一種抗水貂病毒性腸炎精制蛋黃抗體及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種抗水貂病毒性腸炎精制蛋黃抗體及其制備方法，所述抗體通過向分離的高免蛋黃中加入醋酸緩沖液進(jìn)行稀釋，其中，蛋黃與醋酸緩沖液的體積比為1：2，用酸調(diào)PH至4.8；按每毫升稀釋蛋黃液加11μL辛酸的比例在室溫?cái)嚢柘轮鸬渭尤胄了?，?0min內(nèi)加完，低溫下靜置2h，然后以10000r/min的轉(zhuǎn)速離心30min，棄沉淀；上清液經(jīng)125μm尼龍篩過濾后，加入1/10體積的0.01mol/L的PBS，用堿調(diào)PH至7.2；將40％甲醛溶液與該上清液混合，使甲醛的終濃度達(dá)到0.1％(V/V)，充分?jǐn)嚢杈鶆蚣吹?，是針?duì)水貂病毒性腸炎的特異性治療制劑，抗體純度高、效價(jià)高、性質(zhì)穩(wěn)定。
【專利說明】-種抗水紹病毒性腸炎精制蛋黃抗體及其制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其是一種抗水貂病毒性腸炎精制蛋黃抗體及其制備 方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 水貂病毒性腸炎是由細(xì)小病毒（MEV)引起的，W劇烈腹瀉為主要特征的急性、接 觸性傳染病，與貓泛白細(xì)胞減少癥有親緣關(guān)系。特別是幼齡水貂有較高的發(fā)病率和病死率， 該是世界公認(rèn)的危害水貂飼養(yǎng)業(yè)較嚴(yán)重的病毒性傳染病之一。
[000引在20世紀(jì)40年代末和50年代初，本病曾對(duì)加拿大、丹麥、芬蘭、挪威和瑞典等一 些國家的養(yǎng)貂業(yè)造成巨大的威脅和損失。美國、蘇聯(lián)、英國都有此病流行。我國首發(fā)于1980 年，由于國內(nèi)外引種，種貂串換檢疫不嚴(yán)格或不檢疫，造成本病傳染擴(kuò)大，先后在迂寧、黑龍 江、山東、江蘇等省都曾發(fā)生過，且造成巨大經(jīng)濟(jì)損失，該病是危害水貂主要傳染病之一。
[0004] 水貂病毒性腸炎常呈暴發(fā)性流行，根據(jù)國內(nèi)外發(fā)病貂場的統(tǒng)計(jì)，幼貂發(fā)病率為 50%?60%，成年貂發(fā)病率為10%?30%，病死率為25%?30%，有的報(bào)道，幼貂病死率可 達(dá) 90%。
[0005] 目前主要用疫苗免疫來預(yù)防該疾病的發(fā)生。由于還沒有針對(duì)病毒性疾病的特效藥 物，因此臨床治療上主要采取對(duì)癥治療和抗生素類藥物預(yù)防并發(fā)癥的發(fā)生，其治療效果不 理想。因此，在生產(chǎn)中急需一種針對(duì)水貂病毒性腸炎具有特異性、治療效果好且療效迅速的 治療制劑。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種抗水貂病毒性腸炎精制蛋黃抗體。
[0007] 本發(fā)明所要解決的另一技術(shù)問題在于提供上述抗水貂病毒性腸炎精制蛋黃抗體 的制備方法。
[000引為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的技術(shù)方案是：
[0009] -種水貂病毒性腸炎病毒精制蛋黃抗體，所述抗體是由下述方法得到的：
[0010] (1)分離高免雞蛋蛋黃；將水貂病毒性腸炎病毒滅活苗免疫過的高免雞蛋進(jìn)行消 毒后送入蛋清蛋黃分離機(jī)進(jìn)行蛋黃分離；
