一種諾如病毒的檢測(cè)試劑盒及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種微生物的檢測(cè)方法，特別是涉及一種用于檢測(cè)諾如病毒的試劑 盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 諾如病毒，又稱諾瓦克病毒（Norwalk Viruses，NV)是人類杯狀病毒科（Human Calicivirus，HuCV)中諾如病毒（Norovirus，NV)屬的原型代表株。它是一組形態(tài)相似、抗 原性略有不同的病毒顆粒。諾如病毒（Norovirus)是導(dǎo)致急性胃腸炎最主要的病原之一。
[0003] 諾如病毒有許多共同特征：直徑約為26~35nm，無(wú)包膜，表面粗糙，球形，呈二十 面體對(duì)稱；從急性胃腸炎病人的糞便中分離，不能在細(xì)胞或組織中培養(yǎng)，也沒有合適的動(dòng)物 模型；基因組為單股正鏈RNA ;諾如病毒感染性強(qiáng)，以腸道傳播為主，可通過污染的水源、食 物、物品、空氣等傳播，常在社區(qū)、學(xué)校、餐館、醫(yī)院、托兒所、孤老院及軍隊(duì)等處引起集體暴 發(fā)。
[0004] 目前主要是通過免疫學(xué)的方法對(duì)諾如病毒進(jìn)行檢測(cè)，但由于免疫學(xué)的方法靈敏度 低，不能在發(fā)病早期就檢測(cè)出諾如病毒，這樣就會(huì)導(dǎo)致誤診，并增加了病人的負(fù)擔(dān)；因此研 發(fā)一種靈敏度高，方法簡(jiǎn)單，耗時(shí)短，能直接快速檢測(cè)糞便中諾如病毒的試劑盒會(huì)有很好的 應(yīng)用價(jià)值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種特異性好，靈敏度高，使用簡(jiǎn)便，能直接快速 檢測(cè)糞便中諾如病毒的試劑盒及其應(yīng)用。根據(jù)諾如病毒的序列保守區(qū)域RNA依賴的RNA聚 合酶區(qū)，使用Primer5. 0軟件設(shè)計(jì)了特異性引物，通過使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法，對(duì)諾 如病毒的感染進(jìn)行輔助診斷，以及諾如病毒的流行病學(xué)研宄。
[0006] 本發(fā)明一種諾如病毒的檢測(cè)試劑盒，其包括一對(duì)引物和TaqMan探針；其中，所述 的一對(duì)引物為引物1和引物2 ;所述引物1的核苷酸序列如序列表中的序列1所示；所述引 物2的核苷酸序列如序列表中的序列2所示；所述TaqMan探針的核苷酸序列如序列表中序 列3所示。
[0007] 進(jìn)一步，本發(fā)明一種諾如病毒的檢測(cè)試劑盒，所述TaqMan探針的5'端標(biāo)記有熒光 報(bào)告基團(tuán)FAM，3'端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)BHQl。
[0008] 進(jìn)一步，本發(fā)明一種諾如病毒的檢測(cè)試劑盒，所述引物1、引物2和TaqMan探針的 摩爾比為4:4:1。
[0009] 進(jìn)一步，本發(fā)明一種諾如病毒的檢測(cè)試劑盒，其還包括反應(yīng)緩沖液，逆轉(zhuǎn)錄酶，DNA 聚合酶，DEPC水。
[0010] 進(jìn)一步，本發(fā)明一種諾如病毒的檢測(cè)試劑盒，其包括濃度為40μΜ的引物 10. 5 μ L，濃度為40 μ M的引物20. 5 μ L，濃度為10 μ M的TaqMan探針0. 5 μ L，2 X反應(yīng)緩沖 液12. 5 μ L，40 X逆轉(zhuǎn)錄酶和DNA聚合酶混合液0. 625 μ L，DEPC水5. 375 μ L。
[0011] 本發(fā)明一種諾如病毒的檢測(cè)試劑盒的應(yīng)用，其用于檢測(cè)諾如病毒。
[0012] 進(jìn)一步，本發(fā)明一種諾如病毒的檢測(cè)試劑盒的應(yīng)用，其包括以下步驟：
[0013] -、提取樣品RNA ;
[0014] 二、將樣品RNA與權(quán)利要求1所述諾如病毒的檢測(cè)試劑盒中的試劑混合；
[0015] 三、按照以下條件進(jìn)行反應(yīng)：第一階段48°C 30min，第二階段95°C lOmin，第三階段 95°C 15s，60°C lmin，擴(kuò)增45個(gè)循環(huán)；并在第三階段進(jìn)行熒光信號(hào)采集。
[0016] 進(jìn)一步，本發(fā)明一種諾如病毒的檢測(cè)試劑盒的應(yīng)用，所述步驟一中提取樣品RNA 的步驟為：取糞便標(biāo)本〇. 5g，用磷酸鹽緩沖液1:10稀釋后，渦旋混勻，并4000rpm離心 15min，收集上清液至無(wú)菌管中，用Trizol (Invitrogen公司產(chǎn)品）提取標(biāo)本中的RNA ;所提 取的RNA溶于20 μ L DEPC水中。
