轉(zhuǎn)印至 硝酸纖維素膜上，含有2%脫脂乳的50mmol/LpH7. 2的磷酸鹽緩沖液4°C封閉過夜。PBST 洗5次，用添加0. 1%的Tween-20封閉液1:100倍稀釋制備的陰、陽性血清，37°Clh。PBST 洗5次，浸入含0?I%的Tween-20封閉液1:3000稀釋的HRP標(biāo)記的proteinA，37°C放置 lh，PBST洗5次，DAB顯色，拍照。
[0098] 2試驗(yàn)結(jié)果
[0099] 2. 1抗體檢測結(jié)果
[0100] 采用IPMA方法檢測被檢血清的陽轉(zhuǎn)情況及抗體效價(jià)。試驗(yàn)結(jié)果顯示：滅活疫苗二 免后14天采集的血清抗體已經(jīng)陽轉(zhuǎn)（圖6A)，平均抗體效價(jià)可以達(dá)到800倍，而對照組血清 1:50倍檢測結(jié)果為陰性（圖6B);實(shí)驗(yàn)組攻毒后21天平抗體效價(jià)均大于25600倍，對照組 血清1:50倍檢測結(jié)果為陰性。
[0101] 2. 2Westernblot檢測結(jié)果
[0102] Westernblot分析顯示，PCV2陽性血清可以特異性識(shí)別純化的重組PCV2_Cap蛋 白，呈現(xiàn)一條陽性反應(yīng)條帶（圖7,1泳道），而對照組PCV2陰性血清對照則無此反應(yīng)條帶 (圖7, 2泳道），表明制備的PCV2陽性血清具有良好的反應(yīng)活性。
[0103] 實(shí)施例3豬圓環(huán)病毒2型競爭ELISA方法的建立
[0104] 1、材料與方法
[0105] 1.1 材料
[0106] PCV2陰、陽性血清由本實(shí)驗(yàn)室自制保存，其它幾種豬病毒參考陽性血清由本所相 關(guān)課題組提供。3-氨基-9-乙基咪唑（AEC)和辣根過氧化物酶（HRP，TypeVI-A)為Sigma 產(chǎn)品；2, 2-連氮基雙-3-乙基-苯丙噻唑啉磺胺（ABTS)為BBI產(chǎn)品；辣根過氧化物酶 (HRP)-ProteinA標(biāo)記物（HRP-SPA)為Zymed產(chǎn)品；ProteinG層析柱為GEHealthcare產(chǎn) 品；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清（FBS)均購自Gibco公司；其它試劑為國產(chǎn)分析純。
[0107] ABTS工作液的配制：（1)顯色A液（0?lmol/L檸檬酸鹽緩沖液）配制：稱29. 41g 檸檬酸鈉（Na3C6H5O7 ? 2H20)溶解于1800mL去離子水中，用檸檬酸將pH調(diào)為4. 3,然后加入 200yL30%H2O2,最后用去離子水定容至2000mL; (2)顯色B液（2. 19%ABTS溶液）配制： 稱2. 19gABTS粉末，用0.lmol/L檸檬酸鹽緩沖液充分溶解后定容至IOOmL; (3)配制ABTS 工作液：在9. 5mL顯色A液加入0. 5ml顯色B液，混勻后使用，S卩用即配。
[0108] 1. 2單抗純化和HRP標(biāo)記
[0109] 單抗的純化：采用ProteinG親和層析純化3A5單抗腹水，具體操作參見說明書， 將純化后單抗進(jìn)行SDS-PAGE分析，經(jīng)薄層掃描和紫外光吸收法測定其抗體蛋白純度及含 量。
[0110] 辣根過氧化物酶標(biāo)記單抗的制備：按文獻(xiàn)（金伯泉.細(xì)胞和分子免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù) [M].西安：第四軍醫(yī)大學(xué)出版社，2002(156~158).)介紹的簡易過碘酸鈉法進(jìn)行HRP-單 抗標(biāo)記試驗(yàn)，測定標(biāo)記抗體的OD2ffflnn^POD4tx3nm，計(jì)算克分子比值。
[0111] 1.3 競爭ELISA術(shù)式