[0011] (2)制備精制蛋黃抗體；向步驟（1)所分離的蛋黃中加入醋酸緩沖液進(jìn)行稀釋，其 中，蛋黃與醋酸緩沖液的體積比為1 ;2,用酸調(diào)PH至4.8 ;按每毫升稀釋蛋黃液加11 uL辛 酸的比例在室溫?cái)埌柘轮鸬渭尤胄了?，?0min內(nèi)加完，低溫下靜置化，然后W l〇〇(K)r/min 的轉(zhuǎn)速離也30min，棄沉淀；上清液經(jīng)125 y m尼龍篩過濾后，加入1/10體積的0. Olmol/L的 PBS，用堿調(diào)PH至7. 2 ;將40 %甲酵溶液與該上清液混合，使甲酵的終濃度達(dá)到0. 1 % (V/ V)，充分?jǐn)埌杈鶆蚣吹谩?br> [0012] 優(yōu)選的，上述水貂病毒性腸炎病毒精制蛋黃抗體，所述抗體的抗體效價(jià)為HI:2^。
[0013] 上述水貂病毒性腸炎病毒精制蛋黃抗體的制備方法，具體步驟如下：
[0014] (1)分離高免雞蛋蛋黃：將水貂病毒性腸炎病毒滅活苗免疫過的高免雞蛋進(jìn)行消 毒后送入蛋清蛋黃分離機(jī)進(jìn)行蛋黃分離；
[0015] (2)制備精制蛋黃抗體；向步驟（1)所分離的蛋黃中加入醋酸緩沖液進(jìn)行稀釋，其 中，蛋黃與醋酸緩沖液的體積比為1 ;2,用酸調(diào)PH至4. 8 ;按每毫升稀釋蛋黃液加11 y L辛 酸的比例在室溫?cái)埌柘轮鸬渭尤胄了?，?0min內(nèi)加完，低溫下靜置化，然后W l〇〇(K)r/min 的轉(zhuǎn)速離也30min，棄沉淀；上清液經(jīng)125 y m尼龍篩過濾后，加入1/10體積的0. Olmol/L的 PBS，用堿調(diào)PH至7. 2 ;將40%甲酵溶液與該上清液混合，使甲酵的終濃度達(dá)到0. 1 % (V/ V)，充分?jǐn)埌杈鶆颍?br> [0016] (3)抗體效價(jià)的測定。
[0017] 優(yōu)選的，上述抗水貂病毒性腸炎病毒精制蛋黃抗體的制備方法，所述步驟（1)中 高免雞蛋采用水貂病毒性腸炎病毒滅活苗免疫具體是指用貓腎傳代細(xì)胞培養(yǎng)水貂病毒性 腸炎病毒，濃縮后作抗原，進(jìn)行甲酵滅活，加入免疫增強(qiáng)劑及白油佐劑，制備油包水型水貂 病毒性腸炎病毒滅活苗，做為免疫用疫苗。
[0018] 優(yōu)選的，上述抗水貂病毒性腸炎病毒精制蛋黃抗體的制備方法，所述步驟（1)中 的消毒方法是對(duì)高免雞蛋用清水沖洗干凈，再用0. 05%的百毒殺浸泡3-5min，然后用紗布 擦干，再用75%己醇擦洗一遍，瞭干。
[0019] 優(yōu)選的，上述水貂病毒性腸炎病毒精制蛋黃抗體的制備方法，所述步驟（1)中的 高免雞蛋是由下述方法得到的：
[0020] ( i )免疫；水貂病毒性腸炎病毒滅活苗免疫健康的高產(chǎn)蛋雞；
[0021] ( ii )利用免疫高產(chǎn)蛋雞得到高免雞蛋。
[0022] 優(yōu)選的，上述抗水貂病毒性腸炎病毒精制蛋黃抗體的制備方法，所述步驟（i )中 用疫苗免疫高產(chǎn)蛋雞的免疫次數(shù)> 2。
[0023] 優(yōu)選的，上述抗水貂病毒性腸炎病毒精制蛋黃抗體的制備方法，所述步驟（3)抗 體效價(jià)的測定是指將步驟（2)最終所得濾液進(jìn)行水貂病毒性腸炎病毒精制蛋黃抗體效價(jià) 測定，在96孔微量反應(yīng)板上進(jìn)行，每孔加25ul生理鹽水；左側(cè)第1孔加25ul蛋黃液，混合 均勻后從第1孔吸25ul至第2孔，依次倍比稀釋至第11孔（第11孔吸棄25ul);每孔加 入25111四個(gè)血凝單位的病毒液，振蕩3〇3，然后371：靜置3〇111111;每孔加入2511110%豬紅 細(xì)胞息液，震蕩15s，4°C靜置20min后觀察結(jié)果。
