疫。
[0010] 按常規(guī)方法無菌采取免疫鼠脾細胞，用PEG1450進行融合。采用IPM方法篩選抗 PCV2單抗，具體操作方法參照文獻（劉長明，張超范，危艷武，等.豬圓環(huán)病毒2型免疫過氧 化物酶單層細胞試驗抗體檢測試劑盒的研究與應用[J].中國預防獸醫(yī)學報，2007, 29(8): 621~624.)，雜交瘤上清液作為一抗，HRP標記的兔抗鼠IgG(H+L)作為檢測二抗，經(jīng)檢測， 將IPM檢測為陽性的雜交瘤細胞擴大培養(yǎng)，同時用有限稀釋法進行陽性雜交瘤細胞的克 隆，克隆3次，將獲得的陽性雜交瘤細胞及時凍存。
[0011] 經(jīng)IPM檢測篩選，獲得1株分泌抗豬圓環(huán)病毒2型單克隆抗體的陽性雜交瘤細胞 株，命名為PCV2-Cap-3A5,分類命名為分泌抗PCV2-Cap-3A5單克隆抗體的雜交瘤細胞株。 保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址在北京市朝陽區(qū)北辰西路1 號院中科院微生物研究所，其微生物保藏號為=CGMCCNO. 10205,保藏時間為2014年12月 22臼。
[0012] 進一步的，本發(fā)明還提供了由所述的雜交瘤細胞株分泌產(chǎn)生的單克隆抗體。
[0013] 本發(fā)明利用得到的單克隆抗體建立了一種豬圓環(huán)病毒2型競爭ELISA抗體檢測試 劑盒，其特征在于，包括采用間接的捕獲包被法包被豬圓環(huán)病毒2型抗原的酶標板和酶標 記的抗豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白單克隆抗體。
[0014] 所述的單克隆抗體由雜交瘤細胞株分泌產(chǎn)生，所述的雜交瘤細胞株命名為 PCV2-Cap-3A5，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC NO. 10205。
[0015] 在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述采用間接的捕獲包被法包被抗原為先用豬圓環(huán)病毒2 型陽性血清包被ELISA板以捕獲豬圓環(huán)病毒2型抗原；所述豬圓環(huán)病毒2型抗原為PCV2/ LG株培養(yǎng)物，毒價為IXIO5TCIDmAiI;所述酶為辣根過氧化酶。
[0016] 在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述豬圓環(huán)病毒2型陽性血清的包被稀釋倍數(shù)為I:1000 ;所 述捕獲豬圓環(huán)病毒2型抗原的作用時間為lh。
[0017] 在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述試劑盒還包括陰性對照、陽性對照、稀釋液、顯色液、洗 滌液和終止液。
[0018] 在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述陰性對照為豬圓環(huán)病毒2型陰性血清；所述陽性對照為 豬圓環(huán)病毒2型陽性血清；所述稀釋液為含有1%牛血清白蛋白的PBST緩沖液；所述顯色 液為ABTS工作液；所述洗滌液為PBST緩沖液；所述終止液為1 %的NaF溶液。
[0019] 在本發(fā)明的一個具體實施例中，優(yōu)選的，所述的試劑盒包括：