[0112] 用50mmol/L碳酸鹽緩沖液（pH9. 6)稀釋PCV2陽性血清，包被96孔酶標(biāo)板，置 4°C過夜。用含0. 05%Tween-20的50mmol/LpH7. 2的磷酸鹽緩沖液（PBST)洗3次，每次 3min。用含5%蔗糖和1%牛血清白蛋白（BSA)-PBST液封閉，置37°Clh，洗滌同上。加入用 封閉液稀釋的PCV2/LG株培養(yǎng)物，100yL/孔，37 °C感作Ih，洗滌同上。加用含有1 %牛血清 白蛋白的PBST緩沖液稀釋的待測血清、陰性對照和陽性對照，100yL/孔，37°C感作lh，保 留孔內(nèi)待檢血清，然后加酶標(biāo)單抗，50yL/孔，37°C感作lh，洗滌同上。加ABTS工作液于每 孔中，IOOyL/孔，37°C顯色15min，l%NaF終止，50yL/孔。用酶標(biāo)儀讀取各孔OD405nni值。 以陰、陽性標(biāo)準(zhǔn)參考血清OD4ffinni值作為參考，按照以下公式計(jì)算，S/N(% )= 100X(被檢血 清檢測值/陰性血清檢測值）。以S/N作為結(jié)果進(jìn)行判定。陽性對照為PCV2陽性血清，陰 性對照為PCV2陰性血清。
[0113] 1.4競爭ELISA反應(yīng)條件的確定
[0114] 豬圓環(huán)病毒2型陽性血清、病毒培養(yǎng)物及酶標(biāo)單抗分別系列稀釋后做方陣滴定， 以S/N值高為評價(jià)指標(biāo)，確定它們的最佳使用濃度；然后固定抗血清、病毒培養(yǎng)物及酶標(biāo)單 抗的使用濃度分別檢測待測豬血清和對照、病毒培養(yǎng)物及酶標(biāo)抗體不同孵育時(shí)間（30min、 45min和60min)對檢測效果的影響，選取S/N值較高者作為最佳的孵育時(shí)間；最后測定不 同顯色時(shí)間（10min、20min和30min)對競爭ELISA檢測豬圓環(huán)病毒2型抗體效果的影響， 同樣選取S/N值較高者作為最佳的顯色時(shí)間。選用經(jīng)IPMA標(biāo)定PCV2弱陽性血清（IPMA效 價(jià)介于100~400之間）5份，經(jīng)系列稀釋（1:50、1:100和1:200)后進(jìn)行競爭ELISA檢測， 確定待測血清的最佳稀釋倍數(shù)。
[0115] 1. 5競爭ELISA臨界值確定
[0116] 取經(jīng)IPMA標(biāo)定為PCV2陰性豬血清樣品80份，用競爭ELISA檢測其S/N，計(jì)算平均 值（X)和標(biāo)準(zhǔn)差（SD)，確定判定臨界值。
[0117] 1. 6競爭ELISA與IPMA檢測試劑盒對比試驗(yàn)
[0118] 選用237份試驗(yàn)豬血清，同時(shí)應(yīng)用競爭ELISA和IPMA進(jìn)行平行檢測，以IPMA為標(biāo) 準(zhǔn)，計(jì)算競爭ELISA與其檢測結(jié)果的符合率、敏感性和特異性。
[0119] 1. 7競爭ELISA和中和試驗(yàn)的相關(guān)性試驗(yàn)
[0120]選取24份試驗(yàn)豬血清進(jìn)行2倍系列稀釋（1 :50~I:12800)，同時(shí)分別應(yīng)用競爭 ELISA和中和試驗(yàn)進(jìn)行平行檢測。將能夠抑制50%病毒增殖的抗體最高稀釋倍數(shù)的倒數(shù)定 為抗體中和效價(jià)，將競爭ELISA檢測為陽性的最高稀釋倍數(shù)的倒數(shù)定為競爭ELISA抗體效 價(jià)，最后計(jì)算競爭ELISA和中和試驗(yàn)檢測結(jié)果的相關(guān)系數(shù)。
[0121] 1. 8競爭ELISA檢測特異性試驗(yàn)
[0122] 用已知豬圓環(huán)病毒1型（PCVl)、豬細(xì)小病毒1型（PPVl)、豬偽狂犬病病毒（PRV)、 豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV)、豬流行性腹瀉病毒（PEDV)、豬輪狀病毒（PRoV)、豬瘟病 毒（CSFV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV)、豬流感病毒（SIV)和豬0型口蹄疫病毒 (FMDV-O)參考陽性血清進(jìn)行交叉反應(yīng)試驗(yàn)。