[0017] 進(jìn)一步，本發(fā)明一種諾如病毒的檢測(cè)試劑盒的應(yīng)用，所述步驟二中樣品與試劑的 量為：樣品RNA 5 μ L，40 μ M的引物10. 5 μ L，濃度為40 μ M的引物20. 5 μ L，濃度為10 μ M 的TaqMan探針0.5 μ L，2X反應(yīng)緩沖液12. 5 μ L，40X逆轉(zhuǎn)錄酶和DNA聚合酶混合液 0· 625 μ L，DEPC 水 5. 375 μ L。
[0018] 本發(fā)明一種諾如病毒的檢測(cè)試劑盒及其應(yīng)用與現(xiàn)有技術(shù)不同之處在于：本發(fā)明的 諾如病毒的檢測(cè)試劑盒特異性好，靈敏度高，使用簡(jiǎn)單方便，耗時(shí)短，不僅能夠用于臨床急 性腹瀉患者對(duì)諾如病毒感染的檢測(cè)，也可用于諾如病毒感染流行病學(xué)的調(diào)查；在疫情暴發(fā) 時(shí)能夠提供快速特異的病原學(xué)依據(jù)。
[0019] 下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的一種諾如病毒的檢測(cè)試劑盒及其應(yīng)用作進(jìn)一步說明。
【附圖說明】
[0020] 圖1為采用本發(fā)明的諾如病毒的檢測(cè)試劑盒對(duì)不同濃度的諾如病毒陽(yáng)性質(zhì)粒進(jìn) 行檢測(cè)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果；
[0021] 圖2為采用本發(fā)明的諾如病毒的檢測(cè)試劑盒對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR 結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0022] 獲取本發(fā)明中引物和TaqMan探針的方法：使用Mega 5. 0軟件對(duì)在GenBank中現(xiàn) 有諾如病毒的基因序列進(jìn)行序列的生物信息學(xué)分析，通過同源性比較，尋找保守區(qū)域；應(yīng)用 ABI 引物合成軟件（Primer Express version 2. 0，Applied Biosystems)設(shè)計(jì)了擴(kuò)增保守 區(qū)基因片段的引物及TaqMan探針；所設(shè)計(jì)的引物和探針均具有互補(bǔ)于諾如病毒基因的序 列，應(yīng)用 NCBI/Primer-BLAST (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST)對(duì)所設(shè)計(jì)合成的引 物及TaqMan探針進(jìn)行特異性及可用性檢測(cè)，確保與其它病原體的核酸序列沒有同源性，也 不包括任何常見的核酸內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)；所以避免了諾如病毒檢測(cè)的假陽(yáng)性和假陰性的 結(jié)果，提高了檢測(cè)的可靠性和準(zhǔn)確度。然后由Invitrogen公司合成，經(jīng)PAGE純化。
[0023] 實(shí)施例1
[0024] 為檢測(cè)本發(fā)明中引物和TaqMan探針的敏感性，本實(shí)施例采用本發(fā)明的諾如病毒 的檢測(cè)試劑盒對(duì)諾如病毒陽(yáng)性標(biāo)本RNA進(jìn)行檢測(cè)，步驟如下：
[0025] -、以諾如病毒陽(yáng)性的標(biāo)本RNA為模板，應(yīng)用所設(shè)計(jì)合成的引物（即本發(fā)明中 的引物）擴(kuò)增得到目的基因片段，純化后將其克隆至PGEM-T載體（Invitrogen)。通過 藍(lán)白斑篩選、PCR鑒定等得到含有目的基因片段的陽(yáng)性質(zhì)粒DNA。通過丘比特雙鏈DNA 檢測(cè)試劑盒（Quanti-iTTM dsDNA BR Assay kit)及丘比特焚光檢測(cè)儀（the QubitTM fluorometer，2-100ng) (Invitrogen，Lot:55318A)對(duì)陽(yáng)性質(zhì)粒 DNA 進(jìn)行定量。所得陽(yáng)性質(zhì) 粒DNA的濃度為9. 6X IO8拷貝數(shù)/微升，對(duì)其進(jìn)行對(duì)數(shù)稀釋，得到濃度分別為每微升10 °、 IO1UO2UO^ IO4拷貝數(shù)的樣品，分別標(biāo)記為1、2、3、4、5。
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