r>[0020] 酶標(biāo)板：采用間接的捕獲包被法包被豬圓環(huán)病毒2型抗原；
[0021] 酶標(biāo)記的抗豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白單克隆抗體：辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的抗豬圓環(huán) 病毒2型Cap蛋白單克隆抗體，單克隆抗體是由保藏編號(hào)為CGMCCNO. 10205的雜交瘤細(xì)胞 株分泌產(chǎn)生；
[0022] 稀釋液：含有1 %牛血清白蛋白的PBST緩沖液；
[0023] 洗滌液：PBST緩沖液；
[0024] 陽(yáng)性對(duì)照：豬圓環(huán)病毒2型陽(yáng)性血清；
[0025] 陰性對(duì)照：豬圓環(huán)病毒2型陰性血清；
[0026] 顯色液：ABTS工作液；
[0027] 終止液：1 %的NaF溶液。
[0028] 本發(fā)明還提供了利用所述的試劑盒在制備檢測(cè)豬血清豬圓環(huán)病毒2型抗體試劑 中的應(yīng)用。
[0029] 在本發(fā)明中，優(yōu)選的，用競(jìng)爭(zhēng)ELISA法對(duì)豬圓環(huán)病毒2型感染或疫苗免疫的豬血清 抗體進(jìn)行檢測(cè)，具體的包括以下步驟：
[0030] (1)取出采用間接的捕獲包被法包被豬圓環(huán)病毒2型抗原的酶標(biāo)板，以洗滌液洗 板；
[0031] (2)加入稀釋液稀釋的待測(cè)豬血清和對(duì)照，37°C孵育；
[0032] (3)然后加入酶標(biāo)記的抗豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白單克隆抗體，37°C孵育，以洗滌 液洗板；
[0033] (4)加入顯色液，37°C顯色，最后加終止液終止反應(yīng)，測(cè)定OD4l35nni值。
[0034] 為了確定出最佳反應(yīng)條件，本發(fā)明在不同反應(yīng)條件下，對(duì)豬圓環(huán)病毒2型陽(yáng)性血 清、病毒培養(yǎng)物及酶標(biāo)單抗分別系列稀釋后做方陣滴定，以S/N值高為評(píng)價(jià)指標(biāo)，確定它們 的最佳使用濃度；然后固定抗血清、病毒培養(yǎng)物及酶標(biāo)單抗的使用濃度分別檢測(cè)待測(cè)豬血 清和對(duì)照、病毒培養(yǎng)物及酶標(biāo)抗體不同孵育時(shí)間（30min、45min和60min)對(duì)檢測(cè)效果的 影響，選取S/N值較高者作為最佳的孵育時(shí)間；最后測(cè)定不同顯色時(shí)間（10min、20min和 30min)對(duì)競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)豬圓環(huán)病毒2型抗體效果的影響，同樣選取S/N值較高者作為最 佳的顯色時(shí)間；選用經(jīng)IPMA標(biāo)定PCV2弱陽(yáng)性血清（IPMA效價(jià)介于100~400之間）5份，經(jīng) 系列稀釋（1:50、1:100和1:200)后進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)，確定待測(cè)血清的最佳稀釋倍數(shù)。 經(jīng)試驗(yàn)確定豬圓環(huán)病毒2型陽(yáng)性血清的包被稀釋倍數(shù)為I:1000 ;酶標(biāo)記的抗豬圓環(huán)病毒2 型Cap蛋白單克隆抗體的使用濃度為I:4000 ;所述待測(cè)豬血清的稀釋倍數(shù)為I:100 ;所述 豬圓環(huán)病毒2型抗原、待測(cè)豬血清和對(duì)照、酶標(biāo)記的抗豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白單克隆抗體 及顯色液的作用時(shí)間分別為lh、45min、30min和20min;
[0035] 在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述對(duì)照包括陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照為PCV2陽(yáng)性 血清，陰性對(duì)照為PCV2陰性血清；所述豬圓環(huán)病毒2型抗原為PCV2/LG株培養(yǎng)物，毒價(jià)為 IXIO5TCID5lZml;所述酶為辣根過(guò)氧化酶；所述洗滌液為PBST緩沖液；所述稀釋液為含有 1 %牛血清白蛋白的PBST緩沖液；所述顯色液為ABTS工作液；所述終止液為1 %的NaF溶 液。