[0024] 本發(fā)明的有益效果是：
[0025] 上述抗水貂病毒性腸炎精制蛋黃抗體，是一種針對(duì)水貂病毒性腸炎具有特異性、 治療效果好且療效迅速的治療制劑，能針對(duì)水貂病毒性腸炎進(jìn)行有效的防治；其制備方法 采用辛酸沉淀法提取抗水貂病毒性腸炎，該法安全、價(jià)格低廉，適于大規(guī)模生產(chǎn)，且制備的 蛋黃抗體純度高、效價(jià)高、性質(zhì)穩(wěn)定、易于保存。

【具體實(shí)施方式】
[0026] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明所述技術(shù)方案作進(jìn)一步的說明。
[0027] 下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法；下述實(shí)施例中所用的試 驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。
[0028] 實(shí)施例1
[0029] -種水貂病毒性腸炎病毒精制蛋黃抗體，是由下述方法制備得到的：
[0030] I制備水貂病毒性腸炎的高免雞蛋
[0031] (1)選擇健康高產(chǎn)未免疫產(chǎn)蛋雞隔離飼養(yǎng)，加強(qiáng)飼料營養(yǎng)，同時(shí)加喂頭抱喔巧軸W 預(yù)防細(xì)菌感染；
[0032] (2)免疫用疫苗的制備；用貓腎傳代細(xì)胞（F81細(xì)胞）培養(yǎng)水貂病毒性腸炎病毒， 濃縮后作抗原（HA > 26)，加入終濃度0. 2%甲酵滅活36小時(shí)，與白油佐劑按體積比1:3比 例乳化，制備油包水型水貂病毒性腸炎病毒滅活苗，做為免疫用疫苗；
[0033] (3)免疫產(chǎn)蛋雞，制備高免雞蛋（用步驟I -(2)中的疫苗免疫步驟I -(1)處理 過的高產(chǎn)蛋雞，進(jìn)行H次免疫，首免皮下或肌肉注射l-2ml，2周后二免，注射免疫用疫苗 l-2ml，再隔2周H免，注射免疫用疫苗l-2ml，進(jìn)行免疫程序后收集雞蛋，即為水貂病毒性 腸炎的高免雞蛋，二免后1周開始每隔7天抽樣測定高免雞蛋蛋黃中抗水貂病毒性腸炎病 毒特異抗體效價(jià)，抗體效價(jià)均達(dá)到HI > 2^ W上收集蛋黃，用于制備水貂病毒性腸炎病毒精 制蛋黃抗體）；
[0034] II利用步驟I制備的水貂病毒性腸炎的高免雞蛋制備精制蛋黃抗體
[0035] (1)分離高免雞蛋蛋黃
[0036] 將步驟I制備的高免雞蛋用清水洗凈，再用0. 05 %的百毒殺浸泡3-5min，然后用 紗布擦干，用75%己醇擦一遍瞭干，送入蛋清蛋黃分離機(jī)進(jìn)行蛋黃分離；
[0037] 似巧[J備精制蛋黃抗體
[0038] 將步驟II -(1)所分離的蛋黃加2份醋酸緩沖液，用酸調(diào)PH至4. 8 ;按每毫升稀釋 蛋黃液加11 y L辛酸的比例在室溫?cái)埌柘轮鸬渭尤胄了?，?0min內(nèi)加完，低溫下靜置化， 然后W 1000化/min的轉(zhuǎn)速離也30min，棄沉淀；上清液經(jīng)125]im尼龍篩過濾后，加入1/10 體積的0. Olmol/1的PBS，用堿調(diào)PH至7. 2 ;將40%甲酵溶液與該上清液混合，使甲酵的終 濃度達(dá)到0. 1 % (V/V)，充分?jǐn)埌杈鶆颍?br> [0039] (3)抗體效價(jià)的測定
