一種快速檢測水貂病毒性腸炎病毒的雙重pcr方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種快速檢測水貂病毒性腸炎病毒的雙重PCR方法，屬于病毒分子生 物學領域。 (二）
【背景技術】
[0002] 水紹病毒性腸炎病毒（Mink enteritis virus，MEV)可引起水紹病毒性腸炎（Mink viral enteritis)，水貂病毒性腸炎是一種急性、高度接觸性傳染疾病，該病以腹瀉為主要 特征，具有較高的發(fā)病率和死亡率，是世界公認的危害水貂養(yǎng)殖業(yè)的重要病毒性傳染病之 一，嚴重妨礙了養(yǎng)貂業(yè)的健康發(fā)展。因此，及時快速檢測水貂病毒性腸炎病毒，在生產實踐 中具有重要的作用，對水貂病毒性腸炎的預防具有重大意義。
[0003] 目前在實際生產中，檢測水貂病毒性腸炎病毒常用的方法有間接免疫熒光技術、 瓊擴試驗、血凝/血凝抑制試驗以及ELISA等，這些方法存在或敏感性不高、或特異性不強 等缺點。隨著分子生物學和生物試劑的不斷發(fā)展和改善，PCR檢測方法已經成為病毒檢測 的重要技術。因此可以針對MEV的結構蛋白（VP2)和非結構蛋白（NSl)設計兩對引物，建 立PCR方法對MEV進行檢測。目前，在我國水貂群中MEV普遍存在，應用雙重PCR方法檢測 MEV的方法還沒有建立，所建立的檢測MEV的雙重PCR方法具有省時省力、特異性強、敏感性 高的高通量檢測方法，為MEV的檢疫提供一種新的檢測方法。 (三）

【發(fā)明內容】

[0004] 為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種快速檢測水貂病毒性腸炎病毒的雙重PCR 方法，是一種用于非疾病診斷目的的快速檢測方法，主要涉及一組用于快速檢測水貂病毒 性腸炎病毒的特異性引物。本發(fā)明設計并篩選了新的特異性引物，優(yōu)化了反應過程中的各 種參數，建立了檢測MEV的雙重PCR方法，特異性更強、敏感性更高，可以快速準確地進行 MEV的檢測。
[0005] 一組用于快速檢測水貂病毒性腸炎病毒的特異性引物，是通過對GenBank上已發(fā) 表的MEV的基因序列進行比對，選擇在MEV的非結構蛋白NSl基因的保守區(qū)與結構蛋白VP2 基因的保守區(qū)，分別設計一對針對NSl基因片段的特異性引物SEQ. ID. NO 1/SEQ. ID. NO 2 和一對針對VP2基因片段的特異性引物SEQ. ID. NO 3/SEQ. ID. NO 4。
[0006] SEQ. ID. NO I :5' -GGTTAGCTAAACATGGTTATG-3' ；
[0007] SEQ. ID. NO 2 :5' -GAGTCAGAGGAGTTAGAACG-3' ；
[0008] SEQ. ID. NO 3 :5' -CTTTGCCTCAATCTGAAGGAGT-3' ；
[0009] SEQ. ID. NO 4 :5' -GAATTGGATTCCAAGTATGAGAT-3'。
[0010] 所有引物以無菌ddH20(Rnase free)配成20pmol/ μ I的濃度備用。
[0011] 上述引物的使用方法如下：
[0012] A、以 MEV DNA 為模板進行PCR 反應。反應體系為：17. 3μ1 CldH2O (Rnase free)， 2· 5 μ I Buffer，2 μ I dNTPs (10.0 mM)，SEQ. ID. NO 1 和 SEQ. ID. NO 2 各 I. 0 μ 1，SEQ. ID. NO 3 和 SEQ. ID. NO 4 各 1.0 μ 1，1 μ I DNA 模板，0· 2 μ I Taq 酶。PCR 反應條件為：95°C 5min ; 94°C 30s，53°C 30s，72°C lmin，32 個循環(huán)；72°C lOmin。
[0013] B、對步驟A得到的PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測：