[0036] 本發(fā)明的3A5單抗亞類為IgG2a，輕鏈為K型。Westernblot結(jié)果顯示，3A5單抗 不與純化的PCV2發(fā)生反應(yīng)。然而，IPM和病毒中和試驗(yàn)結(jié)果表明，該單抗可與PCV2發(fā)生反 應(yīng)，而與PCVl無(wú)交叉反應(yīng)；該單抗具有中和活性，中和活性為94. 8 %，是針對(duì)PCV2-Cap蛋 白中和表位的單抗；捕獲ELISA結(jié)果顯示，該單抗可以與不同的PCV2分離毒株發(fā)生反應(yīng)。利 用該株單抗建立了一種競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法，用于檢測(cè)該病毒感染或疫苗免疫的豬血清抗體。 該方法先用豬圓環(huán)病毒2型陽(yáng)性血清包被ELISA板以捕獲PCV2抗原，然后與待測(cè)豬血清抗 體及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的單抗3A5進(jìn)行反應(yīng)，通過(guò)測(cè)定酶標(biāo)單抗顯示競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)結(jié) 果。
[0037] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在：
[0038] (1)本發(fā)明利用PCV2中和性單抗建立的競(jìng)爭(zhēng)ELISA可以直接檢測(cè)血清中和抗體， 具備規(guī)?；可a(chǎn)的優(yōu)勢(shì)，可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化檢測(cè)要求，方法特異性強(qiáng)，敏感性與IPM相當(dāng)， 為該病毒疫苗免疫及臨床發(fā)病動(dòng)物血清抗體的檢測(cè)提供了一種有效手段。該競(jìng)爭(zhēng)ELISA組 裝成完整的試劑盒，在4°C可以保存一年。
[0039] (2)本發(fā)明采用病毒陽(yáng)性血清包被ELISA板，以其捕獲已知病毒抗原，這種方式 簡(jiǎn)便、快速，而且可以獲得良好的特異性。本發(fā)明發(fā)明人也曾嘗試用重組桿狀病毒表達(dá)的 PCV2_Cap重組蛋白作為包被抗原，但檢測(cè)效果不理想（數(shù)據(jù)未顯示），說(shuō)明以自然病毒粒子 作為檢測(cè)抗原仍具有重組蛋白無(wú)可比擬的優(yōu)勢(shì)。鑒于競(jìng)爭(zhēng)ELISA所用的酶標(biāo)單抗效價(jià)高、 活性好，提高了ELISA特異性和敏感性，且操作更加簡(jiǎn)單快速。
【附圖說(shuō)明】
[0040] 圖1為純化PCV2病毒粒子的電鏡結(jié)果圖；
[0041 ] 圖2為IPM方法檢測(cè)單抗與PCV2的反應(yīng)特性圖；
[0042] 圖3為Western-blot法對(duì)PCV2單克隆抗體進(jìn)行免疫活性分析結(jié)果圖，其中M:蛋 白標(biāo)樣；3A5 :PCV2 單抗；2C10 :PCV1 單抗；2E8 :PCV2 單抗；
[0043] 圖4為病毒中和試驗(yàn)檢測(cè)3A5單抗對(duì)PCV2毒株的中和活性圖；
[0044] 圖5為捕獲ELISA檢測(cè)3A5單抗與PCV2不同分離毒株的反應(yīng)特性圖；
[0045] 圖6為IPMA方法檢測(cè)PCV2陰、陽(yáng)性血清結(jié)果圖，其中A:試驗(yàn)組，B:對(duì)照組；
[0046] 圖7為Western-blot方法檢測(cè)PCV2陰、陽(yáng)性的反應(yīng)特性圖，其中M:蛋白標(biāo)樣；1 泳道：PCV2陽(yáng)性血清；2泳道：PCV2陰性血清；
[0047] 圖8為3A5單抗純化的SDS-PAGE分析圖，其中M:蛋白標(biāo)樣；1 :純化的3A5單抗樣 品；2 :3A5單抗腹水粗品；
[0048] 圖9為競(jìng)爭(zhēng)ELISA特異性檢測(cè)結(jié)果圖；
[0049] 圖10為競(jìng)爭(zhēng)ELISA對(duì)不同抗體水平的血清樣品的檢測(cè)結(jié)果圖。
[0050] 圖11為競(jìng)爭(zhēng)ELISA試劑盒保存期試驗(yàn)結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0051] 下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而 更為清楚。但實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員 應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行 修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0052] 實(shí)施例1抗豬圓環(huán)病毒2型（PCV2)Cap蛋白單克隆抗體的制備