[0040] 將步驟II -(2)所得濾液最終所得濾液進(jìn)行水貂病毒性腸炎病毒精制蛋黃抗體效 價(jià)測定，在96孔微量反應(yīng)板上進(jìn)行，每孔加25ul生理鹽水；左側(cè)第1孔加25ul蛋黃液，混 合均勻后從第1孔吸25ul至第2孔，依次倍比稀釋至第11孔（第11孔吸棄25ul);每孔 加入25111四個(gè)血凝單位的病毒液，振蕩3〇3，然后371：靜置3〇111111;每孔加入2511110%豬 紅細(xì)胞息液，震蕩15s，4°C靜置20min后觀察結(jié)果。
[00川應(yīng)用實(shí)例
[0042] 本發(fā)明所述抗水貂病毒性腸炎病毒精制蛋黃抗體對(duì)水貂病毒性腸炎疾病的臨床 療效試驗(yàn)
[004引 1、材料與方法
[0044] (1)試驗(yàn)材料
[0045] 利用實(shí)施例2中方法制備得到的水貂病毒性腸炎病毒精制蛋黃抗體，抗體效價(jià)為 HI;2…。
[0046] 毒株水貂病毒性腸炎強(qiáng)毒分離株。
[0047] 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康仔貂30只。
[004引 似試驗(yàn)方法
[0049] 選擇經(jīng)血凝和血凝抑制試驗(yàn)檢測為水貂病毒性腸炎病毒及抗體均為陰性的健康 仔貂30只，隔離飼養(yǎng)觀察一周后，供試驗(yàn)用。
[0050] 將試驗(yàn)貂隨機(jī)分成H組，第一組為空白對(duì)照組（10只），第二組為攻毒對(duì)照組（10 只），第H組為攻毒治療組（10只）。第一組為空白對(duì)照組，不注射任何藥品，隔離飼養(yǎng)；第 二組和第H組每只肌肉注射水貂病毒性腸炎強(qiáng)毒（HA:2 7)2ml。于攻毒后24小時(shí)給第H組 每只皮下注射2ml實(shí)施例1所述水貂病毒性腸炎病毒精制蛋黃抗體（HI效價(jià)；2W)，第二組 皮下注射生理鹽水2ml。觀察貂的發(fā)病和死亡情況至第21天。
[0051] 2、試驗(yàn)結(jié)果與分析
[0052] 抗水貂病毒性腸炎病毒精制蛋黃抗體對(duì)水貂病毒性腸炎疾病的臨床療效試驗(yàn)結(jié) 果，詳見表1。
[0053] 表 1
[0054]

【權(quán)利要求】
1. 一種水貂病毒性腸炎病毒精制蛋黃抗體，其特征在于：所述抗體是由下述方法得到 的： (1) 分離高免雞蛋蛋黃：將水貂病毒性腸炎病毒滅活苗免疫過的高免雞蛋進(jìn)行消毒后 送入蛋清蛋黃分離機(jī)進(jìn)行蛋黃分離； (2) 制備精制蛋黃抗體：向步驟（1)所分離的蛋黃中加入醋酸緩沖液進(jìn)行稀釋，其中， 蛋黃與醋酸緩沖液的體積比為1 :2,用酸調(diào)PH至4. 8 ;按每毫升稀釋蛋黃液加11 y L辛酸的 比例在室溫?cái)嚢柘轮鸬渭尤胄了幔?0min內(nèi)加完，低溫下靜置2h，然后以10000r/min的轉(zhuǎn) 速離心30min，棄沉淀；上清液經(jīng)125 y m尼龍篩過濾后，加入1/10體積的0. Olmol/L的PBS， 用堿調(diào)PH至7. 2 ;將40 %甲醛溶液與該上清液混合，使甲醛的終濃度達(dá)到0. 1 % (V/V)，充 分?jǐn)嚢杈鶆蚣吹谩?br> 2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的水貂病毒性腸炎病毒精制蛋黃抗體，其特征在于：所述抗體 的抗體效價(jià)為HI:21(I。