[0014] 如果同時擴增出了 191bp和824bp的產物，則該樣品為陽性，樣品中含有MEV ;如 果只擴增出擴增出191bp或824bp的產物，則該樣品可疑；如果未擴增出191bp和824bp的 產物，則該樣品不含有MEV。
[0015] 本發(fā)明的雙重PCR方法最低可檢測到IO2個拷貝MEV的病毒DNA，表明本方法具有 很尚的靈敏性。
[0016] 用建立的雙重PCR方法對威海、諸城、菏澤、臨沂、大連等地30個水貂養(yǎng)殖場場送 檢的72只MEV分離呈陽性的水貂器官組織進行檢測，結果發(fā)現所有樣品的檢測結果與病毒 分離培養(yǎng)檢測結果符合率為100%，說明本發(fā)明建立的雙重PCR方法適合于MEV的快速檢 測。 (四）【附圖說明】
[0017] 圖1單重PCR的特異性檢測結果
[0018] M，DNA Marker DL2000 ;用 SEQ. ID. NO 1/SEQ. ID. NO 2 分別擴增：1. MEV，2.貂犬瘟 熱病毒，3.水貂阿留申病病毒，4.健康水貂脾臟組織；用SEQ. ID. NO 3/SEQ. ID. NO 4分別擴 增，5. MEV，6.貂犬瘟熱病毒，7.水貂阿留申病病毒，8.健康水貂脾臟組織。
[0019] 圖1說明本專利所設計引物SEQ. ID. NO 1/SEQ. ID. NO 2只能擴增出MEV的NSl 基因片段，而對貂犬瘟熱病毒、水貂阿留申病病毒、健康水貂脾臟組織擴增陰性；SEQ. ID. NO 3/SEQ. ID. NO 4只能擴增出MEV的VP2基因片段，而對貂犬瘟熱病毒、水貂阿留申病病毒、 健康水貂脾臟組織擴增陰性。結果表明SEQ. ID. NO 1/SEQ. ID. NO 2與SEQ. ID. NO 3/SEQ. ID. NO 4具有很強的特異性。
[0020] 圖2雙重PCR的特異性檢測結果
[0021] M，DNA Marker DL2000 ;1·用引物 SEQ. ID. NO 1/SEQ. ID. NO 2 與引物 SEQ. ID. NO 3/SEQ. ID. NO 4 雙重 PCR 擴增 MEV ;2,用引物 SEQ. ID. NO 1/SEQ. ID. NO 2 擴增 MEV ;3,用 引物 SEQ. ID. NO 3/SEQ. ID. N04 擴增 MEV ;用引物 SEQ. ID. NO 1/SEQ. ID. NO 2 與引物 SEQ. ID. NO 3/SEQ. ID. NO 4雙重PCR分別擴增，4.貂犬瘟熱病毒，5.水貂阿留申病病毒，6.綠膿 桿菌感染的水貂肺臟，7.雙球菌，8.克雷伯氏菌，9.巴氏桿菌，10.大腸桿菌，11.健康水貂 脾臟組織。
[0022] 用 SEQ. ID. NO 1/SEQ. ID. NO 2 與 SEQ. ID. NO 3/SEQ. ID. NO 4 兩對引物建立的檢測 MEV的雙重PCR方法只能擴增出MEV的NSl基因片段與VP2基因片段，而對貂犬瘟熱病毒、 水貂阿留申病病毒、綠膿桿菌感染的水貂肺臟、雙球菌、克雷伯氏菌、巴氏桿菌、大腸桿菌、 健康水貂脾臟組織等擴增陰性。結果表明用SEQ. ID. NO 1/SEQ. ID. NO 2與SEQ. ID. NO 3/ SEQ. ID. NO 4兩對引物建立的檢測MEV的雙重PCR方法具有很強的特異性。
[0023] 圖3雙重PCR針對MEV感染水貂脾臟總DNA的敏感性檢測結果
[0024] M，DNA Marker DL2000 ;所提組織病料模板DNA的濃度對應組織病料的量分別是， I. Img/μ L，2. IOOng/μ L，3. IOng/μ L，4. Ing/μ L，5. IOOpg/μ L，6. IOpg/μ L，7. Ipg/μ L。 結果表明，所建立雙重PCR方法與單重PCR的敏感度一致，最低可檢測到IOpg/ μ L的組織 總DM〇
[0025] 圖4雙重PCR針對MEV的DNA模板的敏感性檢測結果
[0026] M，DNA Marker DL2000 ;M, DL2000 ; 1-11，分別為 IOici-IO?拷貝的 MEV 的 DNA 模板。 結果表明，所建立檢測MEV的雙重PCR方法最低可檢測到IO2個拷貝的病毒DNA。 (五）【具體實施方式】
[0027] 1引物設計
[0028] 通過對參考GenBank上已發(fā)表的ME