[0053] 1、材料和方法
[0054] 1. 1細(xì)胞、毒種、試驗(yàn)動(dòng)物、抗體和試劑
[0055] SP2/0 和PK15 細(xì)胞系（PCVl和PCV2 檢測(cè)陰性），PCV1/G株，PCV2 毒株（LG、JF、 JF2、CUYJ、SH、BDH、AH等）均由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所豬圓環(huán)病毒課題組保 存；6周齡雌性BALB/c鼠由同所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。ABTS購(gòu)自BBI公司，HAT和HT混合 鹽、PEG1450、3-氨基-9-乙基咪唑（AEC)、辣根過(guò)氧化物酶（HRP，TypeVI-A)和HRP標(biāo)記 兔抗鼠IgG(H+L)均購(gòu)自Sigma公司；DMEM培養(yǎng)基和犢牛血清（FBS)均購(gòu)自Gibco公司；預(yù) 染蛋白Marker購(gòu)自Fermentas公司；MouseMonoAb-IDKit(HRP)、HRP-GoatAnti-Mouse IgG(H+L)購(gòu)自Invitrogen公司；辣根過(guò)氧化物酶（HRP)-ProteinA標(biāo)記物（HRP-SPA)為 Zymed產(chǎn)品；ProteinG層析柱為GEHealthcare產(chǎn)品；其它試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。
[0056] 1. 2豬圓環(huán)病毒2型（PCV2)純化
[0057] 采用CsCl梯度密度離心方法純化PCV2a/LG毒株。收獲300mlLG毒株組織培養(yǎng) 毒并凍融3次，病毒增殖方法參見文獻(xiàn)（劉長(zhǎng)明，張超范，劉煥章，等.豬圓環(huán)病毒2型細(xì)胞 適應(yīng)毒株的培育與鑒定[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2006, 28 (3) :248~252.)。4°C12000rpm 離心30min，收獲上清液；上清液裝于離心管中，管底加入30%蔗糖，4°C45000rpm(50ti rotor，beckman)離心3h，棄去上清，將沉淀用50mMHepes液重懸；最后將重懸液置于35% CsCl溶液上層，4°C36000rpm(SW41rotor,beckman)離心18h,收集離心管中部乳白色條帶， 于50mMIfepes液中透析去除CsCl，-80°C保存。純化的病毒負(fù)染后電鏡分析，紫外法測(cè)定 純化病毒的濃度。
[0058] I. 3單克隆抗體的制備
[0059] 以純化的PCV2作為免疫原，分別對(duì)6周齡雌性BALB/c鼠進(jìn)行3次免疫。首免，每 只鼠注射腹腔50yg(0. 5ml)的純化病毒；間隔3周進(jìn)行二免，免疫原、劑量和方法同上；再 間隔2周相同方法加強(qiáng)免疫。
[0060] 按常規(guī)方法無(wú)菌采取免疫鼠脾細(xì)胞，用PEG1450進(jìn)行融合。采用IPM方法篩選抗 PCV2單抗，具體操作方法參照文獻(xiàn)（劉長(zhǎng)明，張超范，危艷武，等.豬圓環(huán)病毒2型免疫過(guò)氧 化物酶單層細(xì)胞試驗(yàn)抗體檢測(cè)試劑盒的研究與應(yīng)用[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2007, 29(8): 621~624.)，雜交瘤上清液作為一抗，HRP標(biāo)記的兔抗鼠IgG(H+L)作為檢測(cè)二抗，經(jīng)檢測(cè)， 將IPM檢測(cè)為陽(yáng)性的雜交瘤細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，同時(shí)用有限稀釋法進(jìn)行陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞的克 隆，克隆3次，將獲得的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞及時(shí)凍存。
[0061] L4單克隆抗體的鑒定
[0062] I. 4. 1單抗效價(jià)和亞類鑒定