[0123] 1. 9競爭ELISA檢測敏感性試驗(yàn)
[0124] 選取12份經(jīng)IPMA標(biāo)定好不同PCV2抗體效價(jià)的血清，其中強(qiáng)陽性3份（IPMA效 價(jià)大于1:6400)、陽性3份（IPMA效價(jià)介于1:800至1:3200)、弱陽性3份（IPMA效價(jià)介于 1:100至1:400)和陰性3份（IPMA效價(jià)小于1:100)。用樣品稀釋液將上述12份血清按 1 : 50、1 : 100、1 : 200、1 : 400、1 : 800、1 : 1600、1 : 3200 和 1 : 6400 的梯度進(jìn)行 稀釋，然后按照競爭ELISA操作程序進(jìn)行檢測，根據(jù)檢測結(jié)果確定豬圓環(huán)病毒2型ELISA抗 體檢測試劑盒對強(qiáng)陽性血清樣品、陽性血清樣品、弱陽性血清樣品和陰性血清樣品的最大 檢測稀釋倍數(shù)，以確定該試劑盒的敏感性。
[0125] 1.10檢測血清樣品來源
[0126] PCV2滅活疫苗免疫與攻毒試驗(yàn)豬來自30日齡非免疫健康仔豬8頭，經(jīng)PCR檢測 PCV2陰性，No. 3、19、21、26和32號豬設(shè)為免疫組，No. 1、9和10號豬設(shè)為空白對照組。免 疫組經(jīng)肌肉注射PCV2 (LG株）滅活疫苗，ImL/頭，間隔3w加強(qiáng)免疫1次，于第6w時(shí)疫苗免 疫組連同空白對照組豬進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，攻毒途徑為鼻內(nèi)和肌肉途徑接種PCV2強(qiáng)毒株培養(yǎng) 物（Ixio5TCIDmAiL)各ImL/頭。疫苗免疫及攻毒試驗(yàn)豬每周定期采血，血清樣品用于競 爭ELISA抗體檢測。此外，對來自全國各地送檢的862份臨床血清樣品也進(jìn)行競爭ELISA 檢測。
[0127] I. 11競爭ELISA試劑盒保存期試驗(yàn)
[0128] 將競爭ELISA整體試劑盒放置于4°C條件下保存，每隔3個(gè)月采用該試劑盒檢測8 份豬血清樣品（PCV2強(qiáng)陽性、陽性、弱陽性和陰性血清各2份），檢測到12個(gè)月。
[0129] 2、結(jié)果
[0130] 2. 1單抗3A5的純化和HRP標(biāo)記
[0131] 用ProteinG親和層析柱從腹水樣品中純化的單抗，經(jīng)SDS-PAGE電泳分析結(jié)果見 圖8,經(jīng)薄層掃描檢測單抗純度達(dá)89. 2%，紫外法測蛋白濃度為10. 2mg/mL。對純化的單抗 進(jìn)行HRP標(biāo)記試驗(yàn)，標(biāo)記的酶標(biāo)抗體在OD2ffflnni和OD4(]3Jt測光密度值分別為5. 5和3. 9,克 分子比值為2. 1，表明制備的酶標(biāo)單抗標(biāo)記效果較好，可以使用。
[0132] 2. 2競爭ELISA反應(yīng)條件的確定
[0133] 經(jīng)對各種試劑的使用濃度及反應(yīng)條件的試驗(yàn)，最終確定抗豬PCV2陽性血清包被 稀釋倍數(shù)為1 :1000,4°C過夜；病毒培養(yǎng)物毒價(jià)為IX105TCIDM/mL，37°C作用Ih;被檢豬血 清稀釋倍數(shù)為I:l〇〇,37°C作用45min;酶標(biāo)單抗使用濃度為I:4000,37°C作用30min;ABTS 工作液顯色20min，I%的NaF終止；酶標(biāo)儀讀取各孔OD4l35nni值。
[0134] 2. 3競爭ELISA臨界值的確定
[0135] 對已知陰性試驗(yàn)豬血清80份