3. 權(quán)利要求1所述的水貂病毒性腸炎病毒精制蛋黃抗體的制備方法，其特征在于：具 體步驟如下： (1) 分離高免雞蛋蛋黃：將水貂病毒性腸炎病毒滅活苗免疫過的高免雞蛋進(jìn)行消毒后 送入蛋清蛋黃分離機(jī)進(jìn)行蛋黃分離； (2) 制備精制蛋黃抗體：向步驟（1)所分離的蛋黃中加入醋酸緩沖液進(jìn)行稀釋，其中， 蛋黃與醋酸緩沖液的體積比為1 :2,用酸調(diào)PH至4. 8 ;按每毫升稀釋蛋黃液加11 y L辛酸的 比例在室溫?cái)嚢柘轮鸬渭尤胄了幔?0min內(nèi)加完，低溫下靜置2h，然后以10000r/min的轉(zhuǎn) 速離心30min，棄沉淀；上清液經(jīng)125 y m尼龍篩過濾后，加入1/10體積的0. 01mol/L的PBS， 用堿調(diào)PH至7. 2 ;將40%甲醛溶液與該上清液混合，使甲醛的終濃度達(dá)到0. 1 % (V/V)，充 分?jǐn)嚢杈鶆颍? (3) 抗體效價(jià)的測定。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的抗水貂病毒性腸炎病毒精制蛋黃抗體的制備方法，其特征在 于：所述步驟（1)中高免雞蛋采用水貂病毒性腸炎病毒滅活苗免疫具體是指用貓腎傳代細(xì) 胞培養(yǎng)水貂病毒性腸炎病毒，濃縮后作抗原，進(jìn)行甲醛滅活，加入免疫增強(qiáng)劑及白油佐劑， 制備油包水型水貂病毒性腸炎病毒滅活苗，做為免疫用疫苗。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的抗水貂病毒性腸炎病毒精制蛋黃抗體的制備方法，其特征在 于：所述步驟（1)中的消毒方法是對(duì)高免雞蛋用清水沖洗干凈，再用0.05%的百毒殺浸泡 3-5min，然后用紗布擦干，再用75%乙醇擦洗一遍，晾干。
6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的抗水貂病毒性腸炎病毒精制蛋黃抗體的制備方法，其特征在 于：所述步驟（1)中的高免雞蛋是由下述方法得到的： (i )免疫；水貂病毒性腸炎病毒滅活苗免疫健康的高產(chǎn)蛋雞； (ii )利用免疫高產(chǎn)蛋雞得到高免雞蛋。
7. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的抗水貂病毒性腸炎病毒精制蛋黃抗體的制備方法，其特征在 于：所述步驟（i )中用疫苗免疫高產(chǎn)蛋雞的免疫次數(shù)> 2。
8. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的抗水貂病毒性腸炎病毒精制蛋黃抗體的制備方法，其特征在 于：所述步驟（3)抗體效價(jià)的測定是指將步驟（2)最終所得濾液進(jìn)行水貂病毒性腸炎病毒 精制蛋黃抗體效價(jià)測定，在96孔微量反應(yīng)板上進(jìn)行，每孔加25ul生理鹽水；左側(cè)第1孔加 25ul蛋黃液，混合均勻后從第1孔吸25ul至第2孔，依次倍比稀釋至第11孔；每孔加入 25ul四個(gè)血凝單位的病毒液，振蕩30s，然后37°C靜置30min ;每孔加入25ul 10%豬紅細(xì) 胞懸液，震蕩15s，4°C靜置20min后觀察結(jié)果。
【文檔編號(hào)】C07K16/08GK104447985SQ201410817715
【公開日】2015年3月25日 申請(qǐng)日期:2014年12月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月24日
【發(fā)明者】李麗琴, 王建, 張彥龍, 季昆, 王宇鵬, 殷立偉, 王嵩, 于昌貴, 程雪嬌, 余貴菊, 焦曉軍, 甄盼盼, 王猛, 王勇 申請(qǐng)人:天津市中升挑戰(zhàn)生物科技